Method Article

Microdisección y microscopía electrónica de barrido de montaje completo Visualización del plexo coroideo del ratón

DOI:

10.3791/64733

⸱

December 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1VIB Center for Inflammation Research, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El plexo coroideo (PC), un tejido poco estudiado en neurociencia, desempeña un papel clave en la salud y la enfermedad del sistema nervioso central. Este protocolo describe una técnica de microdisección para aislar el PC y el uso de microscopía electrónica de barrido para obtener una visión global de su estructura celular.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El plexo coroideo (PC), una estructura altamente vascularizada que sobresale en los ventrículos del cerebro, es uno de los tejidos menos estudiados en neurociencia. A medida que cada vez está más claro que esta pequeña estructura desempeña un papel crucial en la salud y la enfermedad del sistema nervioso central (SNC), es de suma importancia diseccionar adecuadamente el PC de los ventrículos cerebrales de una manera que permita el procesamiento posterior, que va desde el análisis funcional hasta el estructural. Aquí, se describe el aislamiento del PC del ratón del ventrículo lateral y del cuarto ventrículo cerebral sin la necesidad de herramientas o equipos especializados. Esta técnica de aislamiento preserva la viabilidad, función y estructura de las células dentro del PC. Debido a su alta vascularización, el PC se puede visualizar flotando dentro de las cavidades ventriculares del cerebro utilizando un microscopio binocular. Sin embargo, la perfusión transcárdica requerida para el análisis posterior puede complicar la identificación del tejido CP. Dependiendo de los pasos de procesamiento adicionales (por ejemplo, análisis de ARN y proteínas), esto se puede resolver visualizando el PC a través de la perfusión transcárdica con azul de bromofenol. Después del aislamiento, el PC se puede procesar utilizando varias técnicas, incluyendo ARN, proteína o análisis de células individuales, para obtener una mayor comprensión de la función de esta estructura cerebral especial. Aquí, la microscopía electrónica de barrido (SEM) en CP de montaje completo se utiliza para obtener una visión general de la estructura.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las barreras estrechas separan el sistema nervioso central (SNC) de la periferia, incluida la barrera hematoencefálica (BBB) y la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (LCR). Estas barreras protegen el SNC contra insultos externos y aseguran un microambiente equilibrado y controlado 1,2,3. Si bien la barrera hematoencefálica se ha estudiado ampliamente a lo largo del tiempo, la barrera sangre-LCR ubicada en el plexo coroideo (PC) solo ha ganado un creciente interés de investigación durante la última década. Esta última barrera se puede encontrar en los cuatro ventrículos del cerebro (Figura 1A, B) y se caracteriza por una sola capa de células epiteliales del plexo coroideo (CPE) que rodean un estroma central, capilares con fugas, fibroblastos y una población de células linfoides y mieloides (Figura 1C)4,5,6. Las células CPE están firmemente interconectadas por uniones estrechas, evitando así la fuga de los capilares sanguíneos fenestrados subyacentes hacia el LCR y el cerebro. Además, el transporte a través de las células CPE está regulado por una serie de sistemas de transporte hacia adentro y hacia afuera que manejan la afluencia de compuestos beneficiosos (por ejemplo, nutrientes y hormonas) de la sangre al LCR y el flujo de salida de moléculas dañinas (por ejemplo, desechos metabólicos, exceso de neurotransmisores) en la otra dirección 1,6. Para poder ejercer su función de transporte activo, las células CPE contienen numerosas mitocondrias en su citoplasma7. Además, el PC es la principal fuente de LCR y actúa como el guardián del cerebro por la presencia de células inflamatorias residentes1. Debido a su ubicación única entre la sangre y el cerebro, el PC también está perfectamente posicionado para llevar a cabo la vigilancia inmune8.

Diagrama de anatomía del plexo coroideo y del ventrículo; flujo de líquido cefalorraquídeo y estructura celular.
Figura 1: Descripción esquemática de la ubicación y composición del plexo coroideo (PC). El tejido CP (A, B) se encuentra dentro de los dos ventrículos laterales, tercero y cuarto de (A) cerebro humano y (B) de ratón. (C) El tejido CP consiste en una sola capa de células de epitelio CP cuboidal (CPE) estrechamente conectadas que rodean los capilares fenestrados, el tejido conectivo suelto y las células linfoides y mieloides, y forma la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (adaptada y modificada de la referencia23). Figura creada con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Durante la última década, la creciente evidencia, incluyendo varios informes de nuestro grupo de investigación, han revelado que la PC juega un papel central en la salud y la enfermedad 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por ejemplo, se sabe que la barrera sangre-LCR envejecida presenta alteraciones morfológicas en, entre otros, los núcleos, las microvellosidades y la membrana basal 1,19. Además, en el contexto de la enfermedad de Alzheimer, la integridad general de la barrera se ve comprometida y todos estos cambios relacionados con la edad parecen ser aún más pronunciados 1,8,20. Además de los cambios morfológicos, el transcriptoma, el proteoma y el secretoma del PC se alteran durante la enfermedad 12,21,22,23. Por lo tanto, el conocimiento avanzado de la PC es esencial para comprender mejor su papel en las enfermedades neurológicas y potencialmente desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.

