Análisis conductuales y basados en la farmacología de redes para la medicina tradicional mongola Zadi-5 en un modelo de depresión en ratas

La depresión, también conocida como trastorno depresivo mayor (TDM), es una enfermedad neuropsiquiátrica grave responsable de las crecientes cargas médicas y económicas de la sociedad. Debido a la complejidad, morbilidad y mortalidad asociadas, se ha realizado una cantidad significativa de investigaciones para encontrar remedios para el trastorno ^1,2. Según una encuesta de salud mental realizada por la Organización Mundial de la Salud, alrededor de 350 millones de personas sufren actualmente de depresión y sus síntomas asociados en todo el mundo. Se prevé que la depresión superará al cáncer y a las enfermedades cardiovasculares como la principal causa de carga de morbilidad a nivel mundial para 2030. Por lo tanto, la prevención y el tratamiento de la depresión se convertirán en una prioridad mundial en un futuro próximo³. La patogenia del TDM aún no ha sido dilucidada. Sin embargo, comúnmente se atribuye a los siguientes factores: predisposición genética, disfunción del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal, reducciones en la secreción de neurotransmisores, neuroinflamación inducida por la desregulación neuroinmune, apoptosis celular y reducción de la proliferación celular ^4,5.

Entre estos factores, la neuroinflamación inducida por la desregulación neuroinmune y la alteración de la secreción de factores neurotróficos han recibido especial atención por su papel en el desarrollo de la depresión y muchas otras enfermedades psiquiátricas⁶. En la última década, los estudiosos han demostrado que el hipocampo es el sitio dominante para las funciones nerviosas regenerativas y está involucrado en la regulación de la emoción y la cognición. En este sentido, las neuronas del hipocampo son reconocidas como nuevas dianas terapéuticas para medicamentos antidepresivos en desarrollo ^7,8. Además, también se ha informado que el hipocampo está involucrado en la memoria a corto y largo plazo en el aprendizaje y la consolidación de los recuerdos. En concreto, la escasez de neuronas piramidales en la región CA1 del hipocampo provoca amnesia retrógrada y anterógrada⁹. Una estrategia terapéutica antidepresiva típica tiene como objetivo mejorar la proliferación celular y la neurogénesis en el giro dentado del hipocampo. Los compuestos derivados de productos naturales y las pequeñas moléculas sintetizadas a partir de técnicas de química medicinal se consideran las principales fuentes de agentes terapéuticos innovadores para diversas afecciones neuropsiquiátricas.

Las medicinas tradicionales mongolas, que tienen una larga historia y un sistema médico teórico bien respaldado, descienden de los nómadas de la meseta mongola. Zadi-5 es una formulación bien establecida entre estos medicamentos y se registró por primera vez en "Experiencia clínica del Dr. Gao Shi", escrito por un destacado médico mongol llamado Dr. Gao Shi (1804-1876). Ha sido una práctica clínica durante mucho tiempo en Mongolia el uso de estas píldoras para tratar los síntomas de angustia, palpitación, irritación y dolor punzante cardíaco^10,11. Además, Zadi-5 ha demostrado tener efectos en el alivio de la depresión post-ictus en pacientes afectados¹². La reciente investigación experimental sobre CUMS ha revelado que la formulación de Zadi-5 alivia la depresión mediante la regulación de los neurotransmisores centrales¹³; de hecho, con Zadi-5, se han detectado niveles elevados de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y receptor de tirosina quinasa B (TrkB) y se han correlacionado con una mejora del aprendizaje y la memoria en un modelo de depresión en ratas¹⁴. Sin embargo, no se ha dilucidado el mecanismo exacto de acción de Zadi-5 para tal alivio de la depresión.

Este estudio tuvo como objetivo demostrar los efectos terapéuticos de Zadi-5 contra la depresión en ratas utilizando una prueba de comportamiento e identificar los componentes de Zadi-5 utilizando la Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP) y la Predicción de Objetivos Suizos para predecir los mecanismos potenciales que subyacen a la eficacia de Zadi-5, una medicina tradicional mongola, en el tratamiento de la depresión.

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética del Cuidado de Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Mongolia Interior y siguieron las directrices de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y la ética de los animales. Las ratas macho Sprague Dawley (SD) de 8 semanas de edad (200 g ± 20 g) se alojaron en una habitación con temperatura controlada (22 °C ± 2 °C) y humedad (55% ± 15%) bajo un ciclo regulado de luz/oscuridad de 12 h/12 h durante 1 semana. Consulte la Figura 1 para ver el flujo de trabajo del análisis farmacológico de red.

