Artículo de método

Determinación de los límites térmicos para el zooplancton utilizando un bloque de calor

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DOI:

10.3791/64762

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18 de noviembre de 2022

 ,  , 
1Biology Department, Swarthmore College

En este artículo

Resumen

El presente protocolo ilustra el uso de componentes disponibles comercialmente para generar un gradiente térmico estable y lineal. Dicho gradiente se puede utilizar para determinar el límite térmico superior de organismos planctónicos, particularmente larvas de invertebrados.

Resumen

Los límites térmicos y la amplitud se han utilizado ampliamente para predecir la distribución de las especies. A medida que la temperatura global continúa aumentando, comprender cómo cambia el límite térmico con la aclimatación y cómo varía entre las etapas de la vida y las poblaciones es vital para determinar la vulnerabilidad de las especies al calentamiento futuro. La mayoría de los organismos marinos tienen ciclos de vida complejos que incluyen etapas planctónicas tempranas. Si bien cuantificar el límite térmico de estas pequeñas etapas tempranas del desarrollo (decenas a cientos de micras) ayuda a identificar los cuellos de botella del desarrollo, este proceso puede ser un desafío debido al pequeño tamaño de los organismos objetivo, el gran requisito de espacio de banco y el alto costo de fabricación inicial. Aquí, se presenta una configuración que está orientada a volúmenes pequeños (ml a decenas de ml). Esta configuración combina componentes disponibles comercialmente para generar un gradiente térmico estable y lineal. También se presentan las especificaciones de producción de la configuración, así como los procedimientos para introducir y enumerar individuos vivos versus muertos y calcular la temperatura letal.

Introducción

La tolerancia térmica es clave para la supervivencia y función de los organismos 1,2. A medida que el planeta continúa calentándose debido a las emisiones antropogénicas de carbono, se está prestando cada vez más atención a la determinación y aplicación de límites térmicos3. Se han utilizado varios criterios de valoración, como la mortalidad, la falta de desarrollo y la pérdida de movilidad, para determinar los límites térmicos superior e inferior4. Estos límites térmicos a menudo se consideran un proxy para el nicho térmico de un organismo. Esta información se utiliza a su vez para identificar especies que son más vulnerables al calentamiento global, así como para predecir la distribución futura de las especies y las interacciones resultantesentre especies 3,5,6,7. Sin embargo, determinar los límites térmicos, especialmente para pequeños organismos planctónicos, puede ser un desafío.

Para los organismos planctónicos, particularmente las etapas larvales de los invertebrados marinos, el límite térmico puede determinarse a través de la exposición crónica. La exposición crónica se logra criando larvas a varias temperaturas durante días o semanas y determinando la temperatura a la que la supervivencia larvaria y / o la tasa dedesarrollo reduce 8,9,10. Sin embargo, este enfoque requiere bastante tiempo y requiere grandes incubadoras y experiencia en la cría de larvas (consulte la referencia11 para una buena introducción al cultivo de larvas de invertebrados marinos).

Alternativamente, la exposición aguda al estrés térmico se puede utilizar para determinar los límites térmicos. A menudo, este enfoque de determinación implica colocar viales pequeños con larvas en baños secos con temperatura controlada 12,13,14, aprovechar las funciones de gradiente térmico en termocicladores de PCR 15,16, o colocar viales de vidrio / tubos de microcentrífuga a lo largo de un gradiente térmico generado por calentamiento y enfriamiento aplicados en los extremos de grandes bloques de aluminio con orificios en los que los viales encajan cómodamente 17, 18,19. Los baños secos típicos generan una sola temperatura; Por lo tanto, se deben operar varias unidades simultáneamente para evaluar el rendimiento en un rango de temperaturas. Los termocicladores generan un gradiente, pero solo acomodan un pequeño volumen de muestra (120 μL) y requieren manipulaciones cuidadosas. Al igual que los termocicladores, los grandes bloques de aluminio crean gradientes de temperatura lineales y estables. Ambos enfoques pueden combinarse con regresión logística o probit para calcular la temperatura letal para el 50% por ciento de la población (LT50)12,20,21. Sin embargo, los bloques de aluminio utilizados tenían ~ 100 cm de largo; Este tamaño exige un gran espacio de laboratorio y acceso a fresadoras especializadas de control numérico por computadora para perforar los agujeros. Junto con el uso de dos baños de agua de grado de investigación para mantener la temperatura objetivo, el costo financiero de ensamblar la configuración es alto.

Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo desarrollar un medio alternativo para generar un gradiente de temperatura estable y lineal con piezas disponibles comercialmente. Dicho producto debe tener una huella pequeña y debe poder usarse fácilmente para experimentos de exposición al estrés térmico agudo para organismos planctónicos. Este protocolo se desarrolla con zooplancton que tiene un tamaño de <1 mm como organismos objetivo, y por lo tanto, se optimizó para el uso de un tubo de microcentrífuga de 1,5 o 2 ml. Los organismos de estudio más grandes requerirán contenedores más grandes que los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml utilizados y orificios agrandados en los bloques de aluminio.

Además de hacer que el aparato experimental sea más accesible, este trabajo tiene como objetivo simplificar la tubería de procesamiento de datos. Si bien el software estadístico comercial proporciona rutinas para calcular LT50 utilizando regresión logística o probit, el costo de la licencia no es trivial. Por lo tanto, un script fácil de usar que se basa en el programa estadístico de código abierto R22 haría que el análisis de datos fuera más accesible.

Este protocolo muestra cómo se puede fabricar un bloque térmico compacto con piezas disponibles comercialmente y aplicarse para exponer el zooplancton (larvas del dólar de arena Dendraster excentricus) a un estrés térmico agudo para determinar su límite térmico superior.

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Protocolo

1. Fabricación del bloque térmico

  1. Conecte el calentador de tiras de 120 V y 100 W al reóstato (consulte la Tabla de materiales).
  2. Prepare el bloque de aluminio de 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 pulgadas x 5 pulgadas x 2 pulgadas) perforando 60 agujeros en una cuadrícula de 6 x 10 (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que los orificios estén espaciados 2 cm de centro a centro en ambas direcciones. Cada uno debe tener 1,1 cm de diámetro y 4,2 cm de profundidad (Figura 1).
    NOTA: Realice la perforación en una fresadora o prensa de perforación con brocas de acero de alta velocidad. El elemento calefactor y el elemento refrigerante se eligieron para cubrir la mayor superficie de contacto posible de las superficies de 15,2 cm x 5 cm.
  3. Perfore dos orificios adicionales en una de las superficies de 20,3 cm x 5 cm entre la 1ª y 2ª columna y la9ª y10ª columna, coincidiendo con el tamaño de las sondas del controlador de temperatura (consulte la Tabla de materiales).
  4. Construya una caja a partir de láminas de acrílico transparente de 1,2 cm (0,5 pulgadas) (consulte la Tabla de materiales) para mantener los elementos en su lugar y aislar el bloque térmico completo. Utilice dos capas de acrílico para aislar la parte posterior del elemento calefactor (Figura 1).
  5. En el ensamblaje final, aplique pasta térmica (consulte la Tabla de materiales) para maximizar la conductancia térmica del elemento calefactor al bloque y del bloque al elemento refrigerante.

2. Determinación de los ajustes del gradiente térmico

  1. Conecte el baño de agua/enfriador de acuario con el tubo Tygon (consulte la Tabla de materiales). Aísle el tubo con aislamiento de tubería de espuma según sea necesario.
  2. Inserte la sonda del termostato en los orificios del costado del bloque de aluminio. Asegúrese de que la sonda 1 esté colocada cerca del elemento calefactor.
  3. Coloque los tubos de microcentrífuga llenos hasta el borde (1,5 ml) con agua del grifo en todos los orificios fresados (60 tubos en total).
  4. Encienda el controlador de temperatura y ajuste la temperatura de calentamiento de parada de la sonda de 1 a 35-37 °C y la sonda de 2 a 21,5-22,5 °C.
    NOTA: El termostato propuesto tiene dos salidas que funcionan de forma independiente; Solo la sonda 1 se utiliza para regular la temperatura cálida en este caso de uso particular. Por lo tanto, ajuste la temperatura de la sonda 2 a la de la temperatura de gama baja.
  5. Gire el reóstato para encender el elemento calefactor y configúrelo en medio.
  6. Encienda el baño de agua/enfriador de acuario y ajuste la temperatura del enfriador a 15 ° C.
  7. Compruebe que el bloque esté caliente en un extremo y frío en el otro después de 10 minutos.
    PRECAUCIÓN: Los extremos expuestos del elemento calefactor pueden estar calientes; No los toques.
  8. Verifique la temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando un termopar con un electrodo tipo K (consulte la Tabla de materiales) cada 10 minutos después. La temperatura se estabilizará después de ~ 60 min y aparecerá lineal (Figura 2).
  9. Ajuste los valores de los puntos finales cambiando la configuración del controlador de temperatura y el baño de agua según sea necesario.

