Desarrollo rápido de circuitos de identificación del estado celular con politransfección

Summary

Los circuitos genéticos complejos requieren mucho tiempo para diseñar, probar y optimizar. Para facilitar este proceso, las células de mamíferos se transfectan de una manera que permite la prueba de múltiples estequiometrías de los componentes del circuito en un solo pozo. Este protocolo describe los pasos para la planificación experimental, la transfección y el análisis de datos.

Abstract

Los circuitos genéticos de mamíferos han demostrado el potencial para detectar y tratar una amplia gama de estados de enfermedad, pero la optimización de los niveles de los componentes del circuito sigue siendo un desafío y requiere mucha mano de obra. Para acelerar este proceso, nuestro laboratorio desarrolló la politransfección, una extensión de alto rendimiento de la transfección tradicional de mamíferos. En la politransfección, cada célula de la población transfectada esencialmente realiza un experimento diferente, probando el comportamiento del circuito en diferentes números de copias de ADN y permitiendo a los usuarios analizar un gran número de estequiometrías en una reacción de un solo recipiente. Hasta ahora, se han demostrado politransfecciones que optimizan las proporciones de circuitos de tres componentes en un solo pocillo de células; En principio, el mismo método se puede utilizar para el desarrollo de circuitos aún más grandes. Los resultados de la politransfección se pueden aplicar fácilmente para encontrar proporciones óptimas de ADN a cotransfecto para circuitos transitorios o para elegir niveles de expresión para componentes de circuitos para la generación de líneas celulares estables.

Aquí, demostramos el uso de la politransfección para optimizar un circuito de tres componentes. El protocolo comienza con los principios de diseño experimental y explica cómo la politransfección se basa en los métodos tradicionales de cotransfección. A continuación, se lleva a cabo la politransfección de células y seguida de citometría de flujo unos días después. Finalmente, los datos se analizan examinando cortes de los datos de citometría de flujo de una sola célula que corresponden a subconjuntos de células con ciertas proporciones de componentes. En el laboratorio, la politransfección se ha utilizado para optimizar clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, motivos biestables y muchos más. Este método simple pero poderoso acelera los ciclos de diseño para circuitos genéticos complejos en células de mamíferos.

Introduction

El campo de la biología sintética de mamíferos ha progresado rápidamente, desde el desarrollo de partes simples de detección y respuesta en líneas celulares cultivadas hasta la optimización de redes complejas de genes para abordar los desafíos del mundo real en diagnóstico y terapéutica¹. Estos sofisticados circuitos son capaces de detectar entradas biológicas desde perfiles de microARN hasta citoquinas y fármacos de moléculas pequeñas, e implementar circuitos de procesamiento lógico que incluyen transistores, filtros de paso de banda, interruptores de palanca y osciladores. También han mostrado resultados prometedores en modelos animales de en....

Protocol

NOTA: La Tabla 1 y la Tabla 2 sirven como referencias significativas para este protocolo. La Tabla 1 muestra la escala de reactivos para las reacciones, y la Tabla 2 muestra la aritmética de la relación de ADN para un ejemplo de politransfección descrita en el protocolo (mitad superior) y para un posible experimento de seguimiento (mitad inferior).

1. Preparación de células para la transfección

1. Asegúrese de que el cultivo de células de riñón embrionario humano (HEK293) sea 60% -80% confluente antes de iniciar el protocolo. Para ello, sembrar 1 x 1....

Results

En la Figura 1, comparamos la co-transfección con la poli-transfección. En una co-transfección, todos los plásmidos se entregan en la misma mezcla de transfección, lo que resulta en una alta correlación entre la cantidad de cada plásmido que recibe cualquier célula individual (Figura 1A). Si bien el número total de plásmidos entregados a cada célula varía significativamente, la fluorescencia de las dos proteínas reporteras en las células individuales en toda la .......

Discussion

Los métodos de creación rápida de prototipos, como el diseño asistido por computadora (CAD), el breadboard y la impresión 3D, han revolucionado las disciplinas mecánicas, eléctricas y de ingeniería civil. La capacidad de buscar rápidamente a través de muchas soluciones posibles a un desafío dado acelera enormemente el progreso en un campo. Creemos que la politransfección es una tecnología análoga para la ingeniería biológica, que permite la creación rápida de prototipos de circuitos genéticos. Además, otras tecnologías d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos cónicos Corning Falcon de 15 ml	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
Placa de Petri de 24 pocillos	Cualquier empresa de elección		(no pirógeno, estéril, RNasa, DNasa, ADN y libre de pirógenos)
Albbúmina sérica bovina	Centrífuga NEB	B9000S
	Cualquier empresa de elección		Capaz de exponer tubos Falcon de 15 ml a 300 rcf
Countess 3 Contador de células automatizado	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Portaobjetos de cámara de recuento de células	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Paquete		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Utilice el medio correcto para su tipo de célula
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Suero fetal bovino	Sigma Aldrich	F4135
Células HEK	ATCC	CRL-1573	Utilice el tipo de célula correspondiente para sus experimentos. Las células HEK tienden a transfectar de manera muy eficiente.
Celdas HeLa	ATCC	CRL-12401	Utilice el tipo de célula correspondiente para sus experimentos.
Lipofectamina 3000 y potenciador P3000	ThermoFisher Scientific	L3000001	Utilice el reactivo correcto para su tipo de célula; reactivo de transfección y potenciador
LSRFortessa citómetro de flujo	BD Biosciences	N/A
MEM Solución de aminoácidos no esenciales	Gibco	11140050
Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL	Cualquier empresa de su elección
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	medio sérico reducido
Solución salina tamponada con fosfato	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow Perlas de calibración	Spherotech	URCP-100-2H
Azida sódica	Sigma Aldrich	S2002
Tripsina	VWR	25-053-CI