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Artículo de método

Aplicación del sistema inteligente de detección de fagos y pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento y lar índice de resistencia a los antimicrobianos

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DOI:

10.3791/64785

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21 de julio de 2023

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1Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding, Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, P.R. China, Key Laboratory of Livestock and Poultry Multi-omics of MARA, 2Department of Genetic and Genomes Biology, University of Leicester, 3College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos el principio, la estructura y las instrucciones del sistema inteligente de detección de fagos / pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento. Su aplicación se ilustra utilizando como ejemplo la Salmonella aislada de aves de corral en Shandong, China. Se calcula el índice Lar y se discute exhaustivamente su importancia en la evaluación de la resistencia a los antimicrobianos.

Resumen

Para mejorar la eficiencia de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) y el cribado de alto rendimiento de fagos para bacterias resistentes y para reducir el coste de detección, se desarrolló un sistema inteligente de cribado de AST/fagos de alto rendimiento, que incluye un inoculador de matriz de 96 puntos, un convertidor de adquisición de imágenes y el software correspondiente, de acuerdo con los criterios AST y los puntos de ruptura de resistencia (R) formulados por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI). La AST y las estadísticas de las distribuciones de la concentración inhibitoria mínima (CMI) (de R/8 a 8R) de 1.500 cepas de Salmonella aisladas de aves de corral en Shandong, China, frente a 10 agentes antimicrobianos se llevaron a cabo mediante el sistema inteligente de cribado de ast/fagos de alto rendimiento. El índice Lar, que significa "menos antibiosis, menos resistencia y residual hasta poca antibiosis", se obtuvo calculando la media ponderada de cada CMI y dividiéndola por R. Este enfoque mejora la precisión en comparación con el uso de la prevalencia de resistencia para caracterizar el grado de resistencia a los antimicrobianos (RAM) de cepas altamente resistentes. Para las cepas de Salmonella con alta resistencia a los antimicrobianos, los fagos líticos se seleccionaron eficientemente de la biblioteca de fagos mediante este sistema, y se calculó y analizó el espectro de lisis. Los resultados mostraron que el sistema inteligente de cribado de fagos y AST de alto rendimiento era operable, preciso, altamente eficiente, económico y fácil de mantener. En combinación con el sistema de monitoreo de la resistencia a los antimicrobianos veterinarios de Shandong, el sistema era adecuado para la investigación científica y la detección clínica relacionada con la resistencia a los antimicrobianos.

Introducción

Dado que los agentes antimicrobianos se han utilizado ampliamente para prevenir enfermedades infecciosas bacterianas, la resistencia a los antimicrobianos (RAM) se ha convertido en un problema de salud pública mundial1. La lucha contra la resistencia a los antimicrobianos es la misión principal actual de seguimiento de la resistencia a los antimicrobianos de patógenos epidemiológicos y la terapia sinérgica de agentes antimicrobianos sensibles y bacteriófagos líticos2.

Las pruebas de sensibilidad antimicrobiana (AST) in vitro son el pilar para monitorizar el tratamiento y detectar el nivel de RAM. Es una parte importante de la farmacología antimicrobiana y la base crítica de la medicación clínica. El Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) de los Estados Unidos y el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) han formulado y revisado los criterios internacionales de AST y han modificado y complementado continuamente los métodos AST y los puntos de corte para determinar la CMI de una determinada combinación de "organismo-agente antimicrobiano" como sensible (S), resistente (R) o intermedio (I)3, 4.

