Identificación de los genes implicados en el desarrollo estomatológico mediante la puntuación del fenotipo epidérmico

Resumen

Este artículo describe dos métodos de fenotipado sin el uso de peelings epidérmicos para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomatizante. El primer método demuestra cómo analizar un fenotipo estomatizado utilizando una epidermis vegetal teñida con azul de toluidina. El segundo método describe cómo identificar ligandos estomacales y monitorear sus actividades biológicas.

Resumen

Los estomas son pequeños poros en la superficie de las plantas terrestres que están involucrados en el intercambio de gases y la liberación de vapor de agua, y su función es crítica para la productividad y supervivencia de las plantas. Como tal, comprender los mecanismos por los cuales se desarrollan y modelan los estomas tiene un tremendo valor agronómico. Este artículo describe dos métodos fenotípicos utilizando Arabidopsis cotiledones que se pueden utilizar para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomático y el patrón. En primer lugar se presentan los procedimientos para analizar los fenotipos estomatizados utilizando cotiledones teñidos con azul de toluidina O. Este método es rápido y confiable y no requiere el uso de peelings epidérmicos, que son ampliamente utilizados para análisis fenotípicos pero requieren capacitación especializada. Debido a la presencia de múltiples residuos de cisteína, la identificación y generación de péptidos EPF bioactivos que tienen un papel en el desarrollo estomático ha sido un desafío. Por lo tanto, se presenta en segundo lugar un procedimiento utilizado para identificar ligandos estomatizados y monitorear su actividad biológica mediante bioensayos. La principal ventaja de este método es que produce datos reproducibles con relativa facilidad al tiempo que reduce la cantidad de solución peptídica y el tiempo requerido para caracterizar el papel de los péptidos en el control del patrón y desarrollo de los estomas. En general, estos protocolos bien diseñados mejoran la eficiencia del estudio de los posibles reguladores estomatales, incluidos los péptidos secretores ricos en cisteína, que requieren estructuras altamente complejas para su actividad.

Introducción

El patrón adecuado y la diferenciación de los estomas vegetales son críticos para su función en dos procesos biológicos fundamentales, la fotosíntesis y la transpiración, y son aplicados por las vías de señalización del péptido EPF. En Arabidopsis, tres péptidos ricos en cisteína secretados, EPF1, EPF2 y STOMAGEN/EPFL9, controlan diferentes aspectos del desarrollo estomatológico y son percibidos por los componentes del receptor de la superficie celular, incluidas las quinasas receptoras de la familia ELECC (ER, ERL1 y ERL2), SERKs y TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Protocolo

1. Tinción de Arabidopsis cotiledones con TBO

1. Esterilización de semillas y condiciones de crecimiento
   1. Esterilice ~ 30 semillas de Arabidopsis por genotipo en un tubo de microcentrífuga agregando 1 ml de una solución de esterilización de semillas (33% lejía comercial, 0.1% Triton X-100) y balancee suavemente durante 10-12 minutos a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Esterilice ~30 semillas de la accesión de Arabidopsis de tipo silvestre Columbia (Col-0) y/o ~60 semillas de plantas transgénicas portadoras de un gen químicamente inducible (por ejemplo, Est::EPF2⁷) para usar plá....

Resultados

Varias plantas y mutantes transgénicos estomatizados que se sabe que tienen menos o más densidad y agrupamiento estomatático (epf2 2,5, epf1 epf2 ^2,5, tmm^12, una^{línea 4} silenciada por STOMAGEN, y líneas transgénicas que llevan la construcción de sobreexpresión Est::EPF1 o Est::EPF2 inducible por estradiol

Discusión

Los dos métodos de análisis fenotípico para identificar y caracterizar los genes que controlan el patrón estomatológico y la diferenciación presentados aquí son ensayos convenientes y confiables, ya que los protocolos no requieren el uso de peelings epidérmicos y equipos especializados (que requieren mucho tiempo y requieren capacitación especial para la preparación de muestras), pero producen imágenes de alta calidad para el análisis cuantitativo de fenotipos epidérmicos.

Una limitación de es.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos de 18 mm x 18 mm	VWR	16004-326
Placas estériles de 24 pocillos con tapa	VWR	CA62406-183
3M Cinta quirúrgica Micropore	Fisher Scientific	19-027-761	Cinta de papel quirúrgico microporosa utilizada para sellar placas MS
76 x 26 mm Portaobjetos de microscopio	TLG	GEW90-2575-03
Ácido acético, ≥ 99.8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Lejía doméstica (por ejemplo, Clorox)
Microscopio confocal	Nikon		Nikon C2 operado por NIS-Elements
Etanol	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Descargado de https://imagej.net/software/fiji/
Pinzas	Sigma-Aldrich	F6521
Mezcla de vitaminas de Gamborg	Cassson Labs	GBL01-100ML	Tienda en 4 & deg; C
Glicerol	Fisher Scientific	G33-4
Cámaras de crecimiento	Conviron,  modelo E15		ciclo de luz de 16 horas, ajustado a 21 grados; C con una intensidad de luz de 120 µ mol· m-2· s-1.
Luces	HD Supply	25272	Fluorescentes  luces en cámaras de crecimiento, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Tubo de microcentrífuga	Fisher Scientific	14-222-155	Tubos en los que se colocan las semillas de Arabidopsis thaliana para realizar la esterilización
Microscopio	Nikon		Nikon Eclipse TiE equipado con una cámara digital DsRi2
Murashige y sales basales Skoog	Tienda Cassson Labs	MSP01-1LT	en 4 ° C
Placa de Petri 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z Placas	de Petri en las que se vierte MS media con el fin de cultivar Arabidopsis thaliana
Yoduro de propidio	VWR	39139-064
Bisturí	Fisher Scientific	08-916-5A
Sacarosa	BioShop	SUC700.5
Azul de toluidina O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758