Artículo de método

Interrogación pareada específica de células del epigenoma ovárico y transcriptoma de ratón

DOI:

10.3791/64765

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24 de febrero de 2023

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1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este protocolo, el método de purificación de afinidad ribosómica por traducción (TRAP) y el método de aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACT) se optimizaron para la interrogación pareada del transcriptoma ovárico específico de células y el epigenoma utilizando el modelo de ratón NuTRAP cruzado a una línea de ratón Cyp17a1-Cre.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La evaluación de los cambios epigenómicos y transcriptómicos específicos del tipo celular es clave para comprender el envejecimiento ovárico. Con este fin, se realizó la optimización del método de purificación de afinidad ribosómica por traducción (TRAP) y el método de aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACT) para el posterior interrogatorio pareado del transcriptoma ovárico específico de células y el epigenoma utilizando un nuevo modelo de ratón NuTRAP transgénico. La expresión del alelo NuTRAP está bajo el control de un casete STOP floxed y puede dirigirse a tipos específicos de células ováricas utilizando líneas Cre específicas del promotor. Dado que estudios recientes han implicado a las células del estroma ovárico en la conducción de fenotipos de envejecimiento prematuro, el sistema de expresión NuTRAP se dirigió a las células del estroma utilizando un controlador Cyp17a1-Cre. La inducción de la construcción NuTRAP fue específica para los fibroblastos del estroma ovárico, y se obtuvo suficiente ADN y ARN para los estudios de secuenciación de un solo ovario. El modelo NuTRAP y los métodos presentados aquí se pueden utilizar para estudiar cualquier tipo de célula ovárica con una línea Cre disponible.

Introducción

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Los ovarios son actores importantes en el envejecimiento somático1, con distintas contribuciones de poblaciones celulares específicas. La heterogeneidad celular del ovario dificulta la interpretación de los resultados moleculares de los ensayos masivos de ovario completo. Comprender el papel de poblaciones celulares específicas en el envejecimiento ovárico es clave para identificar los impulsores moleculares responsables de la fertilidad y el deterioro de la salud en mujeres de edad avanzada. Tradicionalmente, la evaluación multiómica de tipos específicos de células ováricas se lograba mediante técnicas como la microdisección láser2, los enfoques unicelulares3 o la clasificación celular4. Sin embargo, la microdisección puede ser costosa y difícil de realizar, y la clasificación celular puede alterar los perfiles fenotípicos celulares5.

Un enfoque novedoso para evaluar los perfiles epigenómicos y transcriptómicos específicos del tipo de células ováricas utiliza el modelo de ratón de purificación de afinidad de ribosomas de etiquetado nuclear y traducción (NuTRAP). El modelo NuTRAP permite el aislamiento de ácidos nucleicos específicos del tipo celular sin necesidad de clasificación celular mediante el uso de los métodos de purificación de afinidad: purificación de afinidad ribosómica traducida (TRAP) y aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACT)6. La expresión del alelo NuTRAP está bajo el control de un casete STOP floxed y puede dirigirse a tipos específicos de células ováricas utilizando líneas Cre específicas del promotor. Al cruzar el ratón NuTRAP con una línea Cre específica del tipo celular, la eliminación del casete STOP provoca el marcado eGFP del complejo ribosómico y el marcado biotina/mCherry del núcleo de una manera dependiente de Cre6. Las técnicas TRAP e INTACT se pueden utilizar para aislar el ARNm y el ADN nuclear del tipo de célula de interés y proceder a análisis transcriptómicos y epigenómicos.

