Este protocolo describe un método para monitorear la progresión de los cambios morfológicos a lo largo del tiempo en el útero en un modelo de ratón inducible de cáncer de endometrio utilizando imágenes de ultrasonido con correlación con cambios macroscópicos e histológicos.
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Artículo de método
Evaluación ecográfica no invasiva de la progresión del cáncer de endometrio en la deleción dirigida por Pax8 de los supresores tumorales Arid1a y Pten en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Los cánceres uterinos se pueden estudiar en ratones debido a la facilidad de manejo y manipulación genética en estos modelos. Sin embargo, estos estudios a menudo se limitan a evaluar la patología post mortem en animales sacrificados en múltiples puntos de tiempo en diferentes cohortes, lo que aumenta el número de ratones necesarios para un estudio. Las imágenes de ratones en estudios longitudinales pueden rastrear la progresión de la enfermedad en animales individuales, reduciendo el número de ratones necesarios. Los avances en la tecnología de ultrasonido han permitido la detección de cambios a nivel micrométrico en los tejidos. El ultrasonido se ha utilizado para estudiar la maduración del folículo en los ovarios y el crecimiento del xenoinjerto, pero no se ha aplicado a los cambios morfológicos en el útero del ratón. Este protocolo examina la yuxtaposición de la patología con comparaciones de imágenes in vivo en un modelo de ratón con cáncer de endometrio inducido. Las características observadas por ultrasonido fueron consistentes con el grado de cambio observado por patología macroscópica e histología. Se encontró que el ultrasonido era altamente predictivo de la patología observada, apoyando la incorporación de la ecografía en estudios longitudinales de enfermedades uterinas como el cáncer en ratones.
Introducción
Los ratones siguen siendo uno de los modelos animales más importantes para los trastornos reproductivos 1,2,3. Hay varios modelos de roedores genéticamente modificados o inducidos de cáncer de ovario y útero. Estos estudios generalmente se basan en múltiples cohortes sacrificadas en diferentes puntos de tiempo para capturar tendencias longitudinales en cambios morfológicos y patológicos. Esto impide la capacidad de adquirir datos continuos sobre el desarrollo del cáncer en un ratón individual. Además, sin conocer el estado de progresión de la enfermedad individual en ratones, los estudios de intervención se basan en puntos de tiempo predeterminados y hallazgos promediados de cohortes anteriores en lugar de umbrales individuales para la detección de progresión en un animal específico 4,5. Por lo tanto, los enfoques de imagen que permiten la evaluación longitudinal en animales vivos son necesarios para facilitar los modelos preclínicos para probar nuevos fármacos o compuestos y acelerar la comprensión de la patobiología, al tiempo que aumentan el rigor y la reproducibilidad6.
La ecografía (ecografía) es un método atractivo para la monitorización longitudinal de la progresión del cáncer uterino de ratón porque es relativamente fácil y económico en comparación con otros métodos de imagen, es fácil de realizar y puede tener una resolución notable 6,7. Esta modalidad no invasiva puede capturar características a escala de micras en ratones despiertos o con ratones bajo sedación breve mediante un examen de 5-10 minutos. La microscopía ecográfica ha sido validada como un método para medir el desarrollo del folículo ovárico de ratón 8 y el crecimiento de neoplasia implantada o inducida 9,10,11. La ecografía de alta frecuencia también se ha utilizado para inyecciones intrauterinas percutáneas12 y para observar el cambio uterino de ratas durante el ciclo estral13. La US de alta frecuencia se puede utilizar con ratones sostenidos en plataformas estacionarias especializadas utilizando un sistema de rieles para sostener el transductor / sonda para capturar imágenes de alta resolución con posición y presión estandarizadas; Sin embargo, este equipo no está disponible en todas las instituciones. Los métodos de escaneo de transductores de mano se pueden adoptar con equipos menos dedicados y se pueden usar tanto para diagnósticos clínicos como para aplicaciones de investigación en ratones.