Desde la década de 1980 hasta la década de 1990, los instrumentos automáticos de dilución de microcaldo se desarrollaron rápidamente y se aplicaron a la práctica clínica, con ejemplos como Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM y Cobasbact 5,6,7. Sin embargo, estos instrumentos eran costosos, requerían consumibles de alto costo y sus rangos de detección fueron diseñados para la medicación clínicade pacientes 5,6,7. Por estas razones, no son adecuados para el examen clínico veterinario y la detección de grandes cantidades de cepas altamente resistentes. En este estudio, se desarrolló un sistema inteligente de cribado de AST/fagos de alto rendimiento, que incluye un inoculador de matriz de 96 puntos (Figura 1), un convertidor de adquisición de imágenes (Figura 2) y el software correspondiente8, para realizar AST para un lote de cepas de bacterias contra múltiples agentes antimicrobianos a la vez mediante el método de dilución en agar. Además, el sistema también se utilizó para detectar y analizar los patrones de lisis de los fagos frente a bacterias resistentes a los antimicrobianos9, y los fagos líticos se seleccionaron de forma eficiente de la biblioteca de fagos. Se comprobó que este sistema era eficiente, asequible y fácil de operar.

figure-introduction-1
Figura 1: Diagrama estructural del inoculador de matriz de 96 puntos. 1: Placa de clavija de inoculación; 2: Operador de telefonía móvil; 3: Bloque de semillas; 4: Placa incubada; 5: Base; 6: Mango de operación; 7: Pin de límite. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-introduction-2
Figura 2: Diagrama estructural del convertidor de adquisición de imágenes. 1: Concha; 2: Pantalla de visualización; 3: Sala de adquisición de imágenes; 4: Base de la placa de detección; 5: Tablero de detección dentro y fuera del almacén; 6: Tablero de control; 7: Dispositivo de conversión de adquisición de imágenes; 8: Fuente de luz; 9: Escáner de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

Las cepas de Salmonella utilizadas en este estudio se recolectaron de aves de corral en Shandong, China, después de obtener la aprobación del Comité de Bioseguridad del Instituto de Ciencias Animales y Medicina Veterinaria de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, China.

