Summary
تقدم هذه المقالة طريقتين تعتمدان على التهجين الفلوري في الموقع لتحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة والمطعمة من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X.
Abstract
يتعامل ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم مع القضايا المتعلقة بالخصوبة. قد يكون انخفاض الخصوبة ، أو حتى العقم ، بسبب العديد من الأسباب المختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات الوراثية ، والتي تعد تشوهات الكروموسومات هي الأكثر شيوعا. التهجين الفلوري في الموقع (FISH) هو طريقة معروفة ومستخدمة بشكل متكرر للكشف عن انحرافات الكروموسومات في البشر. يستخدم FISH بشكل رئيسي لتحليل تشوهات الكروموسومات في الحيوانات المنوية للذكور مع انحرافات الكروموسومات العددية أو الهيكلية. علاوة على ذلك ، يتم تطبيق هذه التقنية بشكل متكرر على الإناث للكشف عن انحرافات كروموسومات X المعروفة بأنها تسبب خلل تكوين المبيض. ومع ذلك ، لا تزال المعلومات حول محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومية X في الخلايا الليمفاوية و / أو الخلايا الشدقية غير متوفرة.
الهدف من هذه الدراسة هو تطوير الأبحاث الأساسية المتعلقة بانحرافات كروموسومات X في الإناث ، من خلال تقديم طريقتين تعتمدان على FISH لتحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض. أولا ، يتم وصف طريقة لتحديد محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض المعزولة (البويضات والخلايا الحبيبية والخلايا اللحمية) في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X. الطريقة الثانية موجهة إلى تقييم تأثير انحرافات الكروموسومات على تكوين الجريبات من خلال تحديد محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض من الجريبات الثانوية والغارية المشكلة حديثا في أنسجة المبيض ، من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومية X بعد التطعيم طويل الأمد في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. يمكن أن تكون كلتا الطريقتين مفيدتين في الأبحاث المستقبلية لاكتساب نظرة ثاقبة على القدرة الإنجابية للإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X.
Introduction
العقم هو مشكلة صحية في الجهاز التناسلي الذكري أو الأنثوي ، ويؤثر على ما يقرب من 186 مليون فرد في سن الإنجابفي جميع أنحاء العالم 1. في ما لا يقل عن 35 ٪ من الأزواج المصابين بالعقم ، يحدث العقم بسبب اضطراب في الجهاز التناسلي للأنثى2. هناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسبب العقم عند النساء ، مثل العوامل الوراثية ، وتشوهات الجهاز التناسلي ، وضعف الغدد الصماء ، والأمراض الالتهابية ، والعلاج علاجي المنشأ3.
توجد تشوهات وراثية في حوالي 10٪ من الإناث المصابات بالعقم 4,5. من بين جميع التشوهات الوراثية ، تعد انحرافات كروموسوم X السبب الأكثر شيوعا لخلل تكوين المبيض2. أفادت العديد من الدراسات أن انحرافات كروموسومات X لدى الإناث المصابات بمتلازمة تيرنر (TS) أو متلازمة ثلاثية إكس ترتبط بفشل المبيض المبكر بسبب الفقدان المتسارع للخلايا الجرثومية أو ضعف تكوين البويضة6،7،8.
يمكن تقسيم انحرافات كروموسوم X إلى: 1) انحرافات عددية ، حيث يختلف عدد الكروموسومات X ولكن الكروموسومات X سليمة. و 2) الانحرافات الهيكلية ، حيث اكتسب كروموسوم X أو فقد المادة الوراثية 3,9. الانحرافات العددية للكروموسوم X أكثر شيوعا من التشوهات الهيكلية وغالبا ما تكون ناجمة عن أخطاء تلقائية أثناء انقسام الخلايا 3,9. عندما يحدث مثل هذا الخطأ أثناء الانقسام الميوزي، فقد يؤدي إلى نشوء جاميتات اختلال الصيغة الصبغية، وفي النهاية إلى نسل به انحرافات كروموسومية في جميع الخلايا. عندما تنشأ عيوب الكروموسوم في الخلايا الجسدية نتيجة للأخطاء التي تحدث أثناء الانقسام في المراحل المبكرة من التولد ، فقد يؤدي ذلك إلى الفسيفساء. في هؤلاء الأفراد ، توجد كل من الخلايا ذات المحتوى الكروموسومي X الطبيعي والخلايا ذات الانحرافات الكروموسومية X.
في ثمانينيات القرن العشرين ، تم تطوير تقنية وراثية خلوية تسمى التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لتصور وتحديد تسلسلات الحمض النووي المحددة على الطور الطوري والطور البينيالكروموسومات 10،11. تستخدم هذه التقنية مجسات الحمض النووي الموسومة بالفلورسنت للارتباط بتسلسل معين في الكروموسوم ، والذي يمكن تصوره بعد ذلك باستخدام مجهر مضان.
في الوقت الحاضر ، يستخدم FISH على نطاق واسع كأداة تشخيصية سريرية ويعتبر المعيار الذهبي في الكشف عن انحرافات الكروموسومات10. في مجال الطب التناسلي ، تم استخدام تحليل FISH على الحيوانات المنوية لاكتساب نظرة ثاقبة على محتوى الكروموسومات X للحيوانات المنوية في الذكور مع انحرافات كروموسومية عددية أو هيكلية في الخلايا الجسدية12،13،14. أظهرت هذه الدراسات أن الذكور الذين يعانون من انحرافات كروموسومية كانوا أكثر عرضة لتكرار أعلى من الحيوانات المنوية اختلال الصيغة الصبغية الموجودة في السائل المنوي مقارنة بالذكور الذين لديهم أنماط نووية طبيعية12،13،14.
