Identificación de los genes implicados en el desarrollo estomatológico mediante la puntuación del fenotipo epidérmico

Resumen

Este artículo describe dos métodos de fenotipado sin el uso de peelings epidérmicos para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomatizante. El primer método demuestra cómo analizar un fenotipo estomatizado utilizando una epidermis vegetal teñida con azul de toluidina. El segundo método describe cómo identificar ligandos estomacales y monitorear sus actividades biológicas.

Resumen

Los estomas son pequeños poros en la superficie de las plantas terrestres que están involucrados en el intercambio de gases y la liberación de vapor de agua, y su función es crítica para la productividad y supervivencia de las plantas. Como tal, comprender los mecanismos por los cuales se desarrollan y modelan los estomas tiene un tremendo valor agronómico. Este artículo describe dos métodos fenotípicos utilizando Arabidopsis cotiledones que se pueden utilizar para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomático y el patrón. En primer lugar se presentan los procedimientos para analizar los fenotipos estomatizados utilizando cotiledones teñidos con azul de toluidina O. Este método es rápido y confiable y no requiere el uso de peelings epidérmicos, que son ampliamente utilizados para análisis fenotípicos pero requieren capacitación especializada. Debido a la presencia de múltiples residuos de cisteína, la identificación y generación de péptidos EPF bioactivos que tienen un papel en el desarrollo estomático ha sido un desafío. Por lo tanto, se presenta en segundo lugar un procedimiento utilizado para identificar ligandos estomatizados y monitorear su actividad biológica mediante bioensayos. La principal ventaja de este método es que produce datos reproducibles con relativa facilidad al tiempo que reduce la cantidad de solución peptídica y el tiempo requerido para caracterizar el papel de los péptidos en el control del patrón y desarrollo de los estomas. En general, estos protocolos bien diseñados mejoran la eficiencia del estudio de los posibles reguladores estomatales, incluidos los péptidos secretores ricos en cisteína, que requieren estructuras altamente complejas para su actividad.

Introducción

El patrón adecuado y la diferenciación de los estomas vegetales son críticos para su función en dos procesos biológicos fundamentales, la fotosíntesis y la transpiración, y son aplicados por las vías de señalización del péptido EPF. En Arabidopsis, tres péptidos ricos en cisteína secretados, EPF1, EPF2 y STOMAGEN/EPFL9, controlan diferentes aspectos del desarrollo estomatológico y son percibidos por los componentes del receptor de la superficie celular, incluidas las quinasas receptoras de la familia ELECC (ER, ERL1 y ERL2), SERKs y TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Este reconocimiento conduce entonces a la regulación a la baja de los factores de transcripción que promueven la diferenciación estomática por un proceso dependiente de MAPK¹¹. El descubrimiento de estos genes estomatizados centrales se logra principalmente mediante el cribado fenotípico de mutantes que exhiben defectos epidérmicos. Este artículo presenta métodos de fenotipado relativamente simples y eficientes para visualizar los estomas y otras células epidérmicas, que son necesarios para identificar y caracterizar los genes potenciales que controlan el patrón y la diferenciación de los estomas.

La observación de los detalles de la epidermis vegetal se ha logrado típicamente mediante el uso de peelings epidérmicos con o sin tinción con un colorante como el azul de toluidina O (TBO) o la safranina^12,13,14. Sin embargo, el principal desafío de estos métodos es que requieren capacitación especializada para pelar la epidermis de la hoja sin desgarrar los tejidos y para observar y analizar cuidadosamente los datos de patrones mientras se evitan las imágenes tomadas de diferentes partes de la hoja. Los tratamientos químicos para limpiar las muestras de tejido con reactivos como las soluciones de limpieza a base de hidrato de cloral también se han utilizado ampliamente para una amplia gama de materiales biológicos ^8,15; Estos tratamientos generan una gran cantidad de información fenotípica al proporcionar imágenes de alta calidad, pero también requieren el uso de productos químicos peligrosos (por ejemplo, formaldehído, hidrato de cloral). Este documento presenta primero un método de fenotipado relativamente fácil y conveniente que produce imágenes suficientes para el análisis cuantitativo, pero no requiere el uso de productos químicos peligrosos y peelings de hojas epidérmicas para la preparación de la muestra. Una epidermis de cotiledón teñida con TBO también es ideal para el estudio del desarrollo estomatizado porque la falta de tricomas y el gradiente de desarrollo más pequeño en los cotiledones permiten la interpretación simple y manejable de los fenotipos epidérmicos.