El modelo NuTRAP se ha utilizado en diferentes tejidos, como el tejido adiposo6, el tejido cerebral 7,8,9 y la retina10, para revelar cambios epigenómicos y transcriptómicos específicos del tipo celular que pueden no detectarse en el homogeneizado de todo el tejido. Los beneficios del enfoque NuTRAP sobre las técnicas tradicionales de clasificación celular incluyen lo siguiente: 1) la prevención de artefactos de activación ex vivo 8, 2) la necesidad minimizada de equipos especializados (es decir, clasificadores celulares) y 3) el aumento del rendimiento y la disminución del costo de los análisis específicos del tipo de célula. Además, la capacidad de aislar ADN y ARN específicos del tipo de célula de un solo ratón permite análisis pareados que aumentan el poder estadístico. Dado que estudios recientes han implicado a las células del estroma ovárico en la conducción de los fenotipos de envejecimiento prematuro 11,12,13, dirigimos el sistema de expresión NuTRAP a las células del estroma y la teca utilizando un controlador Cyp17a1-Cre. Aquí, demostramos que la inducción de la construcción NuTRAP es específica para las células del estroma ovárico y la teca, y se obtiene suficiente ADN y ARN para los estudios de secuenciación de un solo ovario. El modelo NuTRAP y los métodos presentados aquí se pueden utilizar para estudiar cualquier tipo de célula ovárica con cualquier línea Cre disponible.

Para la generación de una línea de ratón NuTRAP ovárico específica para el tipo celular, el alelo de purificación de afinidad de ribosomas de marcado nuclear y traducción (NuTRAP) tiene un codón STOP floxado que controla la expresión de BirA, mCherry/mRANGAP1 marcado con el péptido de reconocimiento de biotina ligasa (BLRP) y eGFP/L10a. Cuando se cruza con una línea Cre específica del tipo celular, la expresión del casete NuTRAP marca la proteína nuclear mRANGAP1 con biotina/mCherry y la proteína ribosómica L10a con eGFP de una manera dependiente de Cre. Esto permite el aislamiento de núcleos y ARNm de tipos celulares específicos sin necesidad de clasificación celular. El NuTRAP flox/flox se puede emparejar con un Cre específico del tipo de célula relevante para los tipos de células ováricas para evaluar esto.

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Protocolo

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Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Fundación de Investigación Médica de Oklahoma (OMRF). Los ratones parentales fueron comprados en el Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y criados y alojados en condiciones de SPF en un ambiente de barrera HEPA en un ciclo de luz / oscuridad de 14 h / 10 h (luces encendidas a las 6:00 am) en el OMRF.

NOTA: En esta demostración, utilizamos un macho Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) emparejado con una hembra NuTRAP (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). La progenie Cyp17-NuTRAP deseada (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) expresará el alelo NuTRAP bajo el control del promotor Cyp17a1 en las células del estroma ovárico. Para la preparación de este manuscrito, utilizamos ratones hembra Cyp17-NuTRAP de 4 meses de edad (n = 4). Se extrajo ADN de muestras de perforación de orejas de ratón para genotipado para confirmar la herencia de los transgenes Cyp17iCre y NuTRAP y para la detección por PCR de 1) Cre genérico, 2) Cyp17iCre y 3) NuTRAP floxed utilizando los cebadores enumerados en la Tabla de materiales, como se describió anteriormente 7,8.

1. Disección ovárica con ratón

  1. Realizar la eutanasia del ratón de acuerdo con las pautas de cuidado de los animales y la aprobación de la institución, seguida de la recolección de ovarios.
  2. Diseccionar los ovarios para eliminar cualquier tejido adiposo o partes de los oviductos que puedan estar unidos al tejido ovárico antes de colocar los ovarios en tubos con tampón. Proceda inmediatamente a las técnicas TRAP o INTACT.
    NOTA: Este protocolo no ha sido optimizado para su uso con tejido congelado. Se recomienda el uso de un ovario del mismo ratón para cada técnica para futuros análisis estadísticos.