La pregunta sigue siendo si las imágenes estadounidenses con sondas portátiles de alta frecuencia podrían usarse para monitorear el desarrollo del cáncer uterino durante varias semanas. Similar a los intestinos, el útero de roedores es una estructura delgada y de paredes delgadas que es muy móvil dentro del abdomen y es contigua a través de múltiples profundidades de tejido, lo que hace que las imágenes sean más difíciles que con órganos relativamente inmóviles como los riñones. Este estudio buscó establecer la correlación entre los tejidos observados por ultrasonido e histopatología, definir puntos de referencia para localizar el útero de ratón y determinar la viabilidad de la evaluación longitudinal del cáncer de endometrio. Este estudio presenta datos que muestran una correspondencia cualitativa entre la aparición de úteros fotografiados por US y la histopatología, así como imágenes seriadas de ratones durante varias semanas. Estos resultados indican que la ecografía portátil se puede utilizar para monitorear el desarrollo del cáncer de endometrio en ratones, creando así una oportunidad para recopilar datos longitudinales individuales de ratón para estudiar el cáncer uterino sin la necesidad de equipos dedicados.
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Protocolo
Todos los procedimientos y experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins. Para todos los procedimientos, se usó EPP apropiado, incluidos guantes y batas de aislamiento desechables. Se tomaron precauciones al manipular objetos punzantes, que se desecharon adecuadamente en contenedores de objetos punzantes de caja roja inmediatamente después de su uso. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo.
1. Inducción de cáncer de endometrio en ratones iPAD (Pten inducible , Arid1a doble deleción) con doxiciclina
- Mantener 10 ratones transgénicos de doble deleción Pax8-Cre-Arid1a-Pten (iPAD) (Figura 1) sobre un fondo genético mixto (129S, BALB/C, C57BL/6), como se describió anteriormente14.
- Recopile imágenes de ultrasonido de referencia (2D) de los ovarios, el oviducto y el útero de cada ratón antes del tratamiento con doxiciclina.
- Proporcionar exclusivamente dietas de comida de ratón que contengan doxiciclina (hiclato de doxiciclina a 625 mg / kg de alimento) a los ratones iPAD hembra durante un mínimo de 2 semanas a partir de las 7-8 semanas de edad para inducir la eliminación del gen.
2. Configuración del equipo
- Encienda la almohadilla térmica y cúbrala con una almohadilla absorbente limpia (temperatura objetivo: 38 °C).
- Confirme que el vaporizador de isoflurano y el tanque deO2 estén adecuadamente llenos. Rellene y reemplace si el contenido es bajo.
- Conecte la cámara de inducción, el cono nasal y el sistema de barrido al vaporizador.
- Configure la máquina de ultrasonido.
- Seleccione un transductor (sonda) con un rango de 32-56 MHz o hasta 70 MHz para obtener imágenes del útero o el ovario, respectivamente.
- Conecte la sonda y encienda la máquina.
- Después del arranque del sistema, utilice el panel de control para iniciar sesión con las credenciales de usuario y acceder a la pantalla de inicio.
- En la pantalla de inicio, vaya a la pestaña Aplicaciones y seleccione Modo de abdomen del ratón (pequeño).
- Haga clic en Escanear para volver a la pantalla de inicio y espere a que se muestre una imagen en vivo.
- Seleccione B-Mode en las opciones de la barra de herramientas izquierda.
- Haga clic en Más controles para ver herramientas adicionales para el refinamiento de la imagen, como la ganancia y la profundidad de la imagen, o para ajustar la configuración de adquisición de clips, como el número de fotogramas por segundo.
- Una vez que se selecciona la configuración de la imagen, vuelva a la pantalla de inicio haciendo clic en Escanear.
- Encienda el tanque deO2 , dirija el flujo a la cámara de inducción y ajuste el caudal a 1 L / min.
3. Preparación de ratones para el examen de ultrasonido, incluida la depilación
- Coloque un ratón en la cámara de inducción. Ajuste el vaporizador de isoflurano a 2% -3% vol/vol para la inducción de la anestesia.
- Determine la profundidad apropiada de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie y una frecuencia respiratoria de alrededor de 1-2 respiraciones / s.
- Aplique lubricante oftálmico estéril en cada ojo. Retire el pelaje del dorso y el ventro entre la última costilla y la pelvis con cortapelos del tamaño adecuado.