1. Test de comportamiento en ratas

1. Establecer un modelo de rata CUMS
   1. Aplicar los siguientes estímulos combinados con aislamiento durante 28 días a todas las ratas, excepto a los controles: inversión del ciclo de luz/oscuridad durante 24 h, privación de alimentos durante 24 h, privación de agua durante 24 h, agitación de nivel a alta velocidad durante 15 min (una vez/s), pinza de cola durante 2 min, natación en agua fría (4 °C) durante 5 min, Estimulación térmica a 45 °C y acolchado húmedo durante 24 h (Tabla 1). Cría a las ratas en jaulas individuales.
      NOTA: Evite repetir el mismo tipo de estímulos durante días consecutivos.  Los procedimientos anteriores para establecer un modelo de rata CUMS han sido aprobados por el comité de ética animal y descritos anteriormente¹⁵.
2. Preparación de medicamentos
   1. Pulverizar la pastilla Zadi-5 en un molinillo y preparar una solución de 1,16 g/ml en agua destilada. Preparar por separado una solución de fluoxetina de 0,36 mg/ml en agua destilada.
3. Administración de medicamentos
   1. Divida las ratas aleatoriamente en seis grupos (n = 10): control (CON), modelo (MOD), grupo Zadi-5 (Zadi-5, 1,6 g de Zadi-5/kg¹⁶), grupo fluoxetina (Fluoxetina, 3,6 mg de fluoxetina/kg). Una vez al día durante 28 días, administrar 1 ml/g por rata de la solución farmacológica apropiada por sonda nasogástrica y tratar los grupos CON y MOD con un volumen igual de agua destilada.
      NOTA: Gavage comienza al principio del establecimiento del modelo para todos los grupos.
4. Prueba de campo abierto (OFT)
   1. Divide una caja negra (50 cm x 50 cm x 30 cm) en nueve regiones cuadradas de igual área. Equipe la caja con un sistema de análisis de seguimiento de video. Un día después de la última sonda nasogástrica, coloque a la rata en el cuadrado central y registre sus actividades horizontales y verticales durante 3 minutos.
   2. Puntúa el número de cuadrados cruzados con todas las patas como una actividad horizontal, y puntúa el estar de pie y acicalarse como una actividad vertical. Después de cada prueba, limpie la caja con alcohol al 75% para eliminar el olor de la rata para las pruebas posteriores¹⁷.
5. Prueba de consumo de sacarosa (SCT)
   1. Pesar las botellas respectivas antes y después del consumo, y calcular las tasas de preferencia de sacarosa de 60 minutos en el día 0, el día 7, el día 14, el día 21 y el día 28 utilizando la ecuación (1):
      Consumo de sacarosa = × 100% (1)
6. Laberinto acuático de Morris (MWM)
   1. Divide la piscina en cuatro cuadrantes. Ordene los cuadrantes del uno al cuatro, y coloque la plataforma oculta en el tercer cuadrante, 1 cm por debajo de la superficie del agua.
   2. Coloque al sujeto de la rata en el laberinto en diferentes cuadrantes para buscar la plataforma durante 120 s y registre el tiempo de latencia utilizando el sistema de análisis de rastros de video MWM.
   3. Coloque al sujeto de la rata en una posición fija en la piscina. Si el sujeto no puede encontrar la plataforma oculta en 120 s, registre la latencia como 120 s.
   4. A continuación, desaloje la plataforma, coloque la rata en el agua y registre el número de cruces de zona durante 120 s.
   5. Agregue leche a la piscina para obtener cierto nivel de opacidad. Mantenga la temperatura del agua a 23 °C ± 1 °C durante el experimento.

