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Con sus notables ganancias en sensibilidad, velocidad y versatilidad, la espectrometría de masas (MS) moderna brinda a los investigadores mayores oportunidades para la caracterización del proteoma. Con tecnologías mejoradas, los investigadores exigen un mayor nivel de rigurosidad en sus resultados. Por lo tanto, de igual importancia para el flujo de trabajo de proteómica son las estrategias innovadoras de preparación de muestras diseñadas para aislar, separar y procesar mezclas proteómicas complejas antes de la EM. La diversidad química de los sistemas proteómicos excluye un enfoque único para la preparación de muestras. Sin embargo, como se ve a través de esta recopilación de métodos, hay múltiples protocolos disponibles para maximizar la calidad y la confianza de los datos de MS. Esta colección tiene como objetivo proporcionar a los investigadores herramientas y trucos fáciles de implementar diseñados para mejorar el resultado esperado de los flujos de trabajo proteómicos y metabolómicos.
Las columnas capilares de HPLC y UPLC son casi omnipresentes en los flujos de trabajo de proteómica integrales. Si bien las columnas capilares autoempaquetadas son una alternativa de bajo costo a las columnas comerciales, aquellos que han intentado empacar sus propias columnas pueden estar familiarizados con las tasas de empaque inconsistentes y la calidad variable de la columna. Kovalchuk y sus colegas de la Academia Rusa de Ciencias demuestran su enfoque FlashPack para garantizar el empaquetado eficiente y consistente de las columnas capilares UPLC1. Una combinación de variables controladas con precisión reduce la formación de cúpulas en la entrada capilar y permite un llenado rápido de la columna mediante una bomba de empaquetadura de baja presión.
La inmunopeptidómica es una subdisciplina emergente de la proteómica, con implicaciones clínicas en oncología y terapias inmunológicas. Un análisis fiable de la EM requiere el aislamiento de ligandos peptídicos MHC de clase I/II o del antígeno leucocitario humano (HLA). Para mejorar la reproducibilidad de este protocolo de aislamiento, Sirois y sus colegas de la Universidad de Montreal demuestran un flujo de trabajo de captura de afinidad basado en perlas a pequeña escala, junto con los resultados anticipados de MS del inmunopeptidoma2 recuperado.
Para mejorar aún más el rigor de los datos proteómicos y facilitar el procesamiento de alto rendimiento de un gran número de muestras, los investigadores recurren cada vez más a plataformas robóticas para automatizar los pasos de procesamiento de muestras. Hay disponible una plataforma robótica de bajo costo, aunque esto requiere que el usuario programe los pasos de manipulación deseados, lo que puede ser una barrera para usar este dispositivo. Han et al. en el Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado han ideado un paquete de codificación simple de código abierto y demuestran los pasos básicos involucrados en la digestión de proteínas en la plataforma robótica Opentrons OT-23.
Los tensioactivos como SDS se emplean comúnmente para facilitar la extracción celular y la solubilización del proteoma antes de la EM. Sin embargo, la extracción de SDS puede ser incompleta o arriesgarse a perder la muestra. Nickerson y sus colegas de la Universidad de Dalhousie demuestran un cartucho desechable para automatizar el proceso de precipitación de proteínas4. Una combinación de sal y disolvente orgánico es fundamental para maximizar la recuperación de proteínas y se puede realizar en un tiempo mínimo con altos rendimientos.
La metabolómica está siguiendo los pasos del análisis de proteomas, con una base de datos creciente de espectros de MS de referencia que se utilizan para identificar metabolitos desconocidos en flujos de trabajo dirigidos y no dirigidos. Al igual que el análisis proteómico, las identificaciones espectrales son propensas a coincidencias falsas positivas y, por lo tanto, un informe estadístico de la tasa de descubrimiento falso (FDR) es esencial para filtrar los resultados de baja confianza. Li y sus colegas de la Universidad de Jinan se asociaron con Chi-Biotech Co. para producir un flujo de trabajo basado en la web basado en su programa XY-Meta y generar una base de datos de metabolitos señuelo de metabolitos5. Demuestran los pasos para generar la base de datos de destino y filtrar los resultados metabolómicos en función de un FDR deseado.
Finalmente, Petelski y sus colegas de la Universidad Northeastern demuestran un protocolo para el aislamiento de proteomas unicelulares6. El protocolo Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) permite a los investigadores cuantificar cientos o miles de proteínas en un solo experimento, utilizando un portador isobárico para reducir la pérdida de muestras. La clave del protocolo es un paso de ciclo térmico rápido para lisar las células, así como una digestión tríptica eficiente utilizando una cantidad mayor de lo típico de etiquetado enzimático e isobárico con etiquetas TMT.
A pesar de décadas de experiencia en proteómica, este campo de maduración simplemente ha evolucionado para abordar problemas más desafiantes. La capacidad de procesar un mayor número de muestras, o cantidades más pequeñas de material, con mayor consistencia y confianza en la salida de datos continúa impulsando las innovaciones tecnológicas. El intercambio de ideas relacionadas con las manipulaciones químicas, los enfoques instrumentales e informáticos es esencial para el crecimiento de este campo. Es posible que el "problema" de un investigador ya se haya resuelto con un simple "consejo o truco" para superar el desafío. Por lo tanto, es una señal positiva que haya tantas estrategias únicas disponibles para el análisis de proteomas. Para los desafíos que quedan, es probable que alguien ya esté trabajando en una posible solución.