3. Exposición térmica y enumeración live:dead

NOTA: El paso 2 se puede omitir una vez que se determinan los ajustes deseados para el gradiente de temperatura.

  1. Encienda el baño de agua de recirculación y el calentador y configúrelos a 15 °C y 37 °C, respectivamente, para generar un gradiente de temperatura de 19,5 °C a 37 °C.
  2. Para asegurarse de que el gradiente térmico sea lineal, coloque tubos de microcentrífuga llenos hasta el borde (1,5 ml) con agua del grifo en todos los orificios fresados (60 tubos en total).
  3. Deje que el bloque de calor alcance la temperatura establecida esperando 45-60 min. Verifique la temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando un termopar con un electrodo tipo K para ver si ha alcanzado la temperatura esperada. Tenga en cuenta estas temperaturas.
  4. Si los organismos del estudio tienen un tamaño de >500 μm y pueden transferirse fácilmente de un recipiente a otro (por ejemplo, un copépodo), llene un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 750 μL de agua de mar filtrada de 0,45 μm. Alternativamente, si los organismos del estudio son pequeños, llene un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 250 μL de agua de mar filtrada de 0,45 μm.
    NOTA: Para los datos representativos, se utilizaron larvas del dólar de arena Dendraster excentrics , que son 2, 4 y 6 días después de la fertilización, (ver Tabla de materiales). El tamaño promedio (± S.D., n = 15 para cada edad) de estos individuos fue de 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm y 292 ± 14 μm, respectivamente. Dado que estas larvas se pueden concentrar fácilmente (paso 3.5), los tubos de microcentrífuga se llenaron con 750 μL de agua de mar filtrada.
  5. Concentrar el cultivo de los organismos del estudio con filtrado inverso (es decir, colocar la malla en el recipiente que contiene los organismos del estudio y eliminar el agua a través de la parte superior de la malla), de modo que los organismos del estudio permanezcan en el fondo del vaso de precipitados11.
    NOTA: Se utilizó una malla de nylon de 30 μm para los dólares de arena larval estudiados (ver Tabla de Materiales).
  6. Enjuague la muestra concentrada de animales con agua de mar filtrada (por ejemplo, cuando se cultive con alimentos de algas u otros productos químicos). Repita el filtrado inverso una vez más para concentrar la muestra de animal.
  7. Coloque un número conocido de organismos individuales en los tubos de microcentrífuga medio llenos. Contar los pequeños organismos planctónicos bajo un microscopio de disección (ver Tabla de materiales) y transferirlos con pipetas Pasteur de vidrio.
    NOTA: El número de organismos a colocar depende del tamaño; Para los dólares de arena larvaria que tenían un tamaño de ~ 200 μm, 20 individuos por tubo de microcentrífuga fueron apropiados.
    PRECAUCIÓN: Las pipetas de vidrio son más deseables que las pipetas de plástico, ya que algunos organismos planctónicos son hidrófobos y se adhieren a las superficies de plástico.
  8. Agregue agua de mar filtrada de 0,45 μm a los tubos de microcentrífuga que contienen animales hasta que el volumen final sea de 1 ml.
  9. Para permitir que los organismos se calienten gradualmente hasta la temperatura experimental deseada, colocar los tubos de microcentrífuga con animales, preparados en el paso 3.7, en el bloque de calor a partir del extremo frío. Coloque pares de tubos de microcentrífuga en cada fila (12 tubos en total).
  10. Espera 10 min.
  11. Mover los pares de tubos de microcentrífuga insertados en el paso 3.9 a los orificios perforados adyacentes con temperaturas más cálidas. Coloque pares adicionales de tubos de microcentrífuga en cada fila en el extremo frío. Cada fila ahora tendrá cuatro tubos. Espere otros 10 minutos.
  12. Continúe agregando tubos de microcentrífuga con animales cambiando sus posiciones del extremo más frío al extremo más cálido en pares. Espere 10 minutos entre cada turno hasta que el bloque de calor esté completamente lleno.
    NOTA: Los pasos 3.9-3.12 se consideran una fase de aumento gradual para aumentar gradualmente la temperatura experimentada por los organismos del estudio.
  13. Deje que los animales incuben a la temperatura designada durante 2 h. Este paso es la fase de exposición a temperatura constante del experimento.
    1. Compruebe la temperatura de los tubos de microcentrífuga con un termopar cada hora si el período de incubación supera las 2 h.
      NOTA: Ajuste el tiempo de incubación en función de las necesidades experimentales. Si la incubación es superior a 2 h, compruebe la temperatura de los tubos a intervalos de tiempo regulares con un termopar en caso de fallo imprevisto del equipo. Para minimizar la perturbación de los organismos del estudio, coloque al azar seis o más tubos de microcentrífuga llenos solo con agua de mar filtrada en el bloque para el monitoreo de la temperatura.
  14. Al final del período de incubación, mida la temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga utilizando un termopar con un electrodo tipo K. Tenga en cuenta estas temperaturas.
  15. Retire los 60 tubos de microcentrífuga con animales y colóquelos en soportes preetiquetados.
  16. Incubar los tubos (paso 3.14) a la temperatura predeterminada, como la temperatura de cría, durante 1 h, que es el período de recuperación.
    NOTA: El período de recuperación puede ser específico de cada especie. Para el dólar de arena larval, la temperatura de cría fue de 18 ° C, y por lo tanto la muestra se colocó en una cámara ambiental. Consulte la literatura relevante y / o realice un experimento de prueba para asegurarse de que el recuento de muertos vivos no se haya visto afectado por la duración del período de recuperación. En los datos representativos, el número de animales vivos después de 1 h fue el mismo que después de 12 o 24 h de recuperación.
  17. Para enumerar la proporción de organismos del estudio que están vivos después de la exposición térmica, transfiera el contenido de un tubo de microcentrífuga individual a una placa de Petri de 35 mm utilizando una pipeta de vidrio.
  18. Observe y observe el número relativo de individuos que todavía están activos (vivos) y aquellos que se han apoderado de la natación o se han disuelto (muerto) bajo un microscopio de disección. Asegúrese de que el número total de individuos observados sea igual al número de individuos colocados en los tubos en el paso 3.7. Verifique el lado de los tubos de microcentrífuga y la placa de Petri para las personas si los números no coinciden.

