Detección y cuantificación del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) en plasma humano mediante un ensayo inmunoabsorbente modificado ligado a enzimas

El péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) es un neuropéptido de 37 aminoácidos que está presente en fibras neuronales con localización perivascular, así como en tejidos no neuronales. Las dos formas de CGRP, α- y β-CGRP, comparten más del 90% de homología y comparten funciones fisiológicas; sin embargo, la αCGRP se encuentra en el sistema nervioso central y periférico, mientras que la βCGRP se encuentra en el sistema nervioso entérico ^1,2. Tras la activación de los nociceptores y la exocitosis dependiente de calcio, CGRP se libera de las neuronas, induciendo inflamación neurogénica estéril que involucra vasodilatación arterial y extravasación de proteínas plasmáticas 3,4,5,6,7. A partir de aquí, CGRP aparece en los vasos postcapilares y puede ser un biomarcador para enfermedades que causan activación nociceptiva aferente, como la migraña 8,9,10,11. Cabe destacar que CGRP también ha sido implicado en COVID-19 a través de su papel en la angiogénesis y la modulación inmune, y puede predecir la evolución desfavorable de la enfermedad^12,13. Por lo tanto, un protocolo para la cuantificación precisa de CGRP en plasma humano podría tener un valor amplio.

La mayor atención se ha prestado quizás al papel de CGRP en la migraña. Sobre la base de estudios preclínicos y clínicos, CGRP se ha presentado como un posible biomarcador para la migraña y como un objetivo para el tratamiento 3,4,5,6,7,8,9,10. Algunos estudios han encontrado una elevación de CGRP en cohortes con migraña episódica en relación con los participantes control^10,14,15. El éxito de los inhibidores de CGRP en ensayos clínicos para el tratamiento de la migraña parece implicar CGRP elevada como un factor causal para las migrañas. Sin embargo, no todos los investigadores han corroborado estos resultados^16,17,18,19. Además, el papel de CGRP en los síntomas de migraña sin dolor de cabeza aún no se ha dilucidado; el trabajo actual fue motivado por el deseo de comprender el papel de CGRP en los síntomas vestibulares de la migraña.

Los datos inconsistentes de inmunoensayo CGRP en la literatura podrían deberse a varias razones. En primer lugar, la vida media de CGRP en la vasculatura periférica es de 6,9 min 20, debido a la actividad de las serina proteasas 21, enzimas degradadoras de insulina y otras metaloproteasas 22, endopeptidasas neutras 23 y enzima convertidora de endotelina-1 ²⁴. En segundo lugar, los detalles técnicos variables de los inmunoensayos utilizados para cuantificar CGRP no se describen completamente en dichos estudios. Finalmente, la falta de estandarización de la metodología de inmunoensayo complica aún más el panorama.

Este artículo describe un protocolo de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas modificado (ELISA) que permite la purificación y cuantificación precisa de α y βCGRP en plasma humano. Los anticuerpos del kit no son reactivos cruzados con amilina, calcitonina o sustancia P. Este protocolo ha sido sometido a los experimentos de validación necesarios, como el pico y la recuperación y la linealidad de la dilución, cuyos datos se presentan aquí. Tal protocolo ELISA CGRP que ha sido objeto de validación no ha sido descrito previamente en la literatura. Este protocolo se puede utilizar para cuantificar CGRP en plasma humano en el contexto de la migraña, así como cardiológicas^2,25, dermatológicas 26, obstétricas 27, reumatológicas^28,29, musculoesqueléticas 30,31, endocrinas ^32,33 y virales^12,13 en las que CGRP ha sido implicada.

Este protocolo se desarrolló utilizando muestras de plasma humano de individuos consentidos con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de Johns Hopkins (NA_00092491).