على عكس الحيوانات المنوية ، لا يعرف سوى القليل جدا عن المحتوى الكروموسومي X لخلايا المبيض (بما في ذلك البويضات والخلايا الحبيبية / الثيكا والخلايا اللحمية) لدى الأفراد الذين يعانون من انحراف كروموسومي ، وكذلك العواقب المحتملة لاختلال الصيغة الصبغية لهذه الخلايا على إمكاناتها الإنجابية. أحد الأسباب المهمة لندرة المعلومات حول النمط النووي لخلايا المبيض مقارنة بالحيوانات المنوية هو حقيقة أن النساء يجب أن يخضعن لإجراء جراحي مثل ثقب الجريب أو الجراحة للحصول على البويضات أو أنسجة قشرة المبيض. لذلك ، يصعب الحصول على الأمشاج الأنثوية لأغراض البحث.
حاليا ، يتم إجراء دراسة تدخل قائمة على الملاحظة في هولندا لاستكشاف فعالية حفظ أنسجة المبيض بالتبريد لدى الإناث الشابات المصابات ب TS15. كان جزء واحد من نسيج قشرة المبيض للمريض متاحا لتحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض16,17. كجزء من الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة تعتمد على FISH لأنسجة قشرة المبيض المنفصلة لتحديد ما إذا كانت الانحرافات الكروموسومية موجودة في خلايا المبيض في الإناث اللائي يحملن انحرافا كروموسوميا في الخلايا الجسدية غير المبيضية ، مثل الخلايا الليمفاوية أو الخلايا الشدقية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد تأثير اختلال الصيغة الصبغية في خلايا المبيض على تكوين الجريبات أيضا. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تعديل بروتوكول FISH المعمول به والذي يمكن من تحليل الأقسام النسيجية لأنسجة قشرة المبيض بعد تكوين الجريبات المستحث بشكل مصطنع أثناء زراعة الأجانب على المدى الطويل في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. في هذه الدراسة ، نقدم طريقتين تعتمدان على FISH لتحديد محتوى الكروموسومات X في خلايا المبيض في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة والمطعمة في الإناث المصابات بانحرافات كروموسوم X ، بهدف تحسين العلوم الأساسية حول هذا الموضوع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول دراسة TurnerFertility من قبل اللجنة المركزية للبحوث التي تشمل البشر (NL57738.000.16). في هذه الدراسة ، تم الحصول على أنسجة قشرة المبيض ل 93 أنثى مصابة ب TS. المواد التي تتطلب احتياطات السلامة مدرجة في الجدول 1.
الجدول 1: احتياطات السلامة.
| مادي | خطر | ||
| حمض الخليك | حروق جلدية شديدة وتهيج في الجهاز التنفسي | ||
| كولاجيناز | تهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد | ||
| دابي | تهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد | ||
| دناز I | تهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد | ||
| ايثانول | شديد الاشتعال | ||
| فورمالدهيد | سامة بعد الاستنشاق والابتلاع وملامسة الجلد | ||
| فورماميد (في مجسات مضانة) |
قد يضر الطفل الذي لم يولد بعد | ||
| ليبراز | تهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد | ||
| ميثانول | شديدة الاشتعال وسامة عن طريق الاستنشاق والابتلاع وملامسة الجلد | ||
| نونيديت P40 | تهيج الجلد أو العينين | ||
| البيبسين | تهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد | ||
| بروتيناز ك | صعوبات في التنفس بعد الاستنشاق | ||
| زيلين | شديدة الاشتعال ، سامة بعد الاستنشاق وملامسة الجلد. تجنب ملامسة العينين. | ||
الجدول 1: المواد التي تتطلب احتياطات السلامة.
1. FISH على خلايا قشرة المبيض الفردية المعزولة
- تفكك أنسجة قشرة المبيض للحصول على خلايا فردية
- قطع أنسجة قشرة المبيض المحفوظة بالتبريد / المذابة إلى قطع صغيرة تبلغ حوالي 1 مم × 1 مم × 1 مم باستخدام مشرط.
- هضم شظايا الأنسجة إنزيميا في 4 مل من وسط L15 المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) الذي يحتوي على مزيج إنزيم تفكك الأنسجة 0.1 مجم / مل ، و 10 ميكروغرام / مل DNase I ، و 1 مجم / مل كولاجيناز I من C. histolyticum لمدة أقصاها 75 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ماصة مزيج الهضم صعودا وهبوطا كل 15 دقيقة.
- أوقف الهضم الأنزيمي بإضافة 4 مل من L15 البارد المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS). اغسل الأنسجة المنفصلة مرة واحدة باستخدام 8 مل من وسط L15 البارد عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من وسط L15 دون دوامة لتجنب تلف الخلايا.
- انقل معلق الخلية الذي يحتوي إلى حد كبير على خلايا انسجة فردية وبصيلات صغيرة (بويضات محاطة بطبقة واحدة من الخلايا الحبيبية) إلى طبق بتري بلاستيكي وافحص تعليق الخلية تحت مجهر مجسم (تكبير 100x).