2. Aislamiento de núcleos de tipos específicos de células ováricas

  1. Preparación del tampón
    1. Tampón de purificación nuclear (NPB): Para preparar 100 mL de NPB, combine 2 mL de 1 M HEPES (concentración final: 20 mM HEPES), 0.8 mL de 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4.5 mL de 2 M KCl (90 mM KCl), 0.4 mL de 0.5 M EDTA (2 mM EDTA), 0.1 mL de 0.5 M EGTA (0.5 mM EGTA), y 92,2 ml de agua libre de nucleasas. Suplemento con 1x inhibidor de la proteasa el día del aislamiento de núcleos.
      NOTA: NPB se puede preparar sin el inhibidor de la proteasa por adelantado y dura hasta 3 semanas a 4 °C.
    2. Tampón de lisis de núcleos (completo): Complementa el tampón de lisis de núcleos con 1x inhibidor de proteasa el día del aislamiento de núcleos.
  2. Creación de la suspensión de núcleos
    NOTA: Las muestras deben mantenerse en hielo en todo momento a menos que se indique lo contrario.
    1. Recolectar un ovario de un ratón Cyp17-NuTRAP (u otro Cre-NuTRAP relevante) en 500 μL de tampón de lisis de núcleos (completo). Picar el ovario en ocho partes dentro del tampón con microtijeras de apertura automática.
    2. Use puntas de pipeta de diámetro ancho para transferir el ovario picado y 500 μL de tampón de lisis a un homogeneizador de vidrio Rebote en hielo. Homogeneizar el ovario 10x-20x con el mortero suelto A. Añadir 400 μL de tampón de lisis al homogeneizador Dounce, lavando el mortero A.
    3. Homogeneizar el ovario con el mortero apretado B 10x-20x. Añadir 1.000 μL de tampón de lisis, mortero de lavado B. Transfiera el homogeneizado (1,9 ml) a un tubo de fondo redondo de 2 ml.
    4. Centrifugar a 200 x g durante 1,5 min a 4 °C para eliminar el tejido y los vasos sanguíneos no disociados14. El sobrenadante contiene los núcleos; Deseche la bolita de tejido no disociado.
    5. Después de humedecer previamente un filtro celular de 30 μm con 100 μL de tampón de lisis, y filtrar el sobrenadante a través del filtro celular en un tubo cónico de 15 ml. Luego, transfiera la mezcla que contiene núcleos a un tubo de fondo redondo de 2 ml.
    6. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. El pellet contiene núcleos.
    7. Resuspender el pellet nuclear en 250 μL de tampón de lisis helada haciendo vórtices brevemente a velocidad moderada a alta. Lleve el volumen hasta 1,75 ml añadiendo 1,5 ml de tampón de lisis. Mezclar suavemente y descansar la suspensión nuclear sobre hielo durante 5 min.
    8. Granular los núcleos por centrifugación a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet nuclear. Resuspender el pellet en 200 μL de tampón de almacenamiento helado y vorátice brevemente para resuspender completamente el pellet nuclear.
    9. Reservar el 10% del pellet resuspendido (20 μL) como muestra de núcleos de entrada para análisis posteriores.
    10. Tome el pellet de núcleos resuspendidos y enrase el volumen a 2.0 ml con NPB helado. Proceda a aislar los núcleos marcados utilizando el método de purificación basado en afinidad INTACT.
  3. Aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACTOS)
    1. Vierta las perlas de estreptavidina en el vial durante 30 s a velocidad media para asegurarse de que estén completamente resuspendidas. Agregue 30 μL de perlas resuspendidas para cada muestra en un tubo de fondo redondo de 2 ml (las perlas para hasta 10 muestras se pueden lavar en un solo tubo), agregue 1 ml de NPB y resuspenda bien con pipeteo.
    2. Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 1 minuto para separar las perlas. Deseche el sobrenadante y retire el tubo del imán. Resuspender las perlas magnéticas lavadas en 1 ml de NPB.
    3. Repita el paso de lavado para un total de tres lavados. Después del lavado final, resuspender las perlas en el volumen inicial de NPB (30 μL por muestra).
    4. Añadir 30 μL de perlas lavadas a la suspensión nuclear de 2 ml a partir de la etapa 2.2.10. Resuspenda bien la mezcla de perla-núcleo pipeteando e invirtiendo suavemente el tubo.
    5. Coloque los tubos en un mezclador giratorio en una cámara frigorífica o refrigerador durante 30 minutos a baja velocidad. Incubar las muestras de entrada sin cuentas en las mismas condiciones.
    6. Coloque los tubos con la suspensión nuclear y las perlas en el imán, y separe los núcleos biotinilados unidos a las perlas de estreptavidina (fracción positiva) de la fracción negativa de los núcleos. Deje que las perlas se separen en el imán durante 3 minutos.
    7. Retire el sobrenadante, pase la fracción negativa a un tubo fresco de 2.0 ml y reserve en hielo. Para cada tubo de fracción positiva, retire el tubo del imán y vuelva a suspender el contenido en 1 ml de NPB.
    8. Coloque el tubo en el imán durante 1 minuto y deseche el sobrenadante. Retire el tubo del imán y vuelva a suspender la mezcla de perla y núcleos lavada en 1 ml de NPB.
    9. Repita el paso 2.3.8 para un total de tres lavados. Después de completar tres lavados, resuspender la mezcla de fracción positiva de perla-núcleo en 30 μL de NPB.
    10. Para cada tubo de fracción negativa, centrifugar la suspensión nuclear a partir del paso 2.3.7 a 500 x g durante 7 min a 4 °C. Aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender la fracción negativa del pellet de núcleos en 30 μL de NPB.
    11. Almacene los núcleos de la entrada (paso 2.2.9), la fracción negativa (paso 2.3.10) y la fracción positiva (paso 2.3.9) en un congelador de −80 °C hasta que estén listos para el aislamiento nuclear de ADN o ARN.
      NOTA: Los núcleos no deben congelarse para protocolos que requieran núcleos intactos como entrada (es decir, ensayo para cromatina accesible a transposasa, inmunoprecipitación de cromatina).

