In vivo Entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria

Resumen

El presente protocolo describe la inyección intraductal de vectores virales a través de la tetina para administrar genes de interés en las células epiteliales mamarias.

Resumen

Las glándulas mamarias del ratón comprenden árboles ductales, que están revestidos por células epiteliales y tienen una abertura en la punta de cada pezón. Las células epiteliales juegan un papel importante en la función de la glándula mamaria y son el origen de la mayoría de los tumores mamarios. La introducción de genes de interés en células epiteliales mamarias de ratón es un paso crítico en la evaluación de la función génica en las células epiteliales y la generación de modelos de tumores mamarios de ratón. Este objetivo se puede lograr a través de la inyección intraductal de un vector viral que lleva los genes de interés en el árbol ductal mamario del ratón. El virus inyectado posteriormente infecta las células epiteliales mamarias, trayendo los genes de interés. El vector viral puede ser lentiviral, retroviral, adenoviral o viral asociado a adenovirus (AAV). Este estudio demuestra cómo un gen de interés se administra en las células epiteliales mamarias a través de la inyección intraductal mamaria de ratón de un vector viral. Un lentivirus portador de GFP se utiliza para mostrar la expresión estable de un gen entregado, y un retrovirus portador de Erbb2 (HER2/Neu) se utiliza para demostrar lesiones hiperplásicas atípicas inducidas por oncogén y tumores mamarios.

Introducción

Las células epiteliales de las glándulas mamarias juegan un papel importante en la función de estas glándulas y son la principal célula de origen del cáncer de mama. Los estudios de la biología de las glándulas mamarias y la tumorigénesis con frecuencia necesitan la entrega de genes de interés en estas células. Cada glándula mamaria de ratón comprende un árbol ductal revestido por células epiteliales con una sola abertura en la punta del pezón. Esta estructura hace que las células epiteliales mamarias sean fácilmente accesibles para los vectores virales, que pueden ser entregados en la luz de un árbol ductal a través de la inyección intraductal

Protocolo

Todos los procedimientos con ratones se realizaron de acuerdo con el protocolo animal aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Para el presente estudio, se utilizaron ratones hembra FVB / N o MMTV-tva de 9-12 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron comercialmente o de fabricación propia (ver Tabla de materiales). Se utilizaron los virus Lenti-EGFP (FUCGW) y RCAS-Erbb2 (Neu). La preparación del virus y la determinación del título se realizaron siguiendo los informes publicados anteriormente^10,12.

1. Prepa....

Resultados

Aquí se presentan datos representativos para demostrar el éxito de la inyección intraductal, la infección viral exitosa y el impacto de los genes entregados en la tumorigénesis mamaria. La cantidad de virus inyectado debe adaptarse al propósito de cada experimento. Para ilustrar cuán extensamente se puede infectar el árbol del conducto mamario, se debe usar una gran cantidad de genes portadores de virus que se pueden visualizar, como GFP. Por otro lado, para imitar la tumorigénesis espontánea natural, se debe usar una pe.......

Discusión

Este artículo demuestra la técnica de inyección intraductal viral para introducir genes en células epiteliales mamarias de ratón para modelar el cáncer de mama esporádico. Por lo general, se inyectan ratones de al menos 5 semanas o más para que el proceso oncogénico comience después de que se desarrolle la glándula mamaria. Además, la abertura del pezón de ratones menores de 5 semanas de edad es a menudo demasiado pequeña para la inyección. Por otro lado, los pezones de ratones muy viejos a veces se degeneran, y la trans.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-HA	Covance	MMS-101P	Dilución: 1 : 1000
Lágrimas	artificiales Covetrus	NDC 11695-0832-1
Azul de bromofenol	Sigma	B5525	radiación de microondas durante 45 segundos a una potencia alta de 1250W horno de microondas
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Microscopio estereoscópico fluorescente	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Hecho a sí mismo	N/A	Ver referencia # 12
FVB/N	El Laboratorio Jackson	JAX:001800
Aguja Hamilton		Hamilton 91033	autoclave
Jeringa Hamilton		Hamilton 201000	esterilizada en autoclave
	Intertek	3165273
Micro tijera de disección	Roboz	RS-5621	autoclavado
MMTV-tva	Hecho a		Ver referencia # 10
RCAS-Neu (HA)	Hecho a sí mismo	N/A	Ver referencia # 10
Roedor Comboanestésico III	Farmacia Veterinaria	Prescripción veterinaria	37,6 mg/mL de ketamina, 1,92 mg/mL de xilacina y 0,38 mg/mL de acepromazina

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