1. Recogida y preparación de muestras

1. Recolectar 5 ml de sangre total de la vena antecubital mediante métodos estándar de venopunción³⁴ en un tubo de recolección de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) vacutainer de 6 ml.
2. Agregue 0.5 ml de inhibidor de la serina proteasa competitiva de aprotinina (10,000 KIU/ml) al tubo después de la recolección para bloquear la lisis del péptido objetivo. Invierta el tubo 10 veces para permitir que la aprotinina se mezcle adecuadamente con la sangre. Después, guarde los tubos en hielo hasta el siguiente paso.
3. Centrifugar el tubo a 604 x g durante 4 min a 4 °C dentro de los 60 min siguientes a la extracción de sangre.
4. Retire la fracción plasmática con una pipeta y transfiérala a crioviales estériles de fondo redondo de 2 ml.
5. Conservar inmediatamente los crioviales a -80 °C durante un máximo de 2 semanas.

2. Extracción de las muestras de plasma

1. Coloque un cartucho de extracción dentro de un tubo de centrífuga cónica de 15 ml con las crestas exteriores del cartucho apoyadas por las crestas exteriores del tubo.
2. Active el cartucho pasando primero 5 ml de metanol al 100% y luego 10 ml de agua ultrapura a través del cartucho.
   1. A medida que el fluido pasa a través del cartucho a través del flujo impulsado por la gravedad, se acumulará en el tubo.
   2. Deseche el exceso de líquido a medida que se acumula para asegurarse de que el líquido no envuelva el cartucho.
   3. Asegúrese de que el cartucho no se seque durante el transcurso del experimento.
3. Diluir 250 μL de plasma con 750 μL de ácido acético al 4%.
4. Pase lentamente 1 ml de solución plasmática y de ácido acético a través del cartucho.
   NOTA: Este paso debe tomar aproximadamente 30 s a través de un flujo impulsado por gravedad por cada mililitro pasado.
5. Lave el cartucho con 10 ml de ácido acético al 4%. Como se hizo anteriormente, deseche el exceso de líquido a medida que se acumula para asegurarse de que el líquido no envuelva el cartucho.
6. Después de que se libere la última gota de ácido acético del cartucho, retire el cartucho del tubo y colóquelo en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 15 ml.
7. Prepare una solución 10:1 de metanol al 100% y ácido acético al 4% mezclando 2,7 ml de ácido acético al 4% y 0,3 ml de metanol al 100%. Utilice esta opción para eluyer el CGRP pasando esta solución a través del cartucho 1 ml a la vez. Haga una pausa de 25 minutos entre cada mililitro de solución pasada. NO tire el eluyente.
8. El tubo contendrá 3 ml del líquido eluyido 25 minutos después de que haya pasado el último mililitro de la solución de metanol y ácido acético. Coloque cada 1 ml del eluyente en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
   NOTA: Esto debería producir tres tubos de microcentrífuga de cada cartucho.
9. Coloque cada tubo en una mini centrífuga durante 1 s para asegurarse de que todo el eluyente esté en el fondo de cada tubo.
10. Secar todas las muestras por centrifugación al vacío a 4 °C (ajustado a la función concentrador, para soluciones acuosas, a 1.400 rpm; la fuerza g varía según la posición de los tubos y, por lo tanto, oscila entre 130 y 250 x g).
    NOTA: El tiempo necesario para que la centrífuga de vacío seque las muestras dependerá del tipo de tubo de microcentrífuga utilizado.
11. Inmediatamente antes de proceder al procedimiento de ensayo (paso 4.1), reconstituir la muestra previamente seca con tampón de inmunoensayo enzimático (EIA) (véase la tabla de materiales) descongelado a temperatura ambiente (RT) o 20 °C.
    NOTA: El volumen de tampón EIA utilizado para reconstituir la muestra seca debe ser igual al volumen de muestra original, o 250 μL.

3. Preparación de la placa ELISA - bloqueo para limitar la unión no específica

1. Agregue 250 μL de solución salina tamponada con tris (TBS)/tampón de bloqueo de gelatina de pescado a cada pocillo en la placa.
2. Coloque una hoja de cubierta sobre el plato e incube durante 2 h en RT.
3. Retire la hoja de cubierta y vacíe la placa por inversión o aspiración con una pipeta multicanal. Luego, seque el plato en una toalla de papel para desechar cualquier rastro de líquido.
4. Seque la placa dejando la placa en una campana de flujo laminar durante 10 minutos.
5. Después de que la placa esté visiblemente seca, colóquela en una bolsa de aluminio sellada con un sobre desecante de gel de sílice y guarde la bolsa a -20 °C durante 24 h.
   NOTA: Las placas deben usarse dentro de las 4 semanas posteriores a la incubación de la placa.