- التقط البصيلات الصغيرة (<50 ميكرومتر) يدويا باستخدام ماصة بلاستيكية 75 ميكرومتر وانقل البصيلات إلى قطرة من وسط L15 مع 10٪ FBS عند 4 درجات مئوية لمنع تجمع البصيلات. قم بإجراء التقاط الجريب لمدة أقصاها 30 دقيقة. لتحسين انتشار الخلايا المسامية قبل تحليل FISH ، انقل البصيلات المنقاة إلى محلول يحتوي على 0.06٪ تربسين ، 1 مجم / مل من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، و 1 مجم / مل من الجلوكوز واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- الحصول على خلايا انسجة المبيض من تعليق خلايا القشرة باستخدام ماصة بلاستيكية 75 ميكرومتر ، مع الحرص بشكل خاص على تجنب التلوث ببصيلات صغيرة.
- تحليل FISH لخلية المبيض الفردية
- نقل جريبات المبيض المعالجة (موصى بها n = 5-20) مع التربسين / EDTA / الجلوكوز أو الخلايا اللحمية (n > 1000) إلى قطرات من 5 ميكرولتر من 0.15 mM KCl / 15 μL من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) على شريحة واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- قم بتجفيف الشرائح وتثبيتها مسبقا في 300 ميكرولتر من 0.05 مللي مول KCl / 7.5٪ حمض الخليك / 22.5٪ ميثانول لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتغطية الشرائح بالميثانول / حمض الأسيتيك (3: 1) لمدة دقيقتين في RT لإنهاء التثبيت.
- اصنع 20 ضعفا من سترات الصوديوم القياسية (SSC) بإضافة 876 جم من كلوريد الصوديوم و 441 جم من ثنائي هيدرات سترات الصوديوم ثلاثي الصوديوم في 5 لتر من الماء المقطر. بعد ذلك ، أضف 100 مل من 20x SSC إلى 900 مل من الماء منزوع المعادن (ديمي) للحصول على 2x SSC. اغسل العينة في 2x SSC عند 73 درجة مئوية ، وقم بتغطيتها ب 100 ميكرولتر من 2٪ بروتيناز K ، وأغلقها بغطاء غطاء. احتضان الشرائح لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في محطة التهجين.
- قم بإزالة غطاء الغطاء واغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في DPBS في RT. ثبت العينة لمدة 5 دقائق مع 1٪ فورمالديهايد في RT. في هذه المرحلة ، لم يتم ربط المادة بالكامل بالشرائح الزجاجية وبالتالي لا ينبغي وضعها على منصة اهتزاز.
- اغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في DPBS في RT ، متبوعا بالجفاف في 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ إيثانول لمدة 2 دقيقة لكل منهما. جفف العينة المجففة بالهواء وقم بتهجينها باستخدام مجسات تحمل علامات الفلورسنت.
- حدد مسبارا خاصا بالسنترومير للكروموسوم X ومسبارا مركزيا آخر خاصا بالكروموسوم كعنصر تحكم لتحديد محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض. في هذه الحالة ، يتم استخدام مجسات خاصة بالسنترومير للكروموسوم X (CEP X [DXZ1]) المسمى مباشرة ب Spectrum Green الفلوروكروم والكروموسوم 18 (CEP 18 [D18Z1]) المسمى مباشرة بالفلوروكروم SpectrumOrange.
- أضف 1 ميكرولتر من CEP X ، و 1 ميكرولتر من CEP 18 ، و 18 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين إلى العينة وأغلقها بغطاء يتم لصقه على الشرائح لمنع تبخر المسبار أثناء التهجين. نقل الشرائح إلى محطة التهجين للتمسخ عند 73 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، تليها التهجين خلال الحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة غطاء الغطاء وأي غراء متبقي من الشريحة بعد التهجين. اغسل الشرائح في 0.4x SSC / 0.3٪ Tween-20 عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها الحضانة لمدة دقيقة واحدة في 2x SSC / 0.1٪ Tween-20 في RT.
- قم بتجفيف الشرائح عن طريق الحضانة اللاحقة لمدة 2 دقيقة في 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ من الإيثانول وجفف الهواء في الظلام. قم بتغطية الشرائح بوسيط تثبيت يحتوي على 4 ′،6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI). يحفظ عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل قبل التحليل بواسطة المجهر الفلوري.
- التصوير
- افحص الإشارة (الإشارات) للكروموسوم X باستخدام مجهر مضان مرتبط ببرنامج معالجة الصور.
- أولا ، حدد الفلوروكروم DAPI.
- احصل على صورة عن طريق تحديد خلية جديدة > Live > Capture بتكبير 630x. ستظهر نافذة جديدة مع العتبة. اضبط الشريط الأزرق للعتبة على 0 لتقليل الخلفية والشريط الأحمر على الحد الأقصى (255) لجعل الإشارات أكثر إشراقا. انقر فوق قبول.
- ستظهر نافذة جديدة مع تحسين مع اقتراح أغمق / أكثر إشراقا (12) ونصف قطر (3) وعمق (1). استخدم القيم المقترحة أو اضبطها إذا لم تكن راضيا.
- ثانيا ، حدد الفلوروكروم SpectrumOrange وانقر فوق التقاط.
- اضبط الشريط الأزرق للعتبة على 0 لتقليل الخلفية والشريط الأحمر على الحد الأقصى (255) لجعل الإشارات أكثر إشراقا. انقر فوق قبول.
- ستظهر النافذة مع التحسين مع اقتراح أغمق / أكثر إشراقا (-11) ونصف قطر (2.7) وعمق (0.6). استخدم القيم المقترحة أو اضبطها إذا لم تكن راضيا.