2. Predicción farmacológica de la red

1. Filtra los componentes activos en Zadi-5.
   1. Navegue por la Farmacología de los Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) e ingrese "Myristicae Semen Seeds", "Aucklandiae Radix roots" y "Piperis Longi Fructus" en la sección "nombre de la hierba" para obtener los nombres de los productos químicos. Establezca que el índice farmacocinético de biodisponibilidad oral (OB) sea de >30% y que el índice similar a un fármaco (DL) sea de >0,18 (Archivo complementario 1).
   2. Buscar "Rou Dou Kou" (Myristica fragrans Houtt), "Tu Mu Xiang" (Inula helenium L.), "Mu Xiang" (Aucklandia lappa Decne.), "Guang Zao" (Choerospondias axillaris Roxb. Burtt Hill) y "Bi Ba" (Piper longum L.) en la Farmacopea de Medicina China (http://www.zhongyaocai360.com/zhongguoyaodian/) para identificar los nombres químicos de cada componente.
   3. Busque los nombres químicos identificados en PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) para encontrar el SOMÉRICO SMILES o InChIkey
2. Identificar las proteínas diana de los componentes activos de Zadi-5.
   1. Identifique las proteínas diana de los componentes activos utilizando SEA (http://sea.bkslab.org/), BATMAN (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/) y Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) con SMILES isomérico o InChIkey, y encuentre las proteínas superpuestas.
   2. Utilice la base de datos de proteínas UniProt (http://www.uniprot.org/uploadlists/) para convertir las dianas identificadas en nombres de genes unificados.
3. Búsqueda de las proteínas diana para la depresión.
   1. Busque e identifique las posibles proteínas diana para la depresión utilizando las palabras clave "depresión" y "trastorno depresivo" en Genecards (https://www.genecards.org/), Disgenet (https://www.disgenet.org/) y Drugbank (https://www.drugbank.com/).
4. Encuentra los genes diana.
   1. Navegue por el diagrama de Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/), cargue los objetivos de los componentes activos de Zadi-5 en la Lista-1, cargue los objetivos para la depresión en la Lista-2 y envíelos. Obtenga el diagrama de Venn y filtre los candidatos objetivo superpuestos.
5. Construir la red.
   1. Construya una hoja de cálculo llamada "Tipo y red" (Archivo complementario 2). "Tipo" es la firma de la red, y "Red" ilustra la relación entre los signos.
   2. Exporte el "Tipo y red" a Cytoscape v3.9.0 para construir la red "Zadi-5 herbs-ingredients-disease targets".
6. Analizar la red de interacción proteína-proteína (PPI) de los candidatos diana.
   1. Establezca los objetivos comunes en la base de datos STRING (https://cn.string- db.org/) para analizar sus interacciones. Establezca el tipo de proteína como "homo sapiens". Establezca el valor del umbral de interacción en 0,9 y seleccione solo los tipos verificados experimentalmente. No muestre los nodos de la isla solitaria.
7. Llevar a cabo análisis de enriquecimiento de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) y de Ontología Génica (GO) de las vías relacionadas con la diana.
   1. Pegue 86 posibles dianas antidepresivas de Zadi-5 en el soporte de análisis inicial en DAVID (https:// david.ncifcrf.gov/) para estudiar las vías de señalización relacionadas mediante la realización de la función de ontología genética (GO), incluido el proceso biológico, el componente celular y la función molecular, y los análisis de enriquecimiento de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG).
      NOTA: KEGG se visualiza en el gráfico de burbujas utilizando un IMageGP en línea (http://www.ehbio.com /ImageGP/index.php/Home/Index/). El tamaño de la burbuja representa el número de objetivos enriquecidos en la ruta indicada, y el color de la burbuja representa el valor P del enriquecimiento.
8. Construya la red para ilustrar los compuestos activos en Zadi-5 que interactúan con la vía de señalización PI3K-AKT.
   1. Descargue el documento de la vía KEGG, seleccione los genes de la vía PI3K-AKT del análisis de enriquecimiento y péguelos en la hoja de cálculo para construir un documento de "Tipo y red".
   2. Exportar el documento "Tipo y Red" al Cytoscape para generar la "Red de compuestos-dianas-vías visualizadas PI3K-AKT" (Archivo Complementario 3).
      NOTA: "Tipo" es la firma de la red, y "Red" ilustra la relación entre los signos.

3. Análisis estadístico

1. Utilice un análisis de varianza unidireccional (ANOVA), seguido de la prueba post hoc de Duncan, para determinar las diferencias significativas en los parámetros bioquímicos y de expresión génica. Calcule la media ± la desviación estándar (DE) y visualice los datos. Considere que P < 0,05 es estadísticamente significativo.

Test de comportamiento en animales
Resultados de las pruebas conductuales en el modelo de depresión de ratas inducida por CUMS
No se encontraron diferencias significativas entre los grupos evaluados para la puntuación de OFT, el consumo de sacarosa y el análisis de MWM antes de la estimulación con CUMS. Después de establecer el modelo CUMS, las puntuaciones verticales y horizontales del grupo MOD fueron inferiores a las del grupo CON (P < 0,05). En comparación con el grupo MOD, las puntuaciones verticales y horizontales de los grupos POS y Zadi-5 fueron significativamente más altas (P < 0,05) (Figuras 2A,B).

En el día 0, los grupos analizados no tuvieron diferencias significativas en el consumo de sacarosa (%). El consumo de sacarosa (%) de los grupos Zadi-5 y POS fue mayor que el del grupo MOD en el día 28 (Figura 2C).