Un método eficiente para la microdisección precisa de la PC fuera de los ventrículos cerebrales es el primer paso invaluable para permitir la investigación adecuada de esta pequeña estructura cerebral. Debido a su naturaleza altamente vascularizada (Figura 2B), el PC que flota dentro de las cavidades ventriculares del cerebro se puede identificar utilizando un microscopio binocular. Sin embargo, a menudo se requiere perfusión transcárdica para el análisis posterior, lo que complica la identificación y el aislamiento adecuados del tejido CP (Figura 2C). Si los pasos de procesamiento adicionales lo permiten (por ejemplo, en el caso del análisis de ARN y proteínas), el PC se puede visualizar mediante perfusión transcárdica con azul de bromofenol (Figura 2A). Varias publicaciones ya describen el aislamiento del PC de cerebros de ratas24 y crías de ratón25. Aquí, se describe una técnica de aislamiento de microdisección para aislar el PC de ratones adultos. Es importante destacar que esta técnica de aislamiento preserva la viabilidad, función y estructura de las células dentro del PC. Aquí se describe el aislamiento del PC flotando en el cuarto ventrículo y lateral. En resumen, los ratones son anestesiados terminalmente y, si es necesario, perfundidos transcárdicamente. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la perfusión puede dañar la estructura de las células dentro de la PC. En consecuencia, si la muestra se va a analizar utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBF-SEM) o SEM de haz de iones enfocado (FIB-SEM), no se debe realizar perfusión. A continuación, se aísla todo el cerebro y se utilizan fórceps para hemisectar sagitalmente el cerebro. A partir de aquí, los PC que flotan en los ventrículos laterales se pueden identificar y diseccionar, mientras que el PC del cuarto ventrículo se puede aislar del lado cerebeloso del cerebro.

Efectos de perfusión en los ventrículos cerebrales de ratón; azul de bromofenol, sin perfusión, PBS/heparina; diagrama.
Figura 2: Visualización del plexo coroideo (PC) del ventrículo lateral (A-C) y (D-F) después de la perfusión (A,D) de azul de bromofenol, (B,E) sin perfusión y (C,F) con PBS/heparina. Las imágenes se toman con un microscopio estéreo (aumento de 8x-32x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una vez que el PC se disecciona adecuadamente de los ventrículos cerebrales, se puede aplicar todo un repertorio de técnicas para obtener una mayor comprensión de la función de esta estructura. Por ejemplo, la citometría de flujo o la secuenciación de ARN unicelular pueden realizarse para cuantificar y analizar fenotípicamente las células inflamatorias infiltrantes bajo ciertas condiciones de enfermedad26,27. Además de la composición celular, la composición molecular del PC puede analizarse para evaluar la presencia de citoquinas y quimiocinas mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoblot o mediante análisis simultáneo de múltiples citoquinas utilizando la matriz de perlas de citoquinas28. Además, se pueden realizar análisis de transcriptoma, vascular, histología de células inmunes y secretoma en los explantes de CP microdisecados29. Aquí, la microscopía electrónica de barrido (SEM) en CP de montaje completo se utiliza para obtener una visión general de la estructura CP. SEM utiliza un haz de electrones enfocados para escanear sobre la superficie y crear una imagen de la topografía y composición de la superficie. Dado que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de la luz, la resolución de SEM está en el rango nanométrico y es superior a la de un microscopio óptico. En consecuencia, los estudios morfológicos a nivel subcelular se pueden realizar a través de SEM. Brevemente, el CP disecado se transfiere inmediatamente a un fijador que contiene glutaraldehído para una fijación durante la noche, seguida de osmicación y tinción de acetato de uranilo. Luego, las muestras se tratan con tinción de aspartato de plomo, se deshidratan y, en última instancia, se incrustan para obtener imágenes.

Por lo tanto, este protocolo facilita el aislamiento eficiente de la PC de los ventrículos cerebrales del ratón, que se pueden analizar más a fondo utilizando una variedad de técnicas posteriores para investigar su estructura y función.