- أخيرا ، حدد الفلوروكروم SpectrumGreen وانقر فوق التقاط.
- اضبط الشريط الأزرق للعتبة على 0 لتقليل الخلفية والشريط الأحمر على الحد الأقصى (255) لجعل الإشارات أكثر إشراقا. انقر فوق قبول.
- ستظهر النافذة مع التحسين مع اقتراح أغمق / أكثر إشراقا (0) ونصف قطر (3) وعمق (0). استخدم القيم المقترحة أو اضبطها إذا لم تكن راضيا. احفظ الصورة في ملف تم إنشاؤه حديثا.
ملاحظة: تم تقييم الخلايا الجسدية فقط عندما كانت إشارتان من كروموسوم التحكم 18 مرئيتين. في معظم البويضات ، يمكن اكتشاف إشارة واحدة فقط لكل كروموسوم.
- أولا ، حدد الفلوروكروم DAPI.
- قم بتخزين الشرائح في الظلام عند 4 درجات مئوية بعد التحليل لمنع فقدان الإشارات.
- افحص الإشارة (الإشارات) للكروموسوم X باستخدام مجهر مضان مرتبط ببرنامج معالجة الصور.
2. FISH على أقسام البارافين من أنسجة قشرة المبيض المطعمة
ملاحظة: تم تطعيم جزء واحد من أنسجة قشرة المبيض المحفوظة بالتبريد / المذابة ل 18 أنثى مصابة ب TS في الفئران التي تعاني من نقص المناعة المشترك الشديد (SCID) لمدة 5 أشهر. تم وصف إجراء التطعيم بالأجانب سابقا وتم إجراؤه في الجامعة الكاثوليكية في لوفان (بروكسل ، بلجيكا) باتباع الإرشادات المحلية للجنة البحوث الحيوانية فيما يتعلق برعاية الحيوان (المرجع 2014 / UCL / MD / 007) 18،19.
- اختيار أقسام من أنسجة قشرة المبيض المطعمة بالأشعة الخارجية التي تحتوي على بصيلات
- تثبيت أنسجة قشرة المبيض المطعمة بالأجانب في 4٪ فورمالديهايد وتضمين الأنسجة في البارافين. تقليم الكتل بمشرط لإزالة البارافين الزائد وقطع كتلة البارافين إلى سمك 4 ميكرومتر على ميكروتوم دوراني.
- حدد كل قسم سابع من شريط البارافين لتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) لتحديد الأقسام التي تحتوي على بصيلات. ضع القسم في حمام مائي عند 40-45 درجة مئوية وقم بتركيبه على شرائح مجهر الكيمياء المناعية.
- إزالة البارافين وتلطيخ HE
- ضع الشرائح على موقد لمدة 10 دقائق عند 60 درجة مئوية ، وبعد ذلك اغمر الشرائح في 100٪ زيلين لمدة 5 دقائق. ليس من الضروري وضع الشرائح مباشرة على الموقد. رطب المقاطع لمدة 15 ثانية في الإيثانول بنسبة 100٪ ، متبوعا ب 2 × 15 ثانية في الإيثانول بنسبة 96٪. شطف الشرائح في ماء الصنبور لمدة 2 دقيقة.
- تلطيخ الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق وبعد ذلك شطف الشرائح لفترة وجيزة في ماء الصنبور. اغمر الشرائح لفترة وجيزة في محلول بيكربونات (100 غرام من كبريتات المغنيسيوم و 10 غرام من بيكربونات الصوديوم في 5 لتر من الماء المقطر). شطف الشرائح في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
- قم بتلطيخ الشرائح باستخدام eosin لمدة 4 دقائق وقم بتجفيف الشرائح ثلاث مرات باستخدام الإيثانول بنسبة 100٪ ، متبوعا بالزيلين. قم بتغطية بقع HE على الشرائح وقم بتقييم أقسام HE تحت المجهر الضوئي لتحديد الأقسام ذات البصيلات (تكبير 100x).
- المعالجة المسبقة والتهجين لأقسام البارافين ل DNA FISH
- حدد مقاطع جديدة تقع قبل أو بعد القسم الذي يحتوي على بصيلات من شريط البارافين. قم بتركيب قسم واحد على شريحة زجاجية. جفف أقسام البارافين لمدة 45 دقيقة على الأقل على موقد على حرارة 56 درجة مئوية. ليس من الضروري وضع الشرائح مباشرة على الموقد.
- قم بإزالة المقاطع في الزيلين لمدة 10 دقائق. اغمر الشرائح في 99.5٪ إيثانول واشطفها لمدة 5 دقائق في ماء الصنبور. قم بمعالجة الشرائح مسبقا بمحلول استرجاع الهدف (درجة حموضة منخفضة) لمدة 10 دقائق عند 96 درجة مئوية. بعد التبريد ، شطف الشرائح في الماء المقطر.
- عالج الشرائح لمدة 5 دقائق بحمض الهيدروكلوريك 0.01 M ، متبوعا بهضم البيبسين (200 وحدة / مل) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شطف الشرائح مرة أخرى في 0.01 M حمض الهيدروكلوريك وبعد ذلك في برنامج تلفزيوني.
- ثبت الشرائح في 1٪ فورمالديهايد / برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. شطف الشرائح لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني ، ثم مرة أخرى في الماء ديمي. جفف الشرائح بنسبة 99.5٪ من الإيثانول واتركها تجف في الهواء.