3. Aislamiento de ARNm de tipos específicos de células ováricas

  1. Preparación de los búferes
    1. Base tampón TRAP: Prepare 100 mL de base tampón TRAP combinando 78.8 mL de agua libre de RNasa, 5 mL de 1 M Tris-HCl (concentración final: 50 mM Tris [pH 7.5]), 5 mL de 2 M KCl (100 mM KCl), 1.2 mL de 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) y 10 mL de 10% NP-40 (1% NP-40). Conservar a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
    2. Base tampón con alto contenido de sal: Prepare 100 ml de base tampón con alto contenido de sal combinando 68,8 ml de agua libre de RNasa, 5 ml de 1 M de Tris-HCl (concentración final: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 ml de 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 ml de 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) y 10 ml de 10% de NP-40 (1% NP-40). Conservar a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
    3. Tampón de homogeneización TRAP (completo): Prepare 1,5 ml por muestra el día de la recolección de tejido. Preparar 10 ml de tampón de homogeneización de TRAP combinando 10 ml de base tampón TRAP (a partir del paso 3.1.1) con 10 μL de cicloheximida de 100 mg/ml (concentración final: 100 μg/ml de cicloheximida), 10 mg de heparina sódica (1 mg/ml de heparina sódica), 20 μL de DTT 0,5 M (DTT de 1 mM), 50 μL de inhibidor de la RNasa de 40 U/μL (inhibidor de la RNasa de 200 U/ml), 200 μL de espermidina 0,1 M (espermidina 2 mM) y un comprimido inhibidor de la proteasa libre de EDTA (1x).
    4. Tampón de lavado bajo en sal (completo): Haga 1.5 ml por muestra el día de la recolección de tejido. Para producir 10 ml de tampón de lavado con bajo contenido de sal, combine 10 ml de base tampón TRAP (del paso 3.1.1) con 10 μL de cicloheximida de 100 mg/ml (cicloheximida de 100 μg/ml) y 20 μL de DTT 0,5 M (DTT de 1 mM).
    5. Tampón de lavado con alto contenido de sal (completo): Haga 1.5 ml por muestra en el segundo día de aislamiento de TRAP. Para producir 10 ml de tampón de lavado con alto contenido de sal, combine 10 ml de base tampón con alto contenido de sal (del paso 3.1.2) con 10 μL de cicloheximida de 100 mg/ml y 20 μL de DTT de 0,5 M.
  2. Realización de la purificación de afinidad ribosómica (TRAP) de traducción
    1. Recoger el otro ovario de un ratón Cyp17-NuTRAP (u otro Cre-NuTRAP relevante) y colocarlo en un tubo libre de RNasa de 1,5 ml que contenga 100 μL de tampón de homogeneización TRAP helado (del paso 3.1.3). Picar el ovario en ocho partes dentro del tampón con microtijeras de apertura automática.
    2. Use puntas de diámetro ancho para transferir el ovario y 100 μL de tampón de homogeneización a un homogeneizador de vidrio Dounce. Homogeneizar 10x-20x con el mortero suelto A. Añadir 400 μL de tampón de homogeneización TRAP, mortero de lavado A.
    3. Transfiera el homogeneizado a un tubo de fondo redondo de 2 ml. Lave el homogeneizador Dounce con 1 ml adicional de tampón de homogeneización TRAP y transfiera el volumen lavado al tubo de fondo redondo de 2 ml.
    4. Centrifugar el homogeneizado a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante aclarado a un tubo fresco de fondo redondo de 2 ml. Deseche el pellet.
    5. Transfiera 100 μL del homogeneizado aclarado a un tubo fresco de fondo redondo de 2 ml y reserve como entrada en hielo.
    6. Incubar el resto del homogeneizado aclarado (a partir de la etapa 3.2.4) con un anticuerpo anti-GFP (5 μg/ml) durante 1 h a 4 °C mientras gira de extremo a extremo. Incubar la muestra de entrada en las mismas condiciones.
