Este artículo describe los protocolos para la fabricación de microgel de metacriloilo de gelatina de alto rendimiento utilizando dispositivos microfluídicos, la conversión de microgeles en polvo resuspendible (micro-aerogeles), el ensamblaje químico de microgeles para formar andamios de hidrogel granular y el desarrollo de biotintas de hidrogel granular con microporosidad preservada para bioimpresión 3D.
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Artículo de método
Andamios de hidrogel granular de metacriloilo de gelatina: fabricación de microgel de alto rendimiento, liofilización, ensamblaje químico y bioimpresión 3D
En este artículo
Resumen
Resumen
La aparición de andamios de hidrogel granular (GHS), fabricados mediante el ensamblaje de micropartículas de hidrogel (HMP), ha permitido la formación de andamios microporosos in situ. A diferencia de los hidrogeles a granel convencionales, los poros interconectados a microescala en GHS facilitan la infiltración celular independiente de la degradación, así como la transferencia de oxígeno, nutrientes y subproductos celulares. La gelatina modificada con metacriloilo (GelMA), un biopolímero a base de proteínas (foto)químicamente reticulado que contiene adhesivo celular y restos biodegradables, se ha utilizado ampliamente como biomaterial instructivo / sensible a las células. La conversión de GelMA a granel a GHS puede abrir una gran cantidad de oportunidades para la ingeniería y regeneración de tejidos. En este artículo, demostramos los procedimientos de fabricación de microgel GelMA de alto rendimiento, conversión a microgeles secos resuspendibles (micro-aerogeles), formación de GHS a través del ensamblaje químico de microgeles y fabricación de biotinta granular para bioimpresión por extrusión. Mostramos cómo un tratamiento fisicoquímico secuencial a través de enfriamiento y fotoreticulación permite la formación de GHS mecánicamente robusto. Cuando la luz es inaccesible (por ejemplo, durante la inyección de tejido profundo), los HMP de GelMA reticulados individualmente pueden ensamblarse bioortogonalmente a través de la reticulación enzimática utilizando transglutaminasas. Finalmente, la bioimpresión tridimensional (3D) de GHS microporoso a baja densidad de empaquetamiento HMP se demuestra a través del autoensamblaje interfacial de nanopartículas cargadas heterogéneamente.
Introducción
El ensamblaje de bloques de construcción HMP para formar andamios de ingeniería de tejidos ha ganado una gran atención en los últimos años1. GHS, fabricado a través del ensamblaje HMP, tiene propiedades únicas en comparación con sus contrapartes a granel, incluida la microporosidad a escala celular que se origina en los espacios vacíos entre los bloques de construcción discretos. Las propiedades adicionales, como la inyectabilidad, la modularidad y la rigidez desacoplada de la porosidad, hacen de GHS una plataforma prometedora para mejorar la reparación y regeneración de tejidos2. Se han utilizado diferentes bio....
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Protocolo
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Síntesis de GelMA
NOTA: La síntesis de GelMA debe realizarse en una campana extractora de humos químicos, y se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado todo el tiempo.
- Añadir 200 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, 1x) a un erlenmeyer y calentar la solución hasta que alcance los 50 °C. Cubrir el matraz con papel de aluminio para evitar la evaporación.
- Añadir 20 ....
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Resultados
GelMA se sintetizó a través de la reacción de gelatina con MA, como se presenta en la Figura 1A. Al adaptar las condiciones de reacción, como la concentración de MA, se obtuvieron diferentes grados de sustitución de MA. Para cuantificar el grado de sustitución de MA, se evaluó GelMA mediante espectroscopia de RMN 1H (Figura 1B). Los grupos funcionales de vinilo con picos representativos en los cambios químicos de ~ 5-6 ppm confirmaron la exi.......