- حدد مسبارا خاصا بالسنترومير للكروموسوم X ومسبارا مركزيا آخر خاصا بالكروموسوم كعنصر تحكم لتحديد محتوى الكروموسومات X للخلايا الحبيبية. هنا ، يتم استخدام الكروموسوم 18 كعنصر تحكم.
- ضع 5 ميكرولتر من المسبار CEP 18 (D18Z1) المسمى مباشرة ب SpectrumGreen الفلوروكرومي والمسبار CEP X (DXZ1) المسمى مباشرة ب SpectrumRed الفلوروكروم على الشرائح المعالجة مسبقا. ضع غطاء وأغلق المنطقة بغراء الصور. ضع الشرائح في جهاز هجين للتمسخ عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق والتهجين طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
- في اليوم التالي ، اشطف الشرائح لمدة 5 دقائق في 2x SSC عند 42 درجة مئوية ، تليها دقيقتان و 1 دقيقة شطف في 0.3٪ Nonidet P40 عند 73 درجة مئوية. قم بتحديث 2x SSC وشطف الشرائح مرة أخرى لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطية الكوفيت بحيث يتم الاحتفاظ بالأقسام في الظلام.
- شطف الشرائح لفترة وجيزة في الماء المقطر. جفف الشرائح بنسبة 99.5٪ من الإيثانول واتركها تجف في الهواء مرة أخرى. أخيرا ، قم بتركيب الشرائح بمحلول يحتوي على DAPI ووسيط التركيب.
- التصوير
- تحليل النتائج تحت المجهر الفلوري عند تكبير 630x. افتح برنامج معالجة الصور على الكمبيوتر. حدد FISH كملف تعريف.
- تحقق مما إذا كان انبعاث DAPI مضبوطا على 431 نانومتر والإثارة عند 359 نانومتر ، وانبعاث تكساس الأحمر عند 613 نانومتر والإثارة عند 595 نانومتر ، وانبعاث FITC عند 519 نانومتر والإثارة عند 495 نانومتر.
- احصل على صورة عن طريق تحديد Live > Capture Single Image. قم بتحسين جودة الصورة عن طريق ضبط التعريض والكسب عن طريق تحريك منزلق التعريض ومنزلق الكسب في قائمة الصورة على اليسار (على سبيل المثال، التعريض الضوئي: 212 مللي ثانية، والكسب: 7.9). يمكن أن يختلف التعرض والكسب المطلوبان لكل صورة ؛ راقب التغييرات أثناء هذه العملية للحصول على صورة محسنة. احفظ الصورة في ملف تم إنشاؤه حديثا.
- قم بتخزين الشرائح في الظلام عند 4 درجات مئوية بعد التحليل لمنع فقدان الإشارات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FISH على خلايا المبيض المعزولة قبل التطعيم
تم استخدام أنسجة قشرة المبيض المحفوظة بالتبريد من الإناث مع 45،X / 46،XX (المريض A) أو 45،X / 46،XX / 47،XXX (المريض B) TS لتوضيح النتائج باستخدام هذا البروتوكول. في المريض A ، كان لدى 50٪ من الخلايا الليمفاوية نمط نووي 45,X و 50٪ 46,XX. في المريض B ، كانت 38 ٪ من الخلايا الليمفاوية 45،X ، و 28 ٪ كانت 46،XX ، و 34 ٪ كانت 47،XXX. تم استخدام مجسات خاصة بالسنترومير للكروموسوم X (الأخضر) والكروموسوم 18 كعنصر تحكم (أحمر) لتحديد محتوى الكروموسومات X للخلايا الحبيبية الفردية والخلايا اللحمية والبويضات المعزولة من أنسجة قشرة المبيض لمرضى TS دون زرع أجنبي مسبق (الشكل 1).
الشكل 1: تحليل FISH لخلايا المبيض المعزولة من أنسجة قشرة المبيض قبل التطعيم. تم تحليل البويضات (رؤوس الأسهم) والخلايا الحبيبية من الجريبات البدائية المفردة (A ، B) و (C ، D) الخلايا اللحمية المحيطة باستخدام مجسات الفلورسنت المحددة للكروموسوم X (الإشارات الخضراء) وكروموسوم التحكم 18 (الإشارات الحمراء). تشير الأسهم البيضاء إلى خطوط الخلايا 45 ، X ، وتشير الأسهم الصفراء إلى خطوط الخلايا 46 ، XX ، وتشير الأسهم الحمراء إلى خطوط الخلايا 47،XXX. ليست كل إشارات الفلورسنت في نفس مستوى التركيز. تمثل القضبان 10 ميكرومتر. تم ضبط تكبير إشارات FISH على 630x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يوضح الشكل 2 الاختلافات بين الجريبات البدائية الفردية التي عولجت بالتربسين وبدونه قبل FISH. باستخدام التربسين قبل تحليل FISH ، كانت كتلة الخلايا الحبيبية والبويضات أقل تكتلا ، مما سمح بتحليل محتوى الكروموسومات X للخلايا الحبيبية الفردية والبويضات. يمكن تمييز الحمض النووي للبويضات بسهولة عن الحمض النووي للخلايا الحبيبية المحيطة بسبب الشكل غير المنتظم للحمض النووي (DNA) من البويضات وحجمه ومظهره المنتشر. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت إشارة FISH قوية واحدة فقط لكل كروموسوم في بويضات البصيلات الصغيرة ، بسبب القرب الشديد من الكروماتيدات الشقيقة الأربعة في هذه الخلايا. يمكن تحديد محتوى الكروموسومات X للبويضات باستخدام نسبة سطح إشارة FISH للكروموسوم X إلى نسبة الكروموسوم 18.