    7. En los últimos 15 minutos de la incubación, lavar las perlas magnéticas de proteína G en el tampón de lavado con bajo contenido de sal siguiendo los siguientes pasos (3.2.8-3.2.11).
    8. Vortex el vial de perlas magnéticas de proteína G durante 30 s para resuspender completamente. Transfiera 50 μL de las perlas magnéticas de proteína G para cada muestra (se pueden lavar hasta 10 muestras en un tubo) en un tubo de fondo redondo de 2 ml.
    9. Agregue 500 μL de tampón de lavado bajo en sal a las perlas y pipete suavemente para mezclar. Coloque el tubo en un soporte magnético durante 1 minuto para recoger las perlas contra el costado del tubo. Retire y deseche el sobrenadante.
    10. Retire el tubo del soporte magnético y agregue 1 ml de tampón de lavado con bajo contenido de sal al tubo. Pipetear suavemente para mezclar. Coloque el tubo en un soporte magnético durante 1 minuto para recoger las perlas contra el costado del tubo. Retire y deseche el sobrenadante.
    11. Repita el paso 3.2.10 para un total de tres lavados. Después del lavado final, retire el tubo de la rejilla magnética y vuelva a suspender las perlas en el volumen inicial de tampón de lavado con baja sal (50 μL por muestra).
    12. Transfiera las perlas lavadas resuspendidas (50 μL) a la mezcla de muestra de antígeno/anticuerpo, e incube a 4 °C durante la noche mientras gira en un mezclador de extremo a extremo. Incubar las muestras de entrada girando de extremo a extremo a 4 °C durante la noche para mantener condiciones equivalentes.
    13. Después de la incubación nocturna, retire los tubos del rotador y separe las perlas magnéticas con los ribosomas/ARN objetivo (fracción positiva) del sobrenadante (fracción negativa) utilizando el soporte magnético durante 2,5-3 min. Aspire la fracción negativa, colóquela en un tubo fresco de fondo redondo de 2 ml y déjela a un lado en hielo mientras procesa la fracción positiva.
    14. Añadir 500 μL de tampón de lavado con alto contenido de sal (desde el paso 3.1.5) al tubo con la fracción positiva, y pipetear suavemente para mezclar. Coloque el tubo en un soporte magnético mantenido sobre hielo durante 1 minuto para separar las cuentas. Deseche el sobrenadante y retire el tubo del imán.
    15. Repita el paso 3.2.14 para un total de tres lavados. Después del lavado final, resuspender las perlas en 350 μL de tampón de lisis de ARN suplementado con 3,5 μL de 2-mercaptoetanol (BME). Incubar los tubos a temperatura ambiente mientras se mezclan durante 10 minutos a 900 rpm en un agitador digital.
    16. Separe las perlas de la solución que ahora contiene los ribosomas/ARN diana con un soporte magnético durante 1 minuto a temperatura ambiente. Recoja la fracción positiva eluyida (sobrenadante) en un tubo fresco de 1,5 ml y agregue 350 μL de etanol al 100%. Invertir para mezclar. Proceda al aislamiento de ARN.
    17. Opcional: Para aislar el ARN de la muestra de entrada (paso 3.2.5) y la fracción negativa (paso 3.2.13), transfiera 100 μL de las fracciones de entrada y negativa a tubos frescos de 1,5 ml. Añadir 350 μL de tampón de lisis de ARN suplementado con 3,5 μL de BME a cada muestra. Invertir para mezclar. Agregue 250 μL de etanol al 100% a cada tubo e invierta para mezclar. Proceda al aislamiento de ARN.
  3. Aislamiento de ARN
    1. Transfiera 700 μL de la fracción positiva y, opcionalmente, la fracción de entrada y/o negativa a una columna de espín de ARN. Siga las instrucciones del fabricante para aislar el ARN de la columna de centrifugado.

