Aquí, describimos un protocolo para desarrollar un modelo de xenoinjerto de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo para tejido ovárico humano y demostramos la efectividad de la técnica, el marco de tiempo de revascularización del injerto y la viabilidad del tejido durante un período de injerto de 6 días.
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Artículo de método
El modelo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) como herramienta para estudiar el trasplante de tejido ovárico
En este artículo
Resumen
Resumen
La criopreservación y el trasplante de tejido ovárico es una estrategia eficaz para preservar la fertilidad, pero tiene un inconveniente importante, a saber, la pérdida masiva de folículos que se produce poco después de la reimplantación debido a la activación anormal del folículo y la muerte. Los roedores son modelos de referencia para investigar la activación de los folículos, pero el costo, el tiempo y las consideraciones éticas son cada vez más prohibitivas, lo que impulsa el desarrollo de alternativas. El modelo de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo es particularmente atractivo, ya que es económico y mantiene la inmunodeficiencia natural hasta el día 17 después de la fertilización, lo que lo hace ideal para estudiar el xenoinjerto a corto plazo de tejido ovárico humano. La MCA también está altamente vascularizada y se ha utilizado ampliamente como modelo para explorar la angiogénesis. Esto le da una ventaja notable sobre los modelos in vitro y permite la investigación de los mecanismos que afectan el proceso temprano de pérdida de folículos posterior al injerto. El protocolo descrito en este documento tiene como objetivo describir el desarrollo de un modelo de xenoinjerto CAM para tejido ovárico humano, con información específica sobre la efectividad de la técnica, el marco de tiempo de revascularización del injerto y la viabilidad del tejido durante un período de injerto de 6 días.
Introducción
La demanda de preservación de la fertilidad por indicaciones oncológicas y benignas, así como por razones sociales, ha aumentado drásticamente en las últimas décadas. Sin embargo, varios tratamientos utilizados para curar enfermedades malignas y no malignas son altamente tóxicos para las gónadas y pueden resultar en insuficiencia ovárica prematura iatrogénica, lo que en última instancia conduce a la infertilidad1. Las técnicas establecidas para la preservación de la fertilidad incluyen la criopreservación de embriones, la vitrificación de ovocitos inmaduros o maduros y la criopreservación de tejido ....
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Protocolo
El uso de tejido humano fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Católica de Lovaina. Las pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de su tejido ovárico con fines de investigación.
1. Pedir óvulos del día 0 que tienen una alta probabilidad de estar embrionados
- Encuentre un proveedor certificado de huevos blancos de Leghorn seleccionados por Lohman de grado de laboratorio que informe altas tasas de huevos embrionados, lo que depende principalmente de la edad de los pollitos.
2. Preparación de los huevos para la incubació....
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Resultados
Tasas de supervivencia de embriones de pollo
La tasa de supervivencia embrionaria desde la ventana (día 3 de la DE) hasta el injerto de tejido ovárico (día 7 de la DE) fue del 79% (33/42). Dado que se desconoce el porcentaje de huevos embrionados del día 0, se ordenaron huevos supernumerarios del día 0 de gallinas blancas de Livorno seleccionadas por Lohman para garantizar que hubiera suficientes huevos embrionados disponibles para el injerto. Se utilizaron un total de 23 óvulos viables de día 7 para .......
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Discusión
La parte más desafiante del protocolo descrito aquí es hacer el pequeño orificio necesario para aspirar la albúmina con el fin de separar el CAM de la cáscara del huevo antes de crear una ventana. La aplicación de demasiada presión puede provocar una sobrepenetración o incluso puede agrietar y destruir el óvulo, causando daños irrevocables a la CAM y su vasculatura. Para mantener los errores al mínimo durante los intentos iniciales de separar el CAM, se recomienda encarecidamente practicar haciendo pequeños agujeros en l.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Mira Hryniuk, BA, por revisar el idioma inglés del artículo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aguja hipodérmica Agani, 19 G | Terumo Europe | AN*1950R1 | Aguja de 19 G para aspirar albúmina |
| Jeringa Terumo, 5 mL concéntrico Luer lock | Terumo Europe | SS*05LE1 | Jeringa estéril de 5 mL |
| Caseviewer v2.2 | 3DHISTECH | Software de análisis de imágenes | |
| Éter dietílico | Merck Chemicals | 603-022-00-4 | Éter estéril para traumatizar la CAM |
| Eosina Y solución acuosa 0,5% | Merck | 1098441000 Solución de tinción | |
| Formaldehído 4% solución acuosa tamponada (Formalina 10%) | VWR | 97139010 | Formaldehído utilizado para la fijación de tejidos |
| Frigorífico | Liebherr | 7081260 | Frigorífico a 4 & grados; C utilizado para la inclusión en parafina |
| Placa calefactora | Schott | SLK2 | Placa calefactora utilizada para secar los portaobjetos |
| Incubadora | Thermo Forma Scientific 3111 | 10365156 | Horno utilizado para la incubación de portaobjetos |
| Microscopio Leica CLS 150 XE Fuente de luz fría | Leica | CLS 150 XE | Focal fuente de luz fría para encender los huevos |
| Pañuelo de limpieza de lentes, grado 541 | VWR | 111-5003 | Tejido para remojar en éter estéril para traumatizar el CAM |
| Hematoxilina de Mayer | MERCK | 1092491000 | Solución de tinción |
| Metanol | VWR | 20847307 | de metanol |
| Microtomo | ThermoScientific-MICROM | HM325-2 | |
| Pannoramic P250 Flash III | 3DHISTECH/ | Escáner de portaobjetos con un aumento de 20x | |
| Paraformaldehído | Merck | 1,04,00,51,000 | Solución de inclusión en parafina |
| Paraplast Plus R | Sigma | P3683-1KG Placa de | parafina |
| , 60x15 mm, estéril | Greiner | 628161 | Placa de Petri estéril |
| Soporte para alfileres | Fine Science Tools | 26016-12 | Soporte para alfileres |
| Polyhatch | Brinsea | CP01F | Incubadora de huevos con rotador automático |
| Hoja de sierra de calar, 132 mm | Sencys | / | Hoja de sierra para crear una ventana en la cáscara del huevo |
| Pasadores de inserción de acero inoxidable | Fine Science Tools | 26007-02 | Pasador recto para hacer un agujero en la cáscara del huevo |
| Steril-Helios | Angelantoni Industrie | ST-00275400000 | Campana de flujo laminar |
| Superfrost Plus bords rodé s 90 y grados; | VWR | 631-9483 | Portaobjetos de vidrio |
| Tissue-Tek VIP 6Al | Sakura | 60320417-0711 VID6E3-1 | Dispositivo de inclusión automático |
| Pinzas de titanio | Fine Science Tools | 11602-16 | Pinzas para la extracción de cáscara de huevo y manipulación de tejido ovárico |
| Tolueno, pa | VWR | 28701364 | Solución de inclusión en parafina |
Referencias
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
- Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C.
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Reimpresiones y permisos