1. Aplicación del sistema inteligente AST de alto rendimiento8

  1. Preparación del inóculo
    1. Incubar el organismo de control de calidad Escherichia coli y 93 cepas de Salmonella para someterlas a ensayo de AST en placas de agar Mueller-Hinton (MHA) durante 16-18 h a 37 °C3.
    2. Prepare el inóculo de cada cepa para que coincida con el estándar de turbidez de McFarland de 0,5 según el método especificado en el estándar CLSI3y luego diluya 10 veces.
    3. Coloque 200 μL de solución salina normal estéril en el 1er pocillo horizontal (A1) de la placa de 96 pocillos como control negativo, dos suspensiones del organismo de control de calidad enlos pocillos horizontales 2º y3º (A2 y A3) como control positivo y control de calidad, respectivamente. Agregue 200 μL de las suspensiones de inóculo diluidas de cada tinción analizada en los 93 pocillos correspondientes en el bloque de semillas de 96 pocillos.
  2. Preparación de la placa de agar antimicrobiano
    1. Establezca los rangos de concentración de los diferentes agentes antibacterianos probados de acuerdo con el rango de cálculo del índice Lar (de 0,125R a 8R). Las concentraciones van desde el rango de control de calidad o 0.0625R (sujeto al rango inferior) hasta 8R.
      NOTA: Si no se calcula el índice Lar, el rango de concentraciones de antibióticos se puede establecer de acuerdo con las necesidades de AST.
    2. Ejecute un esquema de dilución de duplicación log2 para la solución antibiótica comenzando con una concentración de stock adecuada basada en el método de dilución en agar especificado en la norma CLSI3.
    3. Esterilice botellas de vidrio de 50 ml que contengan 18 ml de medio de agar Mueller-Hinton. Añadir 2 ml de las diluciones adecuadas de la solución antimicrobiana a 18 ml de medio fundido enfriado a 45-50 °C, mezclar bien y verter en las placas de la cabina de bioseguridad.
    4. Deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente (RT), deje un espacio debajo de la tapa de las placas incubadas y sople para secar la superficie del agar antes de inocularlo.
    5. Etiquete los tipos de agentes antimicrobianos y las concentraciones en el reverso de las placas incubadas. Coloque las múltiples placas incubadas de cada agente antimicrobiano en una pila en un orden de dilución log2-duplicado.
    6. Prepare dos placas de agar sin fármacos como controles para cada agente antimicrobiano.
  3. Pasos de inoculación para el inoculador de matriz de 96 puntos
    1. Instale la placa de clavijas de inoculación esterilizada en autoclave sobre el soporte de un inoculador de matriz de 96 puntos en el gabinete de bioseguridad.
    2. Coloque el bloque de semillas preparado con cepas probadas y una placa de agar incubada en el portador móvil, con el mismo ángulo de posicionamiento para las dos placas.
    3. Empuje el transportador móvil de modo que el bloque de semillas quede directamente debajo de la placa de clavijas de inoculación.
    4. Presione la manija de operación, mueva la placa de clavijas de inoculación hacia abajo y dirija las 96 clavijas a los inóculos en 96 pocillos del bloque de semillas.
    5. Suelte la manija de operación con control, luego restablezca la placa del pasador de inoculación bajo la acción del resorte.
    6. Presione la manija de operación 2-3 veces para revolver bien cada inóculo y sumergirlo. Empuje y mueva la placa portadora de modo que la placa incubada quede directamente debajo de la placa de clavijas de inoculación.
    7. Presione la manija de operación, mueva la placa de clavijas de inoculación hacia abajo y deténgase durante 1-2 segundos para que las clavijas de inoculación entren en contacto con la superficie de la placa incubada por completo.
    8. Suelte la manija de operación. Con esto se completa una inoculación. Reemplace otra placa incubada y continúe el ciclo hasta que termine un grupo de placas de agar antimicrobiano.
    9. Reemplace otra placa de clavijas de inoculación y un bloque de semillas, e inocule otro grupo de cepas probadas. Realice un ciclo hasta que se completen todas las inoculaciones.
      NOTA: Inocular primero una placa de agar de control (sin agente antimicrobiano), luego la placa en orden de concentración del fármaco de baja a alta, y una segunda placa de agar de control al final para garantizar que no haya contaminación ni arrastre de agentes antimicrobianos. El volumen de inoculación se basa en el volumen de la deposición natural de cada pin de aproximadamente 2 μL.
  4. Incubación de las placas de agar antimicrobiano
    1. Incubar las placas de agar antimicrobiano inoculadas en RT hasta que la humedad de las manchas de inóculo sea absorbida por el agar.
    2. Invierta las placas e incube durante 16-20 h a 37 °C para las cepas probadas para asegurarse de que las bacterias desinhibidas formen colonias.
  5. Adquisición de imágenes y estadísticas de datos
    1. Haga doble clic en el sistema de adquisición de imágenes AST de matriz de 96 puntos para abrir el programa.
    2. Haga clic en Información de prueba en la barra de tareas. Haga clic en Nuevo para crear una nueva tarea de prueba y complete la información de acuerdo con las indicaciones, incluido el código, el nombre, la fuente, las bacterias, el número de cepas, los antibióticos y el gradiente.
    3. Haga clic en Recopilación de datos > Fotografía > elemento de prueba para seleccionar la nueva tarea creada. Haga clic en Antibióticos para seleccionar el nombre del antibiótico y haga clic en Gradiente para seleccionar la concentración inicial de este antibiótico.
    4. Haga clic en Conectar para conectarse con el convertidor de adquisición de imágenes.
    5. Coloque las placas incubadas correspondientes en la base de la placa de detección con el ángulo que falta en la parte delantera derecha para orientarse y empújelas en el convertidor de adquisición de imágenes.
    6. Haga clic en Colección para obtener las imágenes. El gradiente de antibióticos saltará automáticamente al siguiente gradiente. Coloque la siguiente placa por turnos y continúe haciendo clic en Recolección hasta que se hayan recolectado las placas para este antibiótico.
    7. Haga clic en Antibióticos y seleccione el siguiente conjunto de placas incubadas. Haga clic en Degradado para seleccionar el degradado inicial y pasar a la siguiente ronda de recopilación de imágenes.
    8. Después de completar todas las colecciones, haga clic en Enviar. El programa reconocerá automáticamente el número de píxeles blancos formateados en cada punto de inoculación de las imágenes, determinará si hay formación de colonias y convertirá las imágenes en valores MIC.
    9. Haga clic en Consulta para obtener todos los resultados de MIC de las cepas frente a los antibióticos probados.
      NOTA: El sistema inteligente AST de alto rendimiento es adecuado para determinar las CMI de grandes lotes de cepas bacterianas. El proceso de prueba, que incluye la preparación, la inoculación, la incubación y la lectura de los resultados, dura 3 días. Los tipos de antibióticos y los rangos de detección de MIC se pueden configurar de acuerdo con las necesidades respectivas, y los principales consumibles se pueden reutilizar.
  6. Cálculo del índice Lar
    1. Determine el índice Lar con precisión con la fórmula: , donde: figure-protocol-1
      CMIi: concentración mínima inhibitoria.
      El rango de distribuciones de MIC de MIC-3 a MIC3 representa concentraciones dobles en serie centradas en R: 0.125R, 0.25R, 0.5R, R, 2R, 4R y 8R.
      figure-protocol-2 es 2 i, y el rango dei es de -3 a 3.
      R: los puntos de ruptura de la resistencia de las bacterias a los agentes antimicrobianos estandarizados por CLSI.
      f: la distribución de frecuencias de la MIC.
      NOTA: El índice Lar general es la media aritmética de todos los índices Lar. Después de calcular el índice Lar, redondee el valor final a dos dígitos significativos después del punto decimal.