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Resultados

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En la figura 1 se muestra un esquema de los protocolos TRAP e INTACT. Aquí la especificidad del modelo de ratón Cyp17-NuTRAP para las células del estroma ovárico/teca se demuestra mediante imágenes inmunofluorescentes y RNA-Seq a partir de ARN aislado en TRAP. Primero, se realizaron imágenes de inmunofluorescencia de la señal de eGFP en el ovario y la localización de la señal de eGFP a las células tecales y estromales. Brevemente, las secciones de 5 μm fueron desparafinadas con un gradiente ...

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Discusión

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El modelo de ratón NuTRAP 6 es un poderoso enfoque de etiquetado transgénico para la interrogación pareada del transcriptoma y el epigenoma de tipos de células específicas que se pueden adaptar a cualquier tipode célula con un controlador Cre disponible. Aquí, demostramos la especificidad del modelo de ratón Cyp17-NuTRAP para dirigirse a la teca ovárica y las células del estroma. El modelo Cyp17-NuTRAP se puede utilizar para dilucidar aún más los mecanismos epigenéticos específicos de las tecas y ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) y Presbyterian Health Foundation. Este trabajo también fue apoyado en parte por el premio MERIT I01BX003906 y un premio del Programa de Evaluación de Equipos Compartidos (ShEEP) ISIBX004797 de los Estados Unidos (EE. Departamento de Asuntos de Veteranos, Servicio de Investigación y Desarrollo de Laboratorios Biomédicos. Los autores también desean agradecer al Centro de Genómica Clínica (OMRF) y al Imaging Core Facility (OMRF) por la asistencia y el uso del instrumento.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,1 M EspermidinaSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL CicloheximidaSigma-AldrichC4859-1ML
2-mercaptoetanolSigma-AldrichM3148
30 y micro; Filtro de células M Miltenyi Biotec130-098-458
All Prep ADN/RNA Mini KitQiagen80204
anticuerpo anti-GFPAbcamAb290Para TRAP e IHC (Conejo policlonal a GFP)
Tampón RLTQiagen79216Tampón de lisis de ARN en
protocolo cOmplete, mini, tableta inhibidora de proteasa sin EDTARoche11836170001para la homogeneización de TRAP Buffer
Cyp17iCre modelo de ratónThe Jackson Laboratory28547B6; SJL-Tg (Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 imánInvitrogen12321D
Cebadores de genotipadoIDTGenérico personalizadoCre - Jackson Protocolo de laboratorio 22392, cebadores: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - Protocolo de laboratorio Jackson 30847, cebadores: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - Protocolo de laboratorio Jackson 21509, cebadores: 21306, 24493, 32625, 32626
Cóctel de inhibidores de proteasa Halt (100X)Thermo Scientific1861278para tampón NPB
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 y micro; m diámetro del cordón
MixMateEppendorfde 5353000529
núcleos: Núcleos EZ PrepSigma-AldrichNuc101Contiene tampón de lisis de núcleos y tampón de almacenamiento de núcleos
1 m HEPESGibco15630-080
5 m NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0,5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0,5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
modelo de ratón NuTRAPThe Jackson Laboratory29899B6; 129S6-GT(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT Formato sin pesoThermo ScientificA39255
Proteína G DynabeadsThermoFisher10004Dpara TRAP
RNaseOUTInvitrogen 10777019
Heparina de sodioFisher ScientificBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
Rotor de tubo VWRFisher ScientificNC9854190
Kit de aislamiento

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
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