Aquí presentamos un método no genético para generar esferoides hepáticos autólogos humanos utilizando células mononucleares aisladas de sangre periférica en estado estacionario.
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Artículo de método
Esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células hepáticas humanas pueden formar una estructura tridimensional (3D) capaz de crecer en cultivo durante algunas semanas, preservando su capacidad funcional. Debido a su naturaleza para agruparse en las placas de cultivo con características adhesivas bajas o nulas, forman agregados de múltiples células hepáticas que se denominan esferoides hepáticos humanos. La formación de esferoides hepáticos 3D se basa en la tendencia natural de las células hepáticas a agregarse en ausencia de un sustrato adhesivo. Estas estructuras 3D poseen mejores respuestas fisiológicas que las células, que están más cerca de un entorno in vivo . El uso de cultivos de hepatocitos 3D tiene numerosas ventajas en comparación con los cultivos bidimensionales clásicos (2D), incluido un microambiente biológicamente más relevante, morfología arquitectónica que reensambla órganos naturales, así como una mejor predicción sobre el estado de la enfermedad y las respuestas in vivo a los medicamentos. Se pueden utilizar varias fuentes para generar esferoides, como tejido hepático primario o líneas celulares inmortalizadas. El tejido hepático 3D también se puede diseñar mediante el uso de células madre embrionarias humanas (hESCs) o células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) para derivar hepatocitos. Hemos obtenido esferoides hepáticos humanos utilizando células madre pluripotentes derivadas de la sangre (BD-PSC) generadas a partir de sangre periférica no manipulada mediante la activación de proteínas ligadas a GPI unidas a la membrana humana y diferenciadas a hepatocitos humanos. Las células hepáticas humanas derivadas de BD-PSCs y los esferoides hepáticos humanos se analizaron mediante microscopía óptica e inmunofenotipado utilizando marcadores de hepatocitos humanos.
Introducción
En los últimos años, los sistemas de cultivo de esferoides tridimensionales (3D) se han convertido en una herramienta importante para estudiar diversas áreas de la investigación del cáncer, el descubrimiento de fármacos y la toxicología. Tales cultivos despiertan gran interés porque cierran la brecha entre las monocapas de cultivo celular bidimensionales (2D) y los órganos complejos1.
En ausencia de una superficie adhesiva, en comparación con el cultivo celular 2D, la formación de esferoides se basa en la afinidad natural de estas células para agruparse en forma 3D. Estas células se organizan en grupos que consisten ....
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Protocolo
Se obtuvo la aprobación ética (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) para realizar estos experimentos y todos los donantes firmaron el consentimiento informado antes de la extracción de sangre de acuerdo con las directrices institucionales.
1. Preparación de células mononucleares (EMN) a partir de sangre periférica humana (PB)
- Extraiga 30 ml de sangre de donantes sanos con la ayuda de personal médico capacitado de acuerdo con el protocolo estándar.
- Aislar PBMNCs utilizando medios de gradiente de densidad según el protocolo publicado por Becker-Kojić et al.13. Aísle, mediante pipe....
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Resultados
Diferenciamos con éxito las BD-PSC humanas en células progenitoras endodermas / hepáticas y hepatocitos mediante la aplicación de un protocolo de dos pasos. Los cambios morfológicos durante el proceso de diferenciación hepática se muestran en la Figura 1. Las BD-PSC se diferencian en hepatocitos que pasan por tres etapas diferentes. La primera etapa representa la diferenciación en células endodérmicas L4, la segunda, la diferenciación a células progenitoras hepáticas (hepatoblastos) L8, exhi.......
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Discusión
El hígado es un órgano importante en el cuerpo humano con muchas funciones biológicas esenciales, como la desintoxicación de metabolitos. Debido a fallas hepáticas graves como cirrosis y / o hepatitis viral, hay casi 2 millones de muertes por año en todo el mundo. Los trasplantes de hígado ocupan el segundo lugar en trasplantes de órganos sólidos en todo el mundo, pero solo alrededor del 10% de la necesidad actual se satisface22.
Los hepatocitos humanos primarios (PHH) .......
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Divulgaciones
La autora correspondiente declara que es titular de una patente relacionada con la nueva proteína humana ligada a GPI. Es cofundadora y trabaja con ACA CELL Biotech GmbH. Los otros autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores están especialmente agradecidos por la asistencia técnica proporcionada por Oksana y John Greenacre. Este trabajo fue apoyado por ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemania.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo de albúmina | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | producido en pollo |
| Fracción V de albúmina | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alfa-1 Fetoproteína | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | conejo policlonal IgG |
| Biolaminina 111 LN | BioLamina | LN111-02 | humano recombinante |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | perlas magnéticas de tamaño nanométrico |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Software de imagen | Olympus | |
| Tubos de centrífuga 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 pocillo | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Detergente disponible en el mercado | Procter & Gamble | detergente no iónico | |
| anticuerpo específico CYP2E1 | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | anticuerpo policlonal de conejo IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | anticuerpo monoclonal de ratón IgG1 |
| Citoqueratina 18 | DakoCitomatación | M7010 | anticuerpo monoclonal de ratón IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Descatalogado. Disponible en: TMS-013-B |
| Cubrecristales 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamina |
| Glutaraldehído 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Anticuerpos anti-ratón IgG Cy3 | en línea | ABIN1673767 | policlonal |
| IgG antiratón en cabra DyLight 488 | Anticuerpos en línea | ABIN1889284 | policlonal |
| IgG anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | medio de maduración de hepatocitos |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | anticuerpo humano recombinante |
| HNF4&alfa; | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clon 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hidrocortisona 21-hemisuccinato (sal de sodio) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific 12660012 | Descontinuado. Disponible en el catálogo No. 10-828-010 | |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | soporte magnético |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific 11140035 | ||
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| Columnas MiniMACS | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multiplatos | Sigma-Aldrich | D6789 | Placas de 4 pocillos |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | humano recombinante |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich 158127 | ||
| PBS estéril | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS Tubos de 15 ml estériles | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-pollo IgG Texas red | Anticuerpos en línea | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 humano | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Anticuerpo de transtiretina | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | producido en pollo |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
Referencias
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal ....
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Reimpresiones y permisos