الشكل 2: جريبات صغيرة تعامل مع وبدون التربسين قبل FISH. (أ) أدى الهضم الأنزيمي لأنسجة قشرة المبيض إلى تعليق الخلايا المنفصلة إلى حد كبير ولكن ترك الجريبات البدائية ، التي تتكون من بويضة سليمة محاطة بطبقة واحدة من الخلايا الحبيبية (رؤوس الأسهم في اللوحة أ). (ب) تم انتقاء الجريبات الصغيرة يدويا من معلق الخلية ولكنها قدمت صعوبات في تفسير الإشارات بعد FISH بسبب تكتل الخلايا الحبيبية (C). (د، ه) أدى الهضم الإضافي للجريبات المعزولة مع التربسين قبل FISH إلى تقلص الخلايا الحبيبية الفردية إلى مورفولوجيا كروية على سطح البصيلات وكانت أكثر عرضة للانفصال عن الجريب لتصبح في متناول تحليل FISH. يشار إلى إشارات FISH المشتقة من البويضات بالأسهم. تمثل الأشرطة السوداء 100 ميكرومتر والأشرطة البيضاء تمثل 10 ميكرومتر. تم ضبط تكبير إشارات FISH على 630x. وقد استنسخت اللوحة دال بإذن من Peek et al.16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تحليل FISH للخلايا الحبيبية على أقسام البارافين من أنسجة قشرة المبيض المطعمة
تم العثور على الجريبات الثانوية والغارية لتكون أقل عرضة للهضم الأنزيمي ، مما يجعل الطريقة الموصوفة سابقا لتفكك الأنسجة للحصول على خلايا المبيض الفردية غير مناسبة لنمو البصيلات الموجودة في أنسجة المبيض بعد التطعيم الأجنبي على المدى الطويل. لذلك ، تم تحسين بروتوكول FISH باستخدام أقسام نسيجية 4 ميكرومتر لتحديد محتوى الكروموسومات X للخلايا الحبيبية للجريبات الثانوية والغارية في أنسجة قشرة المبيض بعد التطعيم (الشكل 3). في هذا الإعداد ، من غير المحتمل أن يتم التقاط إشارة FISH للكروموسوم X أو كروموسوم التحكم في البويضات في قسم واحد 4 ميكرومتر ، بسبب القطر الكبير للبويضات في بصيلات النمو.
الشكل 3: تلطيخ الأنسجة و FISH لأقسام أنسجة قشرة المبيض بعد زراعة الأعضاء. (أ، ب) أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين / الإيوزين بصيلات ثانوية وغريبة طبيعية شكليا في أنسجة قشرة المبيض بعد 5 أشهر من التطعيم الأجنبي. (ج، د) تم تحديد محتوى الكروموسومات X للخلايا الحبيبية لهذه البصيلات عن طريق تحليل FISH. في هذا الشكل، يظهر الكروموسوم X باللون الأحمر، والكروموسوم 18 باللون الأخضر. يمثل الشريط في اللوحة A 50 ميكرومتر ، ويمثل الشريط في اللوحة B 20 ميكرومتر ، ويمثل الشريط في اللوحتين C و D 10 ميكرومتر. تم ضبط تكبير إشارات FISH على 630x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كخطوة أولى ، تم إجراء تجارب مع تقنيات تثبيت مختلفة للأنسجة لتحديد الطريقة التي تؤدي إلى أفضل إشارات FISH. تم إجراء تحليل FISH على الأنسجة المطعمة التي تم تثبيتها في كل من محلول Bouin ثم غمرها في 4٪ من الفورمالديهايد ، وعلى الأنسجة المطعمة التي تم تثبيتها في 4٪ من الفورمالديهايد فقط. عرضت الأنسجة المطعمة التي تم تثبيتها لأول مرة في بوين ضبابا أخضر على الصورة ، مما يجعل من الصعب حساب عدد إشارات FISH بدقة (الشكل 4).
الشكل 4: أنسجة قشرة المبيض المطعمة المثبتة في محلول بوين والفورمالديهايد فقط. (أ) أدى تثبيت أنسجة قشرة المبيض المطعمة في محلول بوين إلى إشارات فلورية غير واضحة ومحجوبة إلى حد كبير في الخلايا الجريبية بسبب الضباب الأخضر. (ب) أنسجة قشرة المبيض المثبتة في الفورمالديهايد قدمت فقط إشارات فلورية ممتازة يسهل تفسيرها. تمثل القضبان 10 ميكرومتر. تم ضبط تكبير إشارات FISH على 630x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
من أجل تحديد محتوى الكروموسومات X للخلايا الحبيبية للبصيلات في الأقسام النسيجية ، لا يمكن ببساطة حساب إشارات FISH للخلايا الحبيبية. قد يتم فقد جزء من كروموسومات خلية حبيبية فردية في قسم نسيجي معين ، بسبب تقسيم الأنسجة. لذلك ، من الضروري أولا تحديد النسبة المئوية لإشارات FISH المفقودة بسبب التقسيم قبل تحديد فقدان محتوى الكروموسومات X في نهاية المطاف من سكان الخلايا الحبيبية بسبب اختلال الصيغة الصبغية في البصيلات الثانوية والغارية المشكلة حديثا بعد تطعيم الأنسجة.