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Discusión
La gelatina y sus derivados son los biomateriales a base de proteínas más utilizados para la fabricación de HMP. El desafío del equilibrio entre el rendimiento y la monodispersidad del tamaño de partícula se puede superar utilizando dispositivos microfluídicos de emulsificación escalonada. Estos dispositivos son capaces de formar más de 40 millones de gotas por hora, con un coeficiente de variación inferior al 5%27. En este artículo, discutimos la microfabricación de gotas que contienen soluciones.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a T. Pond, especialista en apoyo a la investigación en el Departamento de Ingeniería Química de la Universidad Estatal de Pensilvania (Penn State), al personal del Laboratorio de Nanofabricación de Penn State y al Dr. J. de Rutte de Partillion Bioscience por la ayuda y la discusión sobre los procesos de nanofabricación. A. Sheikhi reconoce el apoyo de las subvenciones iniciales del Instituto de Investigación de Materiales (MRI) y la Facultad de Ingeniería de Materiales Materiales Materia a Nivel Humano, el Centro de Convergencia para Sistemas de Materiales Multifuncionales Vivos (LiMC2) y el Programa de Sub....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% de pureza |
| Punzón de biopsia | Integra Miltex, NY, EE. UU | 33-31A-P/25 | Punzón de biopsia de 1,5 mm con sistema de émbolo |
| Aguja roma | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | Centrífuga del dispositivo NMR | |
| Eppendorf, Alemania | 5415 C | ||
| Tubo de centrífuga | Celltreat, MA ,EE. UU | . 229423 | |
| Filtros de café | BUNN, IL, EE. UU | 20104.0006 | BUNN 8-12 Filtros de café para tazas, 6 cada uno, 100 ct |
| Desecador | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Desecador al vacío, cubierta y cuerpo de PC, 280 mm de diámetro exterior |
| Óxido de deuterio | Sigma, MA, EE. UU | 151882 | |
| Membrana de diálisis (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, EE. UU | . 08-667E | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, 1x) | Sigma, MA, EE. UU | 56064C-10L | polvo seco, sin calcio, sin magnesio, apto para cultivo celular |
| Matraz Erlenmeyer | Corning, NY, EE. UU | . 4980 | Corning PYREX |
| Etanol | VWR, PA, EE. UU | 89125-188 | Koptec 200 proof |
| Viales criogénicos de rosca externa (crioviales) | Corning, NY, EE. UU | . 430659 | |
| liofilizador | Labconco, MO, EE. UU | 71042000 | Equipado con bomba de vacío (Catálogo # 7587000) |
| Gelatina en polvo | Sigma, MA, EE. UU | G1890-5100G | Tipo A de piel porcina, fuerza de gel ~ 300 g |
| Bloom Glass portaobjetos de microscopio | VWR, PA, EE. UU. | 82027-788 | |
| Placa calefactora | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 5 pulgadas Agitador magnético de placa calefactora Max Temp 280 ° C/536 y deg; F | |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, EE. UU | . 06-666 | |
| KMPR 1000 serie fotorresistente negativa | Kayaku Advanced Materials, MA, EE. UU. | 121619 | KMPR1025 y KMP1035 están incluidos |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, EE. UU | 2344265 | |
| Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP) | Sigma, MA, EE. UU | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok conector | BD, NJ, EE. UU. | BD 302995 | |
| MA/BA Gen4-serie Mask- und Bond-aligner | Sü SS MicroTeck, dispositivo de | nanofabricación | |
| Anhídrido de metacilato Sigma | , MA, EE. UU | 276685-100ML | contiene 2,000 ppm de topanol A como inhibidor, 94% |
| Milli-Q de agua | Millipore Corporation, MA, EE. UU | . ZRQSVR5WW | resistividad eléctrica ≈ 18 MΩ a 25 & grados; C, Direct-Q 5 UV Sistema de purificación de agua remoto |
| Novec 7500 fluido de ingeniería | 3M, MN, EE. UU | . 3M ID Horno 7100003723 | |
| VWR, PA, EE. UU | VWR-1410 | 1410 Horno de vacío | |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, EE. UU | . HS234526C | |
| pipeta Pasteur | VWR, PA, EE. UU. | 14673-010 | |
| Placa de Petri | VWR, PA, EE. UU. | 25384-092 | poliestireno |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, Reino Unido | C022 | (5% (p/p) en Novec 7500) |
| Pipeta | VWR, PA, EE. UU. | 89079-970 | |
| Puntas de pipeta | VWR, PA, EE. UU | 87006-060 | |
| Cámara limpiadora de plasma | Harrick Plasma, NY, EE. UU | . PDC-001-HP | |
| Polidimetilsiloxano | Dow Corning, MI, EE. UU. & | nbsp; 2065623 | SYLGARD 184 Kit de elastómero de silicona |
| Pipeta de desplazamiento positivo | Microman E M100E, Gilson, OH, EE. UU | M100E | |
| Obleas de silicona | UniversityWafer, MA, EE. UU | 452/1196 | de grado mecánico de 4 pulgadas |
| VWR, PA, EE. UU. | 231-0104 | Desechable | |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, EE. UU | ||
| . Bomba de jeringa | Harvard Aparato, MA, EE. UU. | 70-2001 | PHD 2000 |
| Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silano | Millipore Sigma, MA, EE. UU | 448931-10G | 97% |
| Tubos Tygon | Saint-globain, PA, EE. UU | . AAD04103 | |
| Luz ultravioleta | QUANS | Voltaje: 85 V-265 V AC / Potencia: 20 W | |
| Unidad de filtración al vacío | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µ m |
| Vortex | Fischer scientific, EE. UU. | 14-955-151 | Mini mezclador de vórtice |
Referencias
- Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A.
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Reimpresiones y permisos