2. Sistema inteligente de detección de fagos de alto rendimiento9

  1. Preparación del bloque de semillas de fagos y placas incubadas de doble capa que contienen bacterias.
    1. Utilice el método de agar de doble capa10 o el método de cultivo líquido11 para fabricar diferentes fagos. Diluir a una concentración paralela adecuada con un título de 1 x 104-5 ufp/mL, y añadir 200 μL del inóculo de fagos en el bloque de semillas de 96 pocillos.
    2. Hacer placas de doble capa con bacterias (10 mL de medio de agar inferior [agar 12 g/L] y 6 mL de medio semiagar superior [6 g/L] con 100 μL de bacterias [0,5 McFarland]) para ser analizadas.
    3. Haga una placa de incubación de doble capa para cada cepa que se va a probar. Deje un espacio debajo de la tapa de la placa de doble capa y sople para secar la superficie del agar en el gabinete de bioseguridad.
  2. Prueba de cribado
    1. Coloque el bloque de semillas de fagos preparado y la placa de doble capa en el portador móvil del inoculador de matriz de 96 puntos y transfiera todos los inóculos de fagos a la superficie de semiagar. Continúe los ciclos hasta que se completen todas las cepas probadas.
    2. Deje que las placas de doble capa inoculadas permanezcan en RT hasta que la humedad en las manchas de inóculo se absorba completamente en el semiagar.
    3. Invertir las placas e incubar en condiciones adecuadas para las cepas probadas durante 4-6 h para asegurarse de que se formen manchas líticas claras.
  3. Análisis de datos
    1. Obtener y guardar la imagen del resultado experimental de cada placa de doble capa mediante el convertidor de adquisición de imágenes (pasos 1.5.4-1.5.6).
    2. Registre el número y las morfologías de las diferentes formas de manchas en una hoja de cálculo basada en las imágenes obtenidas y calcule las proporciones respectivas de los diferentes tipos de fagos.

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Resultados

Siguiendo el protocolo del sistema inteligente AST de alto rendimiento, su aplicación se ilustró con la Salmonella de aves de corral en Shandong, China, como ejemplo.

En la Figura 3 se muestra el crecimiento de cepas de Salmonella en placas de agar con ampicilina (R de 32 μg/mL) a concentraciones de 2 a 256 μg/mL determinadas por el convertidor de adquisición de imágenes. El1er pozo horizontal A1 fue el testigo negativo y no mostró cre...