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Protocol

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Todos los experimentos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación nacional (Ley belga 14/08/1986 y 22/12/2003, Real Decreto belga 06/04/2010) y europea (Directivas de la UE 2010/63 / UE, 86/609 / CEE). Todos los experimentos en ratones y protocolos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Gante (número de permiso LA1400091 y EC 2017-026).

1. Preparación

  1. Anestésicos: Preparar un anestésico terminal. Por ejemplo, se puede preparar una solución de pentobarbital sódico (≥100 mg/kg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Solución de perfusión transcárdica: Preparar 10 ml (por ratón) de PBS/heparina (que contiene 0,2% de heparina) solución suplementada con azul de bromofenol al 0,5%.
    NOTA: Si los pasos de procesamiento posteriores lo permiten (por ejemplo, en el caso del análisis de ARN y proteínas), el plexo coroideo (CP) se puede visualizar a través de la perfusión transcárdica con azul de bromofenol. Si el azul de bromofenol no es compatible con los pasos de procesamiento adicionales (por ejemplo, para imágenes), use PBS/heparina para perfundir.
  3. Preparar las soluciones necesarias para el análisis SEM.
    1. Preparar tampón de Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4). Preparar una solución de paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2,5% en tampón Na-cacodilato 0,1 M. Hacer 20 ml de esta solución por muestra.
    2. Preparar tetróxido de osmio al 2% en tampón de Na-cacodilato 0,1 M (5 ml por muestra).
    3. Prepare soluciones de EtOH al 50%, 70%, 85% y 100%. Preparar 5 ml de cada solución de EtOH por muestra.

2. Microdisección del plexo coroideo fuera del ventrículo lateral y cuarto ventrículo

NOTA: En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL / 6 de 9 semanas de edad. Sin embargo, la técnica de aislamiento descrita es independiente de la cepa, el sexo y la edad del ratón adulto.