4. Antes del procedimiento de ensayo

1. Prepare los reactivos (tampón EIA, estándar CGRP, control de calidad CGRP, trazador CGRP, tampón de lavado) según las instrucciones del kit. Prepare el reactivo de Ellman solo después de que finalice el período de incubación de 16-20 h.
2. Descongele todas las muestras y reactivos a RT antes de realizar el resto del protocolo.

5. Procedimiento de ensayo

1. Enjuague cada pocillo en la placa bloqueada cinco veces con un tampón de lavado proporcionado por el kit (300 μL/pocillo). Para cada enjuague, haga una pausa de 30 s después de colocar el tampón de lavado en los pocillos, luego deseche el líquido o aspire con una pipeta multicanal.
2. Después del enjuague final, retire todo el tampón de los pocillos por inversión (invirtiendo la placa para expulsar el líquido dentro de los pocillos) o aspiración con una pipeta multicanal. Seque las últimas gotas en una toalla de papel y golpee la placa invertida hasta que todo el líquido se elimine visiblemente de los pozos.
3. Reservar al menos dos pozos sin reactivos o amortiguadores para que se conozcan como pozos "en blanco". Luego, reserve al menos otros dos pozos para la unión no específica (NSB).
4. Dispense 100 μL de tampón EIA en cada pocillo NSB.
5. Dispensar 100 μL de los patrones CGRP por duplicado en pozos apropiados.
6. Dispensar 100 μL de muestras (reconstituidas en tampón EIA) y control de calidad por duplicado en pozos apropiados.
7. Dispense 100 μL de trazador CGRP (anticuerpo anti-CGRP unido a la acetilcolinesterasa) a cada pocillo que contenga NSB, estándares CGRP, muestras y control de calidad. No dispense trazador a los pocillos "en blanco".
8. Cubra la placa con una hoja de cubierta transparente, sellando cada pocillo de modo que las muestras y los reactivos en cada pocillo no se evaporen significativamente. Incubar la placa durante 16-20 h a 4 °C.
9. Una vez completada la incubación, reconstituya el reactivo de Ellman según las instrucciones del kit.
10. Invierta la placa para eliminar todo el líquido. Enjuague cada pocillo (como se describió anteriormente) tres veces con 300 μL de tampón de lavado.
11. Después del tercer enjuague, retire el líquido de las placas, coloque el plato en un plato agitador y agite a 120 rpm durante 2 minutos.
12. Lave el plato tres veces más. Después del enjuague final, retire todo el tampón de los pocillos por inversión o aspiración con una pipeta multicanal. Seque las últimas gotas de líquido en una toalla de papel y golpee la placa invertida hasta que todo el líquido se elimine visiblemente de los pozos.
    NOTA: Los tres lavados adicionales descritos en este paso pueden no ser necesarios si se utiliza una lavadora de microplacas ELISA.
13. Dispensar 200 μL de reactivo de Ellman en cada pocillo (sin incluir los pocillos "en blanco").
14. Cubra la placa con una nueva hoja de cubierta y envuélvala en papel de aluminio para evitar cualquier exposición a la luz. Incubar en la oscuridad a RT durante 1 h.
15. Asegúrese de que no haya líquido en la parte posterior de la placa que pueda confundir la lectura del espectrofotómetro limpiando la parte posterior con una toalla de papel seca.
16. Lea la placa para la absorbancia a 405 nm (color amarillo).

