Microdisección y microscopía electrónica de barrido de montaje completo Visualización del plexo coroideo del ratón

Resumen

El plexo coroideo (PC), un tejido poco estudiado en neurociencia, desempeña un papel clave en la salud y la enfermedad del sistema nervioso central. Este protocolo describe una técnica de microdisección para aislar el PC y el uso de microscopía electrónica de barrido para obtener una visión global de su estructura celular.

Resumen

El plexo coroideo (PC), una estructura altamente vascularizada que sobresale en los ventrículos del cerebro, es uno de los tejidos menos estudiados en neurociencia. A medida que cada vez está más claro que esta pequeña estructura desempeña un papel crucial en la salud y la enfermedad del sistema nervioso central (SNC), es de suma importancia diseccionar adecuadamente el PC de los ventrículos cerebrales de una manera que permita el procesamiento posterior, que va desde el análisis funcional hasta el estructural. Aquí, se describe el aislamiento del PC del ratón del ventrículo lateral y del cuarto ventrículo cerebral sin la necesidad de herramientas o equipos especializados. Esta técnica de aislamiento preserva la viabilidad, función y estructura de las células dentro del PC. Debido a su alta vascularización, el PC se puede visualizar flotando dentro de las cavidades ventriculares del cerebro utilizando un microscopio binocular. Sin embargo, la perfusión transcárdica requerida para el análisis posterior puede complicar la identificación del tejido CP. Dependiendo de los pasos de procesamiento adicionales (por ejemplo, análisis de ARN y proteínas), esto se puede resolver visualizando el PC a través de la perfusión transcárdica con azul de bromofenol. Después del aislamiento, el PC se puede procesar utilizando varias técnicas, incluyendo ARN, proteína o análisis de células individuales, para obtener una mayor comprensión de la función de esta estructura cerebral especial. Aquí, la microscopía electrónica de barrido (SEM) en CP de montaje completo se utiliza para obtener una visión general de la estructura.

Introducción

Las barreras estrechas separan el sistema nervioso central (SNC) de la periferia, incluida la barrera hematoencefálica (BBB) y la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (LCR). Estas barreras protegen el SNC contra insultos externos y aseguran un microambiente equilibrado y controlado ^1,2,3. Si bien la barrera hematoencefálica se ha estudiado ampliamente a lo largo del tiempo, la barrera sangre-LCR ubicada en el plexo coroideo (PC) solo ha ganado un creciente interés de investigación durante la última década. Esta última barrera se puede encontrar en los cuatro ventrículos del....

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación nacional (Ley belga 14/08/1986 y 22/12/2003, Real Decreto belga 06/04/2010) y europea (Directivas de la UE 2010/63 / UE, 86/609 / CEE). Todos los experimentos en ratones y protocolos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Gante (número de permiso LA1400091 y EC 2017-026).

1. Preparación

1. Anestésicos: Preparar un anestésico terminal. Por ejemplo, se puede preparar una solución de pentobarbital sódico (≥100 mg/kg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. So....

Resultados

El protocolo descrito facilita el aislamiento eficiente de la PC de los ventrículos laterales del cerebro del ratón (Figura 2A-C) y cuarto (Figura 2D-F). Después de aislar todo el cerebro, se utilizan fórceps para hemisectar sagitalmente el cerebro e identificar los CP que flotan en los ventrículos laterales. La PC del cuarto ventrículo se puede aislar del lado cerebeloso del cerebro. La perfusi.......

Discusión

Aquí, se describe un método para aislar el plexo coroideo (PC) fuera del ventrículo lateral y el cuarto ventrículo de un cerebro de ratón. Todo este método de montaje del PC facilita el análisis posterior utilizando un repertorio de técnicas para obtener una visión completa de la morfología del PC, la composición celular, el transcriptoma, el proteoma y el secretoma. Tales análisis son cruciales para obtener una mejor comprensión de esta notable estructura que sobresale de los ventrículos del cerebro. Este conocimiento e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aguja de 26G x 1/2	Henke Sass Wolf 4710004512
Soportes de muestras de aluminio	EM Sciences	75220
Tampón de cacodilato	11652		Cuchillas quirúrgicas de
acero al carbono	Swann-Morton	0210	tamaño: 0,45 mm x 12 mm
Lengüetas adhesivas de carbono -12 mm	EM Sciences	77825-12
Secador de punto crítico	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss	Sistema SEM
	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Glutaraldehído	EM Sciences	16220
Heparina	Sigma-Aldrich	H-3125
Ismatec Reglo ICC Bomba peristáltica digital de 2 canales	Metrohm Belgium N.V	CPA-7800160
Tetróxido de osmio	EM Sciences	19170
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platino	Quórum	Q150T ES	PBS sin Ca++ Mg++ o rojo fenol; estéril filtrado
Pentobarbital sódico	Kela NV	514
Cesta de muestras de acero inoxidable	EM Sciences	70190-01
Stemi DV4 Microscopio estereoscópico	Zeiss
Tijeras quirúrgicas	Fine Science Tools GmbH	91460-11

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