  1. Aislar el cerebro del ratón.
    1. Inyectar por vía intraperitoneal una dosis letal de un barbitúrico de acción corta (>100 mg/kg, preparado en el paso 1.1) utilizando una aguja de 26G para anestesiar terminalmente al ratón. Compruebe el reflejo del pie del ratón pellizcando su pata trasera con fórceps.
    2. Cuando no haya reflejo del pie, coloque al animal anestesiado terminalmente en la posición de decúbito dorsal y fije el ratón fijando las extremidades en una placa.
      NOTA: Si no se necesita perfusión transcárdica de los ratones, dependiendo del método de análisis posterior (por ejemplo, para imágenes SEM), continúe con el paso 2.1.7. Sin embargo, si se necesita perfusión para eliminar las células sanguíneas u otros componentes de la sangre, el PC se puede visualizar como una estructura azul que flota en los ventrículos cerebrales a través de la perfusión con azul de bromofenol.
    3. Desinfecte el pecho rociando etanol al 70%. Coloque una cortina estéril alrededor del área quirúrgica. Haga una incisión de ~4 cm justo debajo del diafragma con una cuchilla quirúrgica de acero al carbono (consulte la Tabla de materiales).
    4. Abra la piel y exponga el pecho con tijeras quirúrgicas. Corte el diafragma completamente abierto.
    5. Separe el tórax para exponer los pulmones y el corazón latiendo.
    6. Perfundir transcárdicamente a los ratones con 10 ml de la solución de perfusión a una velocidad de 4,5 ml / min, utilizando una bomba de perfusión (ver Tabla de materiales). La perfusión tomará ~2 min. Inserte una aguja de 26G en el ventrículo izquierdo para bombear la solución al circuito sistémico. Además, haga un corte con tijeras quirúrgicas en la aurícula derecha para que la sangre pueda salir de la circulación.
      NOTA: Se prefiere una bomba de perfusión a la administración manual del fluido, ya que suministrará los fluidos a una velocidad programada con precisión y asegurará que las fuerzas de cizallamiento causadas por la perfusión no sean demasiado fuertes. Las fuerzas de cizallamiento excesivas comprometerán la viabilidad y la estructura de las células dentro de la PC. Además, la tasa de flujo de perfusión recomendada aquí es óptima para perfundir ratones adultos a partir de las 7 semanas. Si se utilizan ratones más jóvenes, se debe utilizar un caudal más bajo. También es importante eliminar la sangre que sale de la aurícula derecha para preservar un sitio quirúrgico limpio.
    7. Decapitar al ratón.
      NOTA: Tenga cuidado de cortar la cabeza lo más bajo posible hasta el hombro para preservar la estructura cerebral. Si el corte es demasiado alto, el cerebelo puede dañarse.
    8. Después de la decapitación, abra el cuero cabelludo haciendo una incisión desde entre las orejas hasta la parte superior de los ojos. Tire de la piel lateralmente para exponer el cráneo. Luego, abra el cráneo siguiendo las suturas escamosas, hacia la parte nasal.
      NOTA: Es importante extraer suavemente el cráneo para mantener la integridad del cerebro.
    9. Coloque el cerebro en una placa de Petri helada y agregue 1 ml de PBS 1x helado en el tejido cerebral.
      NOTA: No es necesario recubrir el plato.
  2. Aislar la PC que flota en el cuarto ventrículo.
    1. Corte suavemente el cerebelo del cerebro con un bisturí. El cerebro es la parte más grande del cerebro, mientras que el cerebelo es una parte mucho más pequeña en la parte posterior del cerebro. Si es necesario, retire las partes restantes del tejido del tronco encefálico del cerebelo.
    2. Gire el cerebro para que la línea de corte quede hacia arriba. Asegúrese de que la cuarta cavidad del ventrículo ahora sea visible en el centro de la sección, con el PC flotando en el sitio dorsal. Si es necesario, abra un poco el ventrículo abriendo el tejido conectivo con pinzas afiladas. De esta manera, el PC será más visible y más fácil de alcanzar.
    3. Arranca suavemente la PC de la pared del ventrículo con fórceps diminutos y afilados.
      NOTA Es importante tocar y extraer el CP en este paso para no contaminar la muestra con el tejido circundante. La apertura de los ventrículos como se describe en el paso 2.2.2 facilitará el paso 2.2.3.
  3. Aísle la PC que sobresale del ventrículo lateral.
    1. Use fórceps diminutos y afilados para cortar sagitalmente el cerebro en dos hemisferios.
    2. Gire el cerebro para que la línea de corte quede hacia arriba. Para revelar el ventrículo lateral, retire suavemente la corteza del tálamo.
    3. Retraiga el hipocampo hasta la línea de corte sagital media. El ventrículo lateral ahora es visible con el PC en la parte inferior del ventrículo. Si es necesario, abra un poco el ventrículo abriendo el tejido conectivo con pinzas afiladas. De esta manera, el PC será más visible y más fácil de alcanzar.
    4. Use fórceps diminutas y afiladas para arrancar suavemente la PC de la pared del ventrículo.
      NOTA: Es importante tocar y extraer el PC en este paso para no contaminar la muestra con el tejido circundante. La apertura de los ventrículos como se describe en el paso 2.3.4 facilitará el paso 2.3.5. Tenga las precauciones necesarias en este paso para preservar la estructura del PC tanto como sea posible. Es más fácil comenzar a tirar del CP en la dirección rostral a caudal.

3. Análisis morfológico del tejido CP mediante microscopía electrónica de barrido (SEM)

PRECAUCIÓN: Las soluciones tóxicas se utilizan en los siguientes pasos de procesamiento. Se recomienda realizar la preparación de la muestra en una campana extractora.

  1. Realice la preparación de muestras para SEM como se describe a continuación.
    1. Transfiera el CP aislado fresco a una solución de fijación recién hecha que contenga paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2,5% en tampón de Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4). Incubar durante la noche a 4 °C.
      NOTA: Como el tejido CP es muy frágil y delgado, el tejido debe colocarse en pequeñas cestas de muestras (consulte la Tabla de materiales) para transferirlo entre tampones. De esta manera, la estructura del tejido se conservará mejor. Se utiliza un fijador a base de cacodilato sobre uno basado en PBS, ya que el tampón de cacodilato fuerte puede contrarrestar el bajo pH del glutaraldehído en el fijador EM.
    2. Lavar la muestra 3 veces durante 5 minutos cada una con 3-5 ml de tampón de Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4).
    3. Fijar las muestras en 3-5 mL de tetróxido de osmio al 2% en tampón de Na-cacodilato 0,1 M durante 30 min. Lave las muestras 3 veces durante 5 minutos cada una con 3-5 ml de agua ultrapura.
    4. Deshidratar las muestras en una serie de soluciones heladas de concentraciones crecientes de EtOH (50%, 70%, 85%, 100%), durante 15 min por solución de EtOH. Utilice un secador de punto crítico para secar correctamente la muestra.
      NOTA El cambio de fase líquida a gaseosa afecta la tensión superficial, causando daños a la estructura de la superficie. El paso de secado del punto crítico permite la preservación de la estructura de la superficie.
    5. Coloque la muestra cuidadosamente en un soporte de muestra provisto de una etiqueta adhesiva de carbono (consulte la Tabla de materiales).
    6. Cubra las muestras con una capa delgada (2-5 nm) de platino. Para ello, monte una fuente de platino en un sistema de vacío entre dos terminales eléctricos de alta corriente y caliente el platino a su temperatura de evaporación. Una fina corriente de platino se deposita en la muestra.
      Nota : un protocolo más detallado para este paso se proporciona en la referencia30. Además del platino, también se puede usar oro u oro/paladio.
  2. Visualice las muestras de CP con SEM (consulte la Tabla de materiales). El procedimiento de visualización del tejido CP a través de SEM es similar al de otros tipos de tejidos y depende del software y los instrumentos utilizados. Un protocolo SEM paso a paso con un video adjunto está disponible en la referencia31 o referencia30.