6. Análisis de datos

1. Calcule la absorbancia promedio para cada "Blank", NSB, estándar, control de calidad y las muestras.
2. Reste los valores de absorbancia promedio de NSB de los valores estándar, control de calidad y absorbancia de la muestra.
3. Trazar la absorbancia en el eje y y la concentración en el eje x. Construya una curva estándar utilizando un modelo de regresión logística de cuatro parámetros.
4. Una vez que se construye la curva, use la ecuación de la curva para determinar las concentraciones interpoladas para el control de calidad y las muestras, que se pueden leer en el eje x.
   NOTA: La curva estándar se valida sólo si la concentración interpolada calculada para el control de calidad está dentro del 25% de la concentración esperada (normalmente 125 pg/ml, pero véase la etiqueta del vial de control de calidad).

Hay varios pasos clave en el protocolo que deben destacarse. En primer lugar, la aprotinina, un inhibidor de la serina proteasa, debe agregarse a las muestras de sangre total inmediatamente después de la recolección para evitar una mayor degradación enzimática de CGRP. Se ha demostrado que las serina proteasas desempeñan un papel en el metabolismo de CGRP, y un estudio previo también ha utilizado aprotinina en la cuantificación de CGRP en humanos21,35. Si no se usan inhibidores de la proteasa, y la preparación de la muestra toma más de 60 minutos, entonces se puede esperar una disminución de los niveles de CGRP al realizar ELISA. En segundo lugar, la extracción en fase sólida antes de ELISA concentra CGRP en el eluyente y elimina las moléculas potencialmente interferentes de la matriz plasmática. Este paso de extracción aumenta el rendimiento de CGRP en experimentos de pico y recuperación (más adelante en la siguiente sección). La centrifugación al vacío en una cámara frigorífica después de la extracción limita aún más la pérdida de CGRP. En tercer lugar, antes de ELISA, las placas de microtitulación deben bloquearse mediante un tampón de bloqueo. Esto permite la adsorción pasiva de proteínas no específicas en el tampón a los sitios de unión restantes en las placas, reduciendo así la señal de fondo. El bloqueo ayuda a reducir los rendimientos irrealmente altos de CGRP.

Los experimentos de pico y recuperación determinan si la detección de CGRP se ve afectada por las diferencias entre el diluyente de curva estándar (aquí, tampón EIA) y la matriz de muestra experimental (aquí, plasma). El plasma y/o el suero pueden contener moléculas que bloquean la unión de anticuerpos a CGRP o degradan el péptido, lo que interfiere con la capacidad del ensayo para detectar y cuantificar la concentración inicial de CGRP con precisión. Con este fin, agregamos cantidades conocidas de CGRP a las muestras de plasma, el paso de "pico", y calculamos cuánto CGRP se "recuperó" después de la extracción y ELISA. El stock de CGRP se obtuvo del fabricante y se almacenó en un congelador de -20 °C hasta su uso.

En la linealidad de las pruebas de dilución, una muestra se diluye en serie y se calculan las concentraciones de CGRP para cada dilución. Si las muestras diluidas no presentan disminuciones lineales apropiadas en la concentración de CGRP, esto indicaría que el tampón EIA o el plasma interfieren con la detección de CGRP a algunas concentraciones o que la curva estándar no es precisa en el rango afectado. Al realizar el experimento de pico y recuperación descrito anteriormente, diluimos en serie las muestras "con púas"; se aumentó una muestra de plasma para obtener una concentración de CGRP de 200 pg/ml y posteriormente se diluyó la muestra a 100 pg/ml y luego a 50 pg/ml.