يمكن حساب النسبة المئوية لإشارات FISH المفقودة بسبب التقسيم عن طريق تحديد عدد إشارات FISH لكل خلية حبيبية لكروموسوم التحكم غير اختلال الصيغة الصبغية 18. من المتوقع أن يتم فقدان نفس النسبة المئوية من كروموسوم X بسبب التقسيم. أي انخفاض إضافي في عدد إشارات FISH كروموسوم X في عدد الخلايا الحبيبية يرجع إلى اختلال الصيغة الصبغية. ومع ذلك ، فإن استخدام إشارات FISH لكروموسوم التحكم لتحديد فقدان كروموسوم X بسبب اختلال الصيغة الصبغية يتطلب حساسية الكشف عن إشارات FISH للكروموسوم X وكروموسوم التحكم لتكون متشابهة جدا. لذلك تم تحديد حساسية الكشف لكل من مجسات FISH في الخلايا الحبيبية للجريبات النامية في الأقسام النسيجية للأفراد غير الخواصبين 46،XX. عندما تكون نسبة إشارات FISH للكروموسوم X / كروموسوم التحكم قريبة من 1 ، يمكن افتراض أن حساسية الكشف لكلا المجسين متشابهة جدا بالفعل ، وبالتالي يمكن استخدام مجسات FISH لتحديد مستوى اختلال الصيغة الصبغية في مجموعة الخلايا الحبيبية للجريبات النامية في الأقسام النسيجية لأنسجة المبيض بعد زرع xenotransplant.
مثل
عند تحليل عدد إشارات الكروموسوم 18 في 130 خلية حبيبية من جريب من مبيض لفرد 46,XX ، من المتوقع وجود 260 إشارة. ومع ذلك ، في قسم 4 ميكرومتر من هذه الخلايا ، لوحظت فقط 204 إشارة كروموسوم 18. يشير هذا إلى فقدان 21.5٪ من الإشارات بسبب التقسيم ((260-204) / 260 × 100 = 21.5٪). وبالتالي يتم تقليل عدد إشارات الكروموسوم 18 لكل خلية حبيبية إلى 204/130 = 1.57 بسبب التقسيم.
بعد ذلك ، يتم تحليل عدد الكروموسومات X في الخلايا الحبيبية لجريب غاري بعد التطعيم في أنسجة المبيض للإناث المصابة ب TS. في المجموع ، تم حساب 191 إشارة للكروموسوم X و 199 إشارة للكروموسوم 18. يمكن تحديد عدد الخلايا الحبيبية بقسمة العدد الإجمالي لإشارات الكروموسوم 18 على عدد إشارات الكروموسوم 18 لكل خلية حبيبية (199 / 1.57 = 127 خلية حبيبية). أخيرا ، يمكن تحديد النسبة المئوية للخلايا الحبيبية 45,X بقسمة الفرق في إشارات الكروموسوم 18 والكروموسوم X مع عدد الخلايا الحبيبية (أي [199-191] / 127 × 100 = 6٪ من الخلايا الحبيبية هي 45 ، X ، و 94٪ من هذه الخلايا هي 46 ، XX).
من الجدير بالذكر أنه في المرضى الذين لديهم خط خلية 47،XXX ، من الممكن فقط تحديد الحد الأدنى من النسبة المئوية للخلايا الحبيبية ذات النمط النووي 47،XXX ، نظرا لأن مزيجا من الخلايا الحبيبية 45،X و 47،XXX له نفس عدد إشارات كروموسوم X مثل الخلايا الحبيبية 46،XX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل FISH هو تقنية معروفة للكشف عن انحرافات كروموسومات X في الخلايا الليمفاوية أو الخلايا الشدقية لكل من الذكور والإناث10. وصفت العديد من الدراسات FISH على الأمشاج للذكور الذين يعانون من انحرافات كروموسومية X ، ولكن المعلومات التفصيلية التي حصلت عليها FISH على خلايا المبيض من الإناث مع انحرافات كروموسوم X لا تزال تفتقر إلى14. تقدم هذه المقالة طرقا جديدة تعتمد على FISH لتحديد ما إذا كان اختلال الصيغة الصبغية موجودا في خلايا المبيض لأنسجة قشرة المبيض غير المطعمة والمطعمة من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X.
يكمن التحدي الرئيسي لبروتوكول عزل خلايا المبيض الفردية في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة في الهضم الأنزيمي للأنسجة ، الأمر الذي يتطلب بعض الممارسة مسبقا. من أجل الحصول على إشارات FISH دقيقة لخلايا المبيض الكافية ، من المهم اتباع الخطوات المتعلقة بالهضم الأنزيمي وأوقات الحضانة ودرجات الحرارة المشار إليها بدقة. يمكن أن يؤدي الانحراف عن البروتوكول إلى فقدان كبير لخلايا المبيض أثناء العملية ، ويجب تجنب ذلك بشكل خاص في المرضى الذين لديهم بالفعل احتياطي مبيض منخفض. خطوة أخرى حاسمة في هذه الطريقة هي علاج البصيلات البدائية النقية بالتربسين لمنع البويضات وكتلة الخلايا الحبيبية من التكتل ، مما يحول دون تحليل الخلايا الفردية. بدون علاج التربسين ، يتم تقليل عدد الخلايا الحبيبية الفردية التي يمكن تحليلها بشكل موثوق بواسطة FISH بشدة.