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Discusión

El método de dilución en agar está bien establecido y se utiliza ampliamente. El principio del sistema AST de alto rendimiento era el del método de dilución en agar. Uno de los pasos críticos dentro del protocolo fue la transferencia precisa de alto rendimiento de 96 inóculos a la vez, que se realizó varias veces seguidas. Para completar este paso crítico, los pines del inoculador de matriz de 96 puntos eran uniformes y muy suaves. La deposición natural de cada pin fue de un volumen de aproximadamente 2 μL, que se agregó...

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Divulgaciones

Yuqing Liu et al. han presentado patentes chinas para el inoculador de matriz de 96 puntos y el convertidor de adquisición de imágenes y sus aplicaciones (número de patente ZL 201610942866.3 y número de patente ZL 201910968255.X).

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo del Proyecto Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (2019YFA0904003); Sistema Agrícola Industrial Moderno en la Provincia de Shandong (SDAIT-011-09); Proyecto de Optimización de la Plataforma de Cooperación Internacional (CXGC2023G15); Principales tareas de innovación del proyecto de innovación científica y tecnológica agrícola de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, China (CXGC2023G03).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
96 pozo  placa de cultivoBeijing lanjieke Technology Co., Ltd11510
Sistema de adquisición de imágenes AST de matriz de 96 puntosInstituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong Derechos de autor delsoftware interno Inoculador
de matriz de 96 puntos Instituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de ShandongN/AProducto patentado
AgarQingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., LtdHB8274-1
Amikacin Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdA857053
AmoxicilinaShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdA822839
AmpicilinaShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdA830931
Balanza analíticaSartoriusBSA224S
Software de cálculo automatizado para el índice Lar de AMRInstituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong Derechos deautor del software interno Bacterias
Salmonella strainsInstituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de ShandongN/AOrigen animal
Resistencia bacteriana Sistema de gestión de certificación de índice Lar V1.0Instituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de ShandongDerechos de autor
CeftiofurShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdC873619
CiprofloxacinaShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdC824343
Ácido clavulánicoShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdC824181
Mesa de trabajo limpiaEquipo de purificación de Suzhou Co., LtdSW-CJ-2D
Sulfato de colistinaShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdC805491
Placade cultivo Instituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de ShandongN/AProducto patentado
DoxiciclinaShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd
EnrofloxacinaShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdE809130
filtro 0.22 μ mMilliporeSLGP033RB
FlorfenicolShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdF809685
GentamicinaShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdG810322
Botella de vidrio 50 mLXuzhou Qianxing Glass Technology Co., LtdQX-7
Sistema de detección de resistencia de alto rendimiento V1.0Instituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong Derechos deautor
Convertidorde adquisición de imágenes Instituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de ShandongN/AProducto patentado
MeropenemShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdM861173
AgarMueller-HintonParque industrial de alta tecnología de Qingdao Haibo Biotechnology Co., LtdHB6232
Placa de Petri de 60 mm x 15 mmEquipo bioquímico de Qingdao Jindian Co., Ltd16021-1
Placa de Petri de 90 mm x 15 mmEquipo bioquímico de Qingdao Jindian Co., Ltd16001-1
Salmonella fagosInstituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de ShandongN/A Incubadora
ShakerShanghai Minquan Instrument Co., LtdMQD-S2R
TurbidímetroShanghai XingBai Biotechnology Co., LtdF-TC2015
Varms sistema de biblioteca de tipo base V1.0Instituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong Derechos de autor delsoftware interno
vertical de alta presión esterilizadorShanghai Shen'an fábrica de instrumentos médicosLDZX-75L
Sistema de gestión de pruebas de resistencia a patógenos veterinariosInstituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong Derechos deautor
fagos y monitoreo en la nube de resistencia veterinaria V1.0Instituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong Derechos deautor
del software internoD832390del software interno Vapor del software interno Plataforma de control de del software interno

Referencias

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