Las muestras de plasma de tres participantes sin antecedentes de dolor de cabeza o síntomas neurológicos cardiovasculares, respiratorios o recientes se enriquecieron con diferentes concentraciones de CGRP. El protocolo se ejecutó para estas muestras, además de las muestras de control sin picos. La Figura 1 muestra un ejemplo de un mapa de placas para picos y recuperación y linealidad de experimentos de dilución. Se realizó un ajuste logístico de cuatro parámetros para crear una curva estándar que permitiera el ajuste más allá del rango lineal (Tabla 1 y Figura 2). Las tasas de recuperación se calcularon para cada muestra con picos y estuvieron dentro del rango aceptable (Tabla 2). La linealidad de la dilución se demostró en las muestras con púas (Figura 3). La Tabla 3 muestra los resultados obtenidos de un experimento fallido de pico y recuperación llevado a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante y antes de la inclusión de los pasos adicionales para bloquear la unión no específica. Estos datos muestran tasas de recuperación superiores al límite superior del 125%, lo que indica la presencia de una vinculación no específica. Después de agregar los pasos en el protocolo para bloquear la placa usando un tampón de bloqueo (pasos 3.1-3.5), pudimos reducir este efecto y lograr valores de recuperación aceptables (Tabla 2). En tres pacientes sin migraña o síntomas vestibulares, encontramos que la concentración promedio de CGRP en plasma fue de 1,68 ± 0,13 pg/mL. Los experimentos futuros deben tener como objetivo utilizar la metodología actual en una escala más grande de pacientes de control.

Figura 1: Ejemplo de mapa de placas. Cada placa debe contener estándares, muestras, espacios en blanco y pocillos NSB, todo por duplicado o triplicado. Los pocillos en blanco no deben contener líquido, y los pocillos NSB deben contener tampón de inmunoensayo enzimático patentado, anticuerpo secundario ligado a enzimas y reactivo de Ellman. Los valores de absorbancia promedio para los pozos NSB deben restar de los valores de absorbancia del estándar antes de crear la curva estándar. Los valores de absorbancia promedio para los pozos NSB también deben restarse de los valores de absorbancia de las muestras, antes de calcular el porcentaje de recuperación. No hay efecto de la posición de la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplo de una curva estándar de regresión logística de cuatro parámetros (4PL). Esta curva estándar se describe matemáticamente mediante una ecuación en una forma similar a la que se ve en la Tabla 1. Una curva de regresión 4PL se ajusta mejor a los sistemas biológicos en comparación con las curvas lineales. Esta curva y ecuación se utilizan para interpolar controles de calidad y muestras en la misma placa en la que se creó el estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Linealidad del gráfico de líneas de dilución que muestra muestras aumentadas a 200 pg / ml, luego diluidas en serie 1: 2 y 1: 4. Estos datos demuestran linealidad en una amplia gama de diluciones, lo que indica que el método de ensayo es preciso en un amplio rango de concentraciones de CGRP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetro	Valor
X50	294.75
Ecuación
Forma de ecuación

Tabla 1: Ejemplo de una ecuación de curva estándar de regresión logística de cuatro parámetros (4PL) con títulos X50. Una curva de regresión 4PL se adapta a la complejidad observada en los sistemas biológicos. Esta curva se utilizó para analizar los resultados del ELISA, ya que es más adecuado que la regresión lineal.

Tabla 2: Resultados de un experimento exitoso de pico y recuperación de tres participantes de control debido a la falta de extracción en fase sólida y bloqueo de placas. El porcentaje de rendimiento para todas las muestras con púas cayó dentro del 20% del rendimiento ideal del 100%, lo que indica que la detección de CGRP no se ve afectada por la matriz de muestra experimental de plasma.

Tabla 3: Resultados de un experimento fallido de pico y recuperación de tres participantes de control debido a la falta de bloqueo de la placa. El porcentaje de rendimiento para las muestras con púas cayó muy por encima del límite superior del rendimiento del 120%, lo que indica que el ensayo puede ser corrompido por NSB. Después de obtener estos resultados, agregamos los pasos 3.1-3.5 en el protocolo para bloquear NSB en la placa antes del ensayo.

Tabla 4: Resultados de un experimento fallido de pico y recuperación de tres participantes de control. El porcentaje de rendimiento para las muestras con picos cayó muy por debajo del límite inferior del rendimiento del 80%, lo que indica que se necesitaba una mayor optimización para abordar la posible degradación y los procesos de unión competitivos. Estos resultados provienen del ensayo ELISA competitivo de otro fabricante, con un límite inferior de detección de 2,23 pg/ml, y el CV intraensayo < del 10% y el CV entre ensayos < del 12%.

Los autores no tienen más revelaciones que agregar.