4. Cálculo de LT50

  1. Genere una tabla de datos en formato CSV con al menos los siguientes encabezados: agrupación variable de interés, temperatura del tubo en °C, número de individuos vivos y número de individuos muertos.
    NOTA: Para los datos representativos, la variable de interés de agrupación se sustituye por edad, ya que el objetivo es comparar entre grupos de edad.
  2. Para ajustar los datos con regresión logística, utilice un modelo lineal generalizado con una distribución binomial. El archivo de codificación suplementario 1 muestra un ejemplo de script de ejemplo utilizando el software de código abierto R22.
  3. Para determinar el límite térmico superior medio (LT 50), calcule el valor predictor (es decir, la temperatura) en el que sobrevivió el50% de los individuos. El archivo de codificación suplementario 2 muestra un script de ejemplo utilizando la función dose.p del MASS23 en R22.

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Resultados

El objetivo de este protocolo es determinar el límite térmico superior del zooplancton. Para ello, se necesita un gradiente térmico estable y lineal. La configuración propuesta fue capaz de generar un gradiente térmico que oscilaba entre 14 °C y 40 °C ajustando la temperatura del baño de agua a 8 °C y la del calentador a 39 °C (Figura 2A). El gradiente de temperatura se puede reducir y cambiar cambiando los valores del punto final. También se generó un gradiente térmico con un rango más estr...

