Este protocolo proporciona una estrategia de combinación de dos hierbas para tratar las células PC12 lesionadas. El protocolo proporciona una referencia para optimizar el mejor modo de aplicación de la medicina tradicional china (MTC).
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Artículo de método
Explorando la estrategia de combinación de dos hierbas para tratar las células PC12 lesionadas
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Resumen
Resumen
En vista de las ventajas de la combinación de la medicina tradicional china (MTC) en el tratamiento de la isquemia cerebral, estudiamos las diferencias en la eficacia y el mecanismo entre la combinación de preparación y la combinación de componentes para explorar la estrategia de combinación de dos hierbas para tratar las células PC12 lesionadas. El cloruro de cobalto (CoCl2) combinado con un medio libre de glucosa se empleó para inducir el daño oxidativo de las células PC12. Luego, se seleccionó la combinación óptima de inyección de Astragalus mongholicus (Ast) y Erigeron breviscapus (Eri) y se combinó siguiendo métodos de diseño uniformes después de evaluar su concentración segura y efectiva en células PC12. Además, la combinación de componentes cribados comprende 10 μM de astragalósido A, 40 μM de escutelarina y 75 μM de ácido clorogénico en dos hierbas. Luego, se utilizaron MTT, anexina V-FITC / PI, inmunofluorescencia y análisis de Western blot para evaluar la eficacia y el mecanismo de la combinación de preparación y la combinación de componentes en células PC12 lesionadas. Los resultados mostraron que la combinación óptima de preparación para la pro-supervivencia celular fue la inyección de Ast y la cápsula de Eri con una concentración de 6:1.8 (μM). La combinación de componentes (10 μM de astragalósido A, 40 μM de escutelarina y 75 μM de ácido clorogénico) fue más efectiva que la combinación de preparación. Ambas combinaciones redujeron notablemente la tasa apoptótica, la intensidad de fluorescencia de la caspasa-3 y el nivel de especies reactivas intracelulares de oxígeno (ROS); mientras tanto, reguló al alza los niveles de expresión de p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax y Nrf2. Estos efectos fueron más evidentes en la combinación de componentes. En conclusión, ambas combinaciones pueden inhibir la lesión inducida por CoCl2 combinado con un medio libre de glucosa en células PC12, promoviendo así la supervivencia celular. Sin embargo, la eficiencia de la combinación de componentes sobre la combinación de preparación puede deberse a su regulación más fuerte de la vía de señalización PI3K / Akt / Nrf2 relacionada con el estrés oxidativo y la apoptosis.
Introducción
La isquemia cerebral crónica, causada por hipoperfusión cerebral, es una enfermedad común en personas de mediana edad y ancianos1. Como una enfermedad de isquemia oculta a largo plazo, puede conducir a una disfunción neurológica progresiva o persistente. Los principales mecanismos patológicos incluyen la apoptosis celular y el daño oxidativo, lo que lleva a una disfunción neurológica progresiva o persistente; esta es la base patológica de la enfermedad de Alzheimer, la demencia vascular y otras enfermedades, y afecta seriamente la calidad de vida de los pacientes. Sin embargo, todavía hay una falta de medicamentos ideales en la medicina moderna....
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Protocolo
1. Preparación del reactivo
- Preparar el medio completo añadiendo 90 ml de medio DMEM con alto contenido de azúcar, 10 ml de suero fetal bovino (FBS) y 1 ml de solución de penicilina-estreptomicina en un matraz de cultivo estéril de 125 ml. Mezclar todo el medio y conservar a 4 °C en condiciones cerradas.
- Preparar la solución de CoCl 2 añadiendo 0,02 g de polvo de CoCl2 (pesado con precisión) en 10 ml de medio sin azúcar DMEM (disuelto completamente) para obtener una solución madre de 8,4 mM. Filtrar la solución con un filtro bacteriano de 0,22 μm, sellarla y almacenarla a 4 °C protegida de la luz.
NOTA: El ....
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Resultados
El cribado de la combinación óptima de Ast inyectable y Eri cápsula se muestra en la Figura 1. La tasa de supervivencia celular de la inyección de Ast y la cápsula de Eri en las células PC12 normales se muestra en la Figura 1A. La viabilidad celular fue inferior al 95% con la inyección de Ast a concentraciones superiores a 12 μM (Figura 1A) y la cápsula de Eri a concentraciones superiores a 5 μM (Figura 1A), lo que indica que la con.......
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Discusión
Todavía hay una falta de fármacos ideales para el tratamiento de la isquemia cerebral en la práctica clínica moderna2. Bajo la guía de suplementar qi y activar el método de circulación sanguínea, Ast, Eri y otras preparaciones se han utilizado en combinación en la práctica clínica de la MTC y han logrado buenas ventajas integrales13,14,15. Un gran número de estudios han demostrado que Ast puede mejorar la.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por proyectos clave de investigación y desarrollo del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2020YFS0325).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cabina de bioseguridad de clase II de la serie 1300 | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, | Inc-Akt | |
| Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | ||
| Citometría de flujo analítica | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Inyección de astrágalo | Heilongjiang Zhenbao Compañía farmacéutica de la isla | A03190612144 | Ast inyección |
| Astragalósido A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| Kit de cuantificación de proteínas BCA | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Incubadoras de dióxido de carbono | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspasa-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Ácido clorogénico | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Hexahidrato de cloruro de cobalto | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfóxido | Guangzhou saiguo biotecnología Compañía | 2020112701 | DMSO |
| Hidrogenofosfato disódico dodecahidratado | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM medio con alto contenido de azúcar | Hyclone termocientífico | 2110050 | |
| DMEM medio sin azúcar | Beijing Solarbio empresa de ciencias de la vida | ||
| Fluido luminoso ECL | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Balanza electrónica | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Instrumento de electroforesis | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Cápsula de Erigeron breviscapus | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Cápsula Eri |
| Suero fetal bovino | de Ingeniería Biológica Four Seasons | 20210402 | |
| FBS Microscopio fluorescente | Corporación Olympms | IX71-F32PH | |
| Generador de imágenes en gel | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics versión 26.0 | International Business Machines Corporation, EE. UU. | - | |
| ImageJ 1.8.0 | Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.- | de | imágenes |
| Immunol fluorescencia kit de tinción | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Lector de microplacas | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | ||
| Microscopio invertido Motic | Nanda Scientific Instruments Co. | ||
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Leche descremada | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 células Academia | China de Ciencias | ||
| Solución de penicilina-estreptomicina | Mezcla termocientífica de Hyclone | SV30010 | |
| Fosfatasa Inhibidor de la proteasa | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Fosfato de dihidrógeno de potasio | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Kit de ensayo de especies de oxígeno reactivo | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| Solución de lisis RI-PA | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE tampón de carga de muestras, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Puntas de filtro estériles (0.22 y micro; m) | Merck Biotechnology, Inc. | ||
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | Tbs |
| Tripsina | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Oscilador de vórtice | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actina | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-IG |
Referencias
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert c....
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