- Aplique una capa delgada de crema depilatoria en las regiones ventral y dorsal para obtener imágenes (si es necesario).
- Coloque el ratón de nuevo en la cámara de inducción durante aproximadamente 3-5 minutos para mantener la profundidad adecuada de la anestesia mientras la crema depilatoria trabaja para eliminar el vello. Después de ≤4 minutos, limpie suavemente la crema con una toalla de papel húmeda y limpia.
NOTA: La exposición prolongada a la crema depilatoria es irritante y puede causar lesiones en la piel.
4. Inyección intraperitoneal de líquido para aumentar el contraste entre órganos
- Caliente una jeringa de 3-10 ml llena de solución fluida isotónica estéril (por ejemplo, solución estéril de NaCl al 0,9% o Ringers lactato) a 35-40 °C colocándola entre una almohadilla térmica y una almohadilla absorbente durante varios minutos. Coloque una botella de gel de ultrasonido en la almohadilla térmica si la máquina no tiene un calentador.
- Para un ratón de 20-25 g, inyecte 1-2 ml de solución en la cavidad peritoneal.
- Asegure el mouse con la espuma en una mano, exponiendo el ventrum.
- Sostenga el ratón en un ángulo de ~ 20 °, con la nariz apuntando al suelo para dirigir los órganos cranealmente debido a la gravedad.
- Con una aguja de calibre pequeño (25 G, 5/8 de longitud, jeringa de tuberculina), punción a través de la piel y la pared abdominal del cuadrante caudal derecho del abdomen.
- Antes de la inyección de líquidos, para evitar la inyección en la vasculatura o el tracto gastrointestinal, tire hacia atrás con una presión mínima. Si entra sangre u otro material en la jeringa, retire la aguja. Use una aguja y una jeringa nuevas, y vuelva a intentarlo en una posición ligeramente diferente.
- Si el ratón se despierta durante las inyecciones, colóquelo de nuevo en la pequeña cámara de inducción para anestesia con 2% -3% vol/vol isoflurano.
5. Imágenes ecográficas desde un enfoque dorsal
- Coloque el ratón en reclinación ventral sobre la almohadilla absorbente sobre una almohadilla térmica (Figura 2A-C).
- Coloque un cono de nariz de roedor de forma segura sobre la nariz y el hocico del ratón. Mantener la profundidad anestésica con isoflurano administrado a través del cono nasal al 1%-2% vol/vol en 100%O2. Aplique lubricante oftálmico estéril, según sea necesario, en cada ojo.
- Controle al ratón para una frecuencia respiratoria regular (1-2/s) y una falta de respuesta de pellizco del dedo del pie para indicar si es necesario ajustar la anestesia.
- Coloque una pequeña cantidad (~0.5-1 ml) de gel de ultrasonido precalentado abaxial (lateral) a la columna vertebral a cada lado del ratón anestesiado, entre la última costilla y la pelvis.
- Ponga una pequeña cantidad de gel en la sonda de ultrasonido.
- Coloque la sonda paralela a las vértebras con la parte frontal de la sonda en el lado craneal. Una marca indicadora está presente en el cabezal de la sonda para indicar la orientación correcta de la sonda. Registre el día, la hora, la identificación del animal, la orientación de la sonda y el lado del animal (derecha, izquierda, dorsal, ventral) para cada nuevo conjunto de imágenes que se recopilen.
- Con un ratón en decúbito ventral (piel dorsal tocando la sonda), escanee lentamente el área en busca del punto de referencia del riñón (Figura 2B y Figura 3). Con el riñón a la vista, tire de la sonda caudal para encontrar el ovario, una estructura ovalada a redonda ligeramente hiperecoica (Figura 4A, B) dentro de una almohadilla de grasa ovárica muy hiperecoica que está bordeada cráneo-ventralmente por el riñón y dorso-lateralmente por la pared abdominal dorsal.
NOTA: La presión caudal y lateral al ovario puede dirigir el ovario más cerca de la pared abdominal y lejos de los asas del intestino. El ovario se coloca anatómicamente contra la pared abdominal dorsal, solo ventral y lateral a los músculos epaxiales y caudal al riñón. - Ajuste la ganancia de señal usando el control deslizante en la parte inferior de la pantalla de control para mejorar el contraste de la imagen.