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Discusión

Este protocolo proporciona un enfoque accesible y personalizable para determinar los límites térmicos de pequeños organismos de plancton a través de la exposición térmica aguda. El diseño de 10 orificios y los puntos finales de temperatura flexibles, controlados por el baño de agua en el extremo inferior y el calentador en el extremo superior, permiten determinar LT50 con precisión. Usando este enfoque, se podría detectar una diferencia en el límite térmico que es <1 ° C (Figura 3...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado por el Fondo de Investigación de la Facultad del Swarthmore College [KC] y la beca de investigación de verano Robert Reynolds y Lucinda Lewis '70 para BJ.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,45 y micro; m filtro de membranaVWR74300-042
½ ” Lámina acrílicaMcMaster-Carr8560K266Se utiliza para construir una caja estriada con suficiente aislamiento.
Jeringa de 1 mLVWR76290-420
2 canales 7 tipos de termopar DataloggerOmega EngineeringHH506ASe puede reemplazar con cualquier termómetro que quepa dentro de un tubo de microcentrífuga
Pipeta automática Ranin  
Calentador de tiras de montaje en perno y abrazadera
con funda de acero inoxidable 430, 120 V CA, 1-1/2" de ancho, 100 W		McMaster-Carr3619K32
Mezcla de bioensayo de mar cristalinoPentairCM2BÚselo para hacer agua de mar artificial 
Denraster excentricusM-Rep Dólares de arena de California  
Microscopio de disección Nikon SMZ645
DIYhz Bloque de enfriamiento de agua de aluminio, enfriador de agua líquida Sistema de disipador de calor para PC, CPU de computadora, gráficos, disipador de calor del radiador, cabezal endotérmico plateado (40 mm x 120 mm x 12 mm)Amazonse conecta al baño de agua y se usa para enfriar un extremo del bloque.
Lámina de aluminio fundido MIC6 fácil de mecanizar de 2" de espesor 8" x 8"  McMaster-Carr86825K953Mecanizado a 2" x 6" x 8" con 60 orificios igualmente espaciados (11 mm de diámetro, 42 mm de profundidad) con dos orificios adicionales perforados en un lado para sondas de termostato.
tubería de espuma de polietileno flexibleMcMaster-Carr4530K121Cubre la tubería de plástico entre el enfriador y el bloque para reducir la pérdida de calor. Se puede omitir si el rango de temperatura está cerca de la temperatura ambiente 
EVERSECU 72w 110-240v Enfriador de agua de acuario Calentador / enfriador Controlador de temperatura para tanque de camarones de peces Tanque de arrecife de coral marino por debajo de 20 L / 30 L Enfriador de acuarioAmazonSe puede utilizar en lugar del baño de agua de grado de laboratorio  
Ejemplo con larvas de arena dólar 
GENNEL 100 g Pasta de grasa de compuesto conductor térmico de silicona plateada para GPU CPU IC Oven LED Cooling AmazonMejora la conductancia térmica entre el bloque y los elementos de calefacción y enfriamiento.
Controlador de temperatura Inkbird WiFi Reptile Thermostat con 2 sondas y 2 salidas, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (máx. 250 W por salida)Amazonmonitorea los extremos calientes y fríos. Mantiene el extremo caliente en el rango
Circuladores frigoríficos refrigerados por aire Lauda Ecoline SilverVWR89202-386Se puede sustituir por un enfriador de acuario 
Tubos de microcentrífugaVWR76019-014Si se utilizan animales más grandes, los viales de escanilación (VWR 66022-004) son una buena alternativa 
Filtro de malla Nitex  Hecho porPegamento caliente usado para unir la malla Nitex a un tubo de PVC de 1/2 " 
Pipeta PasteurVWR14673-010
Cloruro de potasio (0,35 M) Software estadístico Millpore-SigmaP3911-500G
R.El proyecto R para el cálculo
Aguja de jeringaVWR89219-346Dependiendo del tamaño del organismo objetivo, se pueden utilizar las gagas 14 y 16
Tygon Tubing McMaster-Carr5233K65Ajuste para que coincida con el enfriador y el bloque utilizados 
Zoo Med Repti Temp RheostatChewy.comCon una potencia nominal de 150 W y recableado para alimentar directamente al elemento calefactor. Se utiliza para controlar la tasa de salida de calor
Aislamiento económico de él mismo estadístico

Referencias

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