Artículo de método

Estudio de la metilación de la arginina de proteínas: enfoques y métodos

DOI:

10.3791/64821

⸱

20 de enero de 2023

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARTÍCULOS DISCUTIDOS:

Hutchinson, A., Seitova, A. Producción de proteínas PRMT recombinantes utilizando el sistema de vectores de expresión de Baculovirus. Revista de Experimentos Visualizados. (173), doi: 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. Un enfoque proteómico basado en espectrometría de masas para el análisis global y de alta confianza de la proteína R-metilación. Revista de Experimentos Visualizados. (182), doi: 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Explorando el metiloma de arginina mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Revista de Experimentos Visualizados. (178), doi: 10.3791/63245 (2021).

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Métodos cuantitativos para estudiar la actividad de la proteína arginina metiltransferasa 1-9 en células. Revista de Experimentos Visualizados. (174), doi: 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. El ensayo de ligadura de proximidad permite la detección, localización y cuantificación de la metilación de la proteína arginina en tejido fijo. Revista de Experimentos Visualizados. (185), doi: 10.3791/64294 (2022).

Editorial

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metilación de la proteína arginina es una modificación postraduccional que está involucrada en la regulación de un amplio espectro de procesos biológicos 1,2,3. Los nueve miembros de la familia de las proteínas arginina metiltransferasas (PRMT) pueden metilar las argininas de manera monometil y dimetilsimétrica o asimétrica. La comprensión de las consecuencias funcionales y la catalogación de los sustratos metilados de las PRMT han avanzado drásticamente en la comprensión de las enzimas PRMT y han facilitado su vinculación con la enfermedad2. Además, el desarrollo de inhibidores potentes y selectivos ha permitido enfoques basados en la biología química para estudiar los PRMT y ha acelerado el desarrollo clínico de los agentes dirigidos a PRMT3. A medida que avanza el campo de las PRMT, los métodos novedosos y sus aplicaciones permitirán dilucidar aún más la regulación y la biología de estas enzimas.

En esta colección de métodos, un artículo sobre la producción recombinante de las proteínas PRMT proporciona una descripción detallada de un sistema de expresión basado en baculovirus4. Se pueden generar varios PRMT utilizando la expresión bacteriana; sin embargo, las PRMT dependientes más grandes o complejas, como PRMT7 o PRMT5, requieren un sistema de expresión de células de insectos. Este método ya ha beneficiado a numerosos esfuerzos in vitro para determinar los sustratos de los PRMT.

El estudio de los sustratos de PRMT en el entorno celular requiere enfoques de detección sofisticados. Dos artículos de esta colección presentan metodologías distintas que se basan en el enriquecimiento de anticuerpos de argininas metiladas seguido de la cuantificación por espectrometría de masas o la cuantificación independiente de anticuerpos mediante resonancia magnética nuclear (RMN). Se desarrollaron varios anticuerpos que reconocen distintos estados de metilación y se han utilizado en estudios que identifican los sustratos de PRMT5. El método de espectrometría de masas permite la evaluación cuantitativa de la metilación de la arginina de la proteína celular mediante el empleo de etiquetado metabólico, técnicas de separación sofisticadas posteriores y enriquecimiento basado en anticuerpos6. Varios miembros de la familia PRMT prefieren las argininas metilantes que se encuentran en motivos RGG repetitivos que residen en las regiones intrínsecamente desordenadas de las proteínas7. El método basado en espectroscopia de RMN permite determinar el estado de metilación y la posición de todos los derivados de la arginina (mono y di, simétricos y asimétricos) donde se pueden cuantificar de manera confiable dentro de muestras biológicas complejas8.

Finalmente, para identificar residuos de arginina metilada en proteínas específicas, dos artículos proporcionan enfoques basados en western blot y el ensayo de ligadura de proximidad (PLA). Ambos métodos utilizan la detección basada en anticuerpos, pero difieren en el método de detección y la información proporcionada. El método western blot es cuantitativo y ha sido valioso en la caracterización de sondas químicas9. El PLA proporciona información sobre la ubicación espacial de la arginina metilada, ya que utiliza el anticuerpo de la proteína diana y el anticuerpo genérico para la arginina mono o di-metil, evitando así la necesidad de generar anticuerpos específicos y puede utilizarse notablemente en tejidos fijos10.

Juntas, estas diversas metodologías permitirán un descubrimiento sólido de argininas metiladas en varios sistemas celulares y estados de enfermedad y avanzarán aún más en el conocimiento fundamental de la función biológica de las enzimas PRMT.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.B.L. cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC). El Consorcio de Genómica Estructural es una organización benéfica registrada (no: 1097737) que recibe fondos de Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Genentech, Genome Canada a través del Instituto de Genómica de Ontario [OGI-196], EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [subvención EUbOPEN 875510], Janssen, Merck KGaA (también conocida como EMD en Canadá y EE. UU.), Pfizer y Takeda.

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

Artículos relacionados