En comparación con el grupo CON, la latencia del grupo MOD para encontrar la plataforma en el MWM fue significativamente mayor (P < 0,01). La latencia en el grupo POS fue marcadamente menor que en el grupo MOD. Las latencias de las ratas en el grupo Zadi-5 fueron más bajas que en el grupo MOD, pero no en un grado significativo. En cuanto a los recuentos de cruces de zonas, el grupo MOD mostró menos cruces que el grupo CON. Los grupos POS y Zadi-5 mostraron más cruces que el grupo MOD (Figura 2D,E).

Predicción de farmacología de red
Había 134 componentes activos en Zadi-5, y se recuperaron 220 candidatos a proteínas diana para estos componentes. Además, se predijeron 1.000 dianas proteicas relacionadas con la depresión. De acuerdo con el análisis del diagrama de Venn, se identificaron 86 objetivos superpuestos como los objetivos críticos relacionados con la depresión de Zadi-5 (Figura 3). Sobre la base de estos hallazgos, se construyeron "Zadi-5 hierbas-ingredientes-objetivos de enfermedades" y un análisis de red PPI de los candidatos objetivo (Figura 4A, B, Figura 5 y Tabla 2). La vía PI3K-AKT mostró bordes relativamente irregulares, lo que indica que esta vía es esencial para el efecto antidepresivo de Zadi-5. De acuerdo con el análisis de la vía KEGG, la vía de señalización PI3K-AKT ocupó el séptimo lugar (Figura 6) y se asoció con muchas vías de señalización. En consecuencia, se consideró relativamente más importante que las otras vías de enriquecimiento (Figura 7A-C y Figura 8).

Figura 1: Flujo de trabajo del análisis farmacológico de la red para la validación in vivo . Abreviaturas: IBP = interacción proteína-proteína; KEGG = Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto; GO = Ontología Genética; OFT = prueba de campo abierto; MWM = Laberinto de Agua de Morris; SCT = prueba de consumo de sacarosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Efectos de Zadi-5 en el modelo de depresión de ratas inducida por CUMS. (A) Puntuaciones verticales de OFT. (B) Puntuaciones horizontales OFT. (C) Nivel de consumo de sacarosa (%) en el día 0 y el día 28. (D) Tiempo de latencia para la prueba MWM. (E) Números de cruce de zonas para la prueba MWM. ##P < 0.01 indica que el grupo CUMS MOD mostró diferencias significativas en comparación con el grupo CON. *P < 0,05 indica que el grupo POS y el grupo Zadi-5 mostraron diferencias significativas en comparación con el grupo MOD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diagrama de Venn de las proteínas diana de Zadi-5 y proteínas asociadas a la depresión. El círculo rojo representa las dianas de los componentes activos de Zadi-5, mientras que el círculo azul representa las proteínas asociadas a la depresión. La intersección de los dos colores representa las proteínas superpuestas que pueden identificarse como dianas terapéuticas para el alivio de la depresión por Zadi-5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Construcción de la "Red Zadi-5 de hierbas-ingredientes-dianas de enfermedades". Los paralelogramos rojos representan a Zadi-5 y sus hierbas, mientras que los círculos rosas, naranjas, amarillos, verdes y morados representan los componentes de cada hierba. Los diamantes azules representan las proteínas asociadas con la depresión, que es el hexágono verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: PPI de las dianas proteicas superpuestas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: El gráfico de burbujas para los 20 términos enriquecidos con KEGG principales basado en los 86 objetivos proteicos superpuestos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Los principales resultados bioinformáticos de los componentes de Zadi-5 y las dianas proteicas asociadas a la depresión. (A) Las 20 funciones moleculares principales que se superponen en términos de GO de Zadi-5 y depresión. (B) Los 20 componentes celulares principales que se superponen: términos GO de Zadi-5 y depresión. (C) Los 20 principales procesos biológicos superpuestos GO en términos de Zadi-5 y depresión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: El enriquecimiento de la vía de señalización Zadi-5-PI3K-AKT se dirige a la red para el tratamiento de la depresión. El círculo representa los ingredientes de Zadi-5, los hexágonos indican cada fármaco de Zadi-5 y los diamantes verdes representan los objetivos enriquecidos de la vía de señalización PI3K-AKT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Secuencia y métodos de aplicación de estímulos de estrés para la inducción de CUMS en sujetos con ratas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Los códigos de identificación utilizados en la Figura 2. Abreviaturas: MF = Myristica Fragrans Inula IH = Innula helenium L.; FC = Fructus choerospondiatis; AL = Aucklandia lappa Decne.; PL = Piper Longum L. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Imágenes de captura de pantalla del protocolo de farmacología de la red. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Ficha complementaria 2: Red Zadi-5 componentes-proteínas-depresión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Ficha complementaria 3: Tipo de red. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.