يتطلب تحليل FISH على أنسجة قشرة المبيض التي يتم استردادها بعد التطعيم على المدى الطويل تقنية مختلفة ، حيث تم العثور على بصيلات صغيرة فقط لتكون عرضة بما فيه الكفاية للهضم الأنزيمي الضروري للحصول على خلايا المبيض الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، على غرار الزرع الذاتي لأنسجة قشرة المبيض ، تضيع العديد من البصيلات بعد التطعيم بسبب نقص الأكسجة ونقص العناصر الغذائية قبل إعادة توعية الكسب غير المشروع بشكل كاف من قبل المضيف20. لذلك من المتوقع أن يكون عدد البصيلات بعد التطعيم أقل بكثير مما كان عليه قبل التطعيم. بالنسبة لتقنية FISH المستخدمة في المقاطع النسيجية ، من المهم تثبيت الأنسجة المطعمة في 4٪ فورمالديهايد فقط للحصول على إشارات FISH المثلى. يتم استخدام تثبيت أنسجة قشرة المبيض في مثبت بوين بشكل روتيني في المختبر ، وعلى الرغم من أن هذا يعطي نتائج ممتازة عند دمجه مع تلطيخ HE القياسي ، فإن تثبيت الأنسجة مع Bouin قبل FISH يؤدي إلى إشارات فلورية ضعيفة وضبابية يصعب تفسيرها.
على الرغم من أن هذا البروتوكول قد ثبت نجاحه في تحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض ، إلا أنه لا يزال لديه بعض القيود. أحد القيود هو أنه لا يمكن استخدام هذه الطرق إلا لتحليل خلايا المبيض للإناث ذات الانحرافات العددية. يمكن الكشف عن الانحرافات العددية باستخدام مجسات موجهة إلى التسلسلات المتكررة21. تقوم هذه المجسات بتهجين تسلسلات متعددة لأزواج القواعد المتكررة في منطقة السنترومير ، مما يؤدي إلى إشارات تهجين قوية. في المقابل ، لا يمكن اكتشاف الانحرافات الهيكلية إلا باستخدام مجسات مقابل تسلسلات مفردة فريدة. تهجن هذه المجسات إلى تسلسلات تحدث مرة واحدة فقط في الجينوم الأحادي الصيغة الصبغية ، مما يؤدي إلى إشارة FISH أقل كثافة بكثير مقارنة بالانحرافات العددية. بسبب إشارات FISH الضعيفة نسبيا ، من الصعب تحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض بشكل صحيح في الإناث ذوات الانحرافات الهيكلية.
ثانيا ، يصعب تحليل إشارات FISH لبويضات البصيلات الصغيرة في الأنسجة غير المطعمة ، نظرا لقرب الكروماتيدات الشقيقة الأربعة في الطور التمهيدي للانقسام الاختزاليI 22. ستكون هناك إشارة تهجين قوية واحدة فقط في البويضات ، وبالتالي لا يمكن ببساطة حساب عدد الإشارات في البويضات لتحديد محتوى الكروموسومات X. بدلا من ذلك ، يجب استخدام نسبة سطح إشارات الكروموسوم X و 18 FISH لتحديد محتوى الكروموسومات X في هذه الخلايا. لا يمكن تحديد ذلك بشكل موثوق إلا إذا كانت إشارات FISH في البويضات موجودة بوضوح.
علاوة على ذلك ، لا يمكن استخدام FISH على الأنسجة المطعمة إلا لتحديد محتوى الكروموسومات X للخلايا الحبيبية من البصيلات الثانوية والغارية ، حيث أن البصيلات الصغيرة في الأقسام النسيجية للأنسجة المطعمة تحتوي فقط على عدد قليل من الخلايا الحبيبية التي يمكن تحليلها بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تحديد محتوى الكروموسومات X للبويضات بدقة باستخدام هذه الطريقة بسبب القطر الكبير للبويضات.
أخيرا ، لا يزال من الصعب الحصول على الأمشاج الأنثوية مقارنة بالأمشاج الذكرية لأن الجراحة الغازية مطلوبة للحصول على خلايا المبيض أو أنسجة قشرة المبيض. لذلك ، من المرجح أن يتم تطبيق هذه الأساليب في بيئة بحثية.
في الختام ، يعد تحليل FISH لخلايا المبيض لأنسجة قشرة المبيض غير المطعمة والمطعمة من الإناث المصابات بانحرافات كروموسوم X تقنية فريدة ومفيدة لاكتساب نظرة ثاقبة على محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض في هذه المجموعة المحددة. تظهر هذه التقنيات أن الحفظ بالتبريد لأنسجة قشرة المبيض من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X أمر ممكن ، وأن الجريبات البدائية المحفوظة بالتبريد قادرة على النمو إلى بصيلات ثانوية وغريبة. ومع ذلك ، يجب أن يوضع في الاعتبار أن كلتا الطريقتين تهدفان إلى تسهيل البحث المستقبلي في الإناث المصابات بانحرافات كروموسومية X ، وليست مصممة لاستخدامها كأداة تشخيصية لفحص النتائج الإنجابية للإناث المصابات بانحرافات كروموسومية X في الممارسة السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وينوه المؤلفون بمارجو فان براكيل ودومينيك سميتس وغيوم فان دي زاندي وباتريشيا فان كليف وميلان إنتزار على خبرتهم ومساعدتهم التقنية. مصادر التمويل: ميرك سيرونو (A16-1395) ، جودلايف ، وفيرينج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A.
- Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
- Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
- Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
- Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
- Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
- Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
- Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
- Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
- Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
- Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
- Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
- Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
- Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
- Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
- Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
- Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).