- Para mejorar la obtención de imágenes del riñón, aplique presión con un dedo en el abdomen contralateral. Varíe la presión y el ángulo de directamente paralelo a la columna vertebral a ~ 20 ° ventral.
- Una vez que el órgano de interés esté a la vista, recopile un video haciendo clic en Guardar clip o Iniciar grabación y luego Detener grabación cuando haya terminado para conservar las imágenes en un número preestablecido de cuadros.
- Guarde fotogramas individuales de una imagen en vivo o de una grabación con el botón Guardar fotograma .
- Para obtener imágenes del útero, tire de la sonda caudalmente hasta que el ovario esté en el aspecto más craneal del campo de visión. Varíe la presión y el ángulo de la sonda hasta que el útero esté a la vista.
- Repita la colección de vídeo y fotogramas para cada órgano de interés.
- Encuentre el útero corriendo longitudinalmente a lo largo de la pared abdominal dorsal con la musculatura lateral de la pierna también a la vista (Figura 4B).
NOTA: El tamaño del útero y el diámetro de la luz pueden variar con la fase de estro y el estado de la enfermedad. - Controle el tejido en busca de movimiento peristáltico para diferenciar los asas intestinales de los cuernos estacionarios uterinos.
6. Recopila imágenes desde un enfoque ventral
- Coloque el ratón en decúbito dorsal y compruebe que la lubricación ocular es suficiente y que el hocico está firmemente en el cono de la nariz (Figura 2A).
- Aplique una pequeña cantidad (~0.5-1 ml) de gel de ultrasonido precalentado en el abdomen ventral y aplique la sonda en la línea media justo craneal del pubis para localizar la vejiga como un punto de referencia hipoecoico (Figura 5).
NOTA: Si la vejiga es demasiado grande y oscurece las imágenes del útero, se puede ejercer una presión suave en la parte inferior del abdomen para extraer la orina. - Tire de la sonda lateral a la vejiga para encontrar los cuernos uterinos. Aplique una ligera presión digital desde uno o ambos lados del ratón para llevar las bocinas al campo de visión. Sostenga la sonda perpendicular al ratón y escanee ambos lados del abdomen para capturar vistas transversales (secciones transversales) de ambos cuernos. Gire la sonda para capturar vistas sagitales.
- Después del ultrasonido, limpie el mouse limpio de gel con una toalla de papel y devuélvalo a su jaula para recuperarse. Los ratones están completamente despiertos en 2-5 minutos. Una vez que esté completamente despierto y ambulatorio, devuelva el ratón a la habitación del animal.
NOTA: Se puede colocar una almohadilla térmica a fuego lento debajo de la jaula para calentar la jaula y recuperarla. - En el punto final experimental o humano, eutanasia al ratón. Lo ideal es sacrificar al ratón en la jaula de la casa para reducir el estrés; Alternativamente, coloque el mouse en una cámara limpia. SuministreCO2 presurizado a una velocidad de desplazamiento del 10% -30% del volumen de la cámara por minuto. Después de aproximadamente 5 minutos sin respiración visible, verifique la muerte por luxación cervical. Proceder con la necropsia abdominal para la recolección del tumor.
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Resultados
Los ratones transgénicos de doble deleción Pax8-Cre-Arid1a-Pten (iPAD) se mantuvieron en un fondo genético mixto (129S, BALB/C, C57BL/6), como se describió anteriormente14. Todos los ratones fueron alimentados con un alimento con doxiciclina durante 2 semanas para inducir Cre recombinasa. En trabajos previos de nuestro grupo, la doxiciclina fue dosificada por sonda14; Sin embargo, en este estudio actual, el método de inducción de alimentación de doxiciclin...