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Results

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El protocolo descrito facilita el aislamiento eficiente de la PC de los ventrículos laterales del cerebro del ratón (Figura 2A-C) y cuarto (Figura 2D-F). Después de aislar todo el cerebro, se utilizan fórceps para hemisectar sagitalmente el cerebro e identificar los CP que flotan en los ventrículos laterales. La PC del cuarto ventrículo se puede aislar del lado cerebeloso del cerebro. La perfusi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, se describe un método para aislar el plexo coroideo (PC) fuera del ventrículo lateral y el cuarto ventrículo de un cerebro de ratón. Todo este método de montaje del PC facilita el análisis posterior utilizando un repertorio de técnicas para obtener una visión completa de la morfología del PC, la composición celular, el transcriptoma, el proteoma y el secretoma. Tales análisis son cruciales para obtener una mejor comprensión de esta notable estructura que sobresale de los ventrículos del cerebro. Este conocimiento e...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Belga para la Investigación del Alzheimer (SAO; número de proyecto: 20200032), la Fundación de Investigación de Flandes (FWO Vlaanderen; números de proyecto: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) y el Fondo Baillet Latour. Agradecemos al VIB BioImaging Core por la capacitación, el apoyo y el acceso al parque de instrumentos.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aguja de 26G x 1/2Henke Sass Wolf 4710004512
Soportes de muestras de aluminioEM Sciences75220
Tampón de cacodilato11652Cuchillas quirúrgicas de
acero al carbonoSwann-Morton0210tamaño: 0,45 mm x 12 mm
Lengüetas adhesivas de carbono -12 mmEM Sciences77825-12
Secador de punto crítico Bal-Tec CPD030
Crossbeam 540ZeissSistema SEM
Fine Science Tools GmbH 91197-00
GlutaraldehídoEM Sciences16220
HeparinaSigma-AldrichH-3125
Ismatec Reglo ICC Bomba peristáltica digital de 2 canalesMetrohm Belgium N.VCPA-7800160
Tetróxido de osmio EM Sciences19170
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)LonzaBE17-516F
Platino Quórum Q150T ESPBS sin Ca++ Mg++ o rojo fenol; estéril filtrado
Pentobarbital sódicoKela NV514
Cesta de muestras de acero inoxidableEM Sciences70190-01
Stemi DV4 Microscopio estereoscópicoZeiss
Tijeras quirúrgicasFine Science Tools GmbH 91460-11
EM Sciences Pinzas

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), Springer-Verlag. 497-511 (2009).
  3. Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation. Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
  6. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).
  7. Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
  8. Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430(2020).
  9. Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders. Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).
  10. Brkic, M., et al. Amyloid βoligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases. Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).
  11. Vandenbroucke, R. E., et al. Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases. Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).
  12. Marques, F., et al. The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus. BMC Neuroscience. 10, 135(2009).
  13. Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
  14. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
  15. Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans. Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).
  16. Lehtinen, M. K., et al. The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy. Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).
  17. Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier. Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).
  18. Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders. Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).
  19. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).
  20. Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).
  21. Marques, F., et al. Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation. Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).
  22. Thouvenot, E., et al. The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells. Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).
  23. Vandendriessche, C., et al. Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143(2021).
  24. Bowyer, J. F., et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. Journal of Visualized Experiments. (69), e4285(2012).
  25. Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52991(2015).
  26. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
  27. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  28. Van Hoecke, L., et al. Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type. C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482(2021).
  29. Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
  30. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (150), e59480(2019).
  31. JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM). JoVE Science Education Database. , https://www.jove.com/v/5656/scanning-electron-microscopy-sem (2022).
  32. Pauwels, M., et al. Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics). Biomaterials. 290, 121830(2022).

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