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Discusión
Este protocolo examina la utilidad del ultrasonido para evaluar los cambios morfológicos uterinos en la progresión del adenocarcinoma en el útero en ratones. En este estudio, al seguir longitudinalmente la inducción del cáncer de endometrio en ratones, se encontró que los detalles anatómicos detectados por ultrasonido eran indicadores de patología macroscópica e histológica. Esto abre la puerta para el uso de estudios longitudinales con un número menor de ratones monitoreados por ultrasonido en múltiples puntos de tiempo...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos los fondos del Programa SPORE de Cáncer de Ovario del NCI P50CA228991, el programa de capacitación postdoctoral 5T32OD011089 y la Fundación Richard W. TeLinde, Universidad Johns Hopkins. El proyecto también fue financiado en parte por los subsidios para gastos corrientes a instituciones privadas de educación superior de la Corporación de Promoción y Ayuda Mutua para Escuelas Privadas de Japón.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| fuerte utilizados para el cuidado <> | |||
| roedores (2018, 625 doxiciclina) | Envigio | TD.01306 | Alimento para ratones |
| imágenes de ultrasonido | |||
| 10 mL inyectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | fluido isotónico |
| con respaldo de plástico | Daigger | EF8313 | Almohadillas absorbentes Cámaras |
| de inducción de anestesia | Apparatus | 75-2029 | Cámara de inducción |
| Kit de absorción de anestésico con recipiente absorbente, soporte, tubo y adaptadores | CWE, Inc | 13-20000 | Cono de nariz y tubo |
| Aquasonic Clear Gel de ultrasonido (0,25 litros) | Parker Laboratoies | 08-03 | Gel de ultrasonido |
| BD Plastipak 3 mL Jeringa | BD Biosciences | 309657 | Jeringa |
| F/Air Scavenger Bote de carbón | OMNICON | 80120 | Sistema de barrido para anestesia |
| Isoflurano, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia |
| Agent M1050 Máquina de anestesia móvil sin reinhalación | Scivena Scientific | M1050 | Vaporizador Anestésico |
| MX550S, Transductor de 25-55 MHz, 15mm, Lineal | VisualSonics | MX550S | Transductor de Ultrasonido (Sonda) |
| Nair Hair Aloe & Loción Depilatoria de Lanolina - 9.0 oz | Nair | Crema Depiliadora | |
| Philips Norelco Multigroomer Recortadora Todo en Uno Serie 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Aguja | BD Biosciences | 305125 | Aguja |
| Puralube Oftálmico | Dechra | 17033-211-38 | Gotas Lubricantes para los Ojos Vevo |
| 3100 Imágenes Sistema | VisualSonics | Vevo 3100 | Ecógrafo |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Software de análisis de ultrasonidos |
| Almohadilla térmica de vinilo con cubierta, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Almohadilla térmica |
| Wd Elements 2TB Almacenamiento básico | Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Almacenamiento |
| de datosReactivos y equipos utilizados para inmunohistoquímica | |||
| 10% con formol | Fischer Scientific | SF98-4 | Tampón de fijación tisular |
| Bloqueador y diluyente sin animales, R.T.U. | Laboratorios Vector Inc. | SP5035 | Bloqueador de anticuerpos |
| cargado Super Frost Plus portaobjetos de vidrio | VWR | 4831-703 | portaobjetos de montaje de tejido |
| tampón de citrato | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Tampón de rerival de epítopo (pTEN) |
| Cytoseal – 60 Resina | Thermo Scientific | 8310-4 | para sellado de portaobjetos |
| Vidrio de cubierta de sello de oro | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Hematoxilina modificada | MilliporeSigma | HHS32-1L | Tampón de contratinción |
| Incubadora (doble cámara) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Horno para fundir parafina |
| ImmPACT DAB Sustrato, peroxidasa (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 Sustrato de | desarrollo de señales |
| ImmPRESS HRP Kit de detección de polímeros IgG anti-conejo de cabra, Peroxidasa | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Anticuerpo IHQ Secundario |
| Oster 5712 Vaporizador Digital de Alimentos | Oster | 5712 | Vaporizador de verduras para epítopo Retrival |
| conejo mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Anticuerpo primario IHQ (1:1.000) |
| conejo mAB anti-PTEN | Señalización | 9559 | Anticuerpo IHC primario (1:100) |
| Scotts Sustituto del agua del grifo | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" |
| Buffer Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 Tissue Fixation Cassette | |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Búfer de retrival de epítopo (ARID1a) |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