Los péptidos EPF estomatizados pertenecen al grupo de péptidos ricos en cisteína específicos de plantas que tienen tamaños maduros relativamente grandes y enlaces disulfuro intramoleculares entre residuos de cisteína conservados. El plegamiento conformacional correcto es crítico para su función biológica, pero los péptidos ricos en cisteína, que se producen por síntesis química o por un sistema de recombinación heterólogo, pueden estar inactivos y son una mezcla de péptidos correctamente plegados y desplegados ^3,7,16. Por lo tanto, la selección de péptidos bioactivos que tienen un papel en el control del desarrollo estomático ha sido una tarea muy difícil. Este manuscrito describe adicionalmente un bioensayo para la mejor identificación y caracterización de péptidos estomacales bioactivos. En este método, las plántulas de Arabidopsis se cultivan en una placa de múltiples pocillos que contiene medios con y sin péptidos potenciales durante 6-7 días. Luego, la epidermis de cotiledón se visualiza usando un microscopio confocal. En general, para visualizar claramente la actividad biológica de los péptidos potenciales en el desarrollo estomatal, se utilizan los genotipos que producen más y/o menos células de linaje estomatárico, como el mutante epf2, que produce más células epidérmicas, y la línea STOMAGEN-ami, que confiere una densidad celular epidérmica reducida ^2,4,5, además del control de Arabidopsis de tipo salvaje (Col-0) para los bioensayos.

En general, los dos protocolos presentados aquí se pueden utilizar para la evaluación rápida y eficiente de varios fenotipos epidérmicos y para la detección de pequeños péptidos y hormonas que tienen un papel en el control del patrón y desarrollo de los estomas.

Protocolo

1. Tinción de Arabidopsis cotiledones con TBO

1. Esterilización de semillas y condiciones de crecimiento
   1. Esterilice ~ 30 semillas de Arabidopsis por genotipo en un tubo de microcentrífuga agregando 1 ml de una solución de esterilización de semillas (33% lejía comercial, 0.1% Triton X-100) y balancee suavemente durante 10-12 minutos a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Esterilice ~30 semillas de la accesión de Arabidopsis de tipo silvestre Columbia (Col-0) y/o ~60 semillas de plantas transgénicas portadoras de un gen químicamente inducible (por ejemplo, Est::EPF2⁷) para usar plántulas transgénicas cultivadas en 1/2 placas de Murashige y Skoog (MS) (2.16 g/L que contienen 0.8% de agar [p/v]) sin inductor (por ejemplo, β-estradiol) como controles (Figura 1 y Figura 2).
   2. Retire la solución de esterilización, lave las semillas cuatro veces con 1 ml de agua estéril en una campana de flujo laminar y vuelva a suspenderlas en ~ 200 μL de agar estéril al 0,1%.
   3. Siembrar ~30 semillas por genotipo en placas de agar 1/2 MS o 1/2 placas de agar MS que contengan un inductor (por ejemplo, 10 μM β-estradiol) para la inducción química del transgén (por ejemplo, Est::EPF2⁷) usando una pipeta, y sellar con cinta de microporos.
      NOTA: Las semillas deben distribuirse uniformemente en el plato para evitar colocarlas muy cerca, ya que esto evitará que las plántulas crezcan uniformemente.
   4. Estratificar las semillas colocando las placas a 4 °C sin luz durante 3-5 días para sincronizar la germinación.
   5. Después de la estratificación, incubar las placas en una cámara de crecimiento a 22 °C bajo 120 μmol·m−²·^s−1 de luz con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad durante 10 días.
2. Muestreo y tinción TBO de Arabidopsis cotyledons
   1. A los 10 días posteriores a la germinación, seleccione cuidadosamente y corte uno de los cotiledones de las plántulas individuales que crecen uniformemente con otras plántulas en la placa para limitar la variabilidad.
      NOTA: Los cotiledones se muestrean de plántulas de 10 días de edad porque no tienen tricomas ni células de epidermis inmaduras, lo que simplifica la interpretación de los fenotipos epidérmicos.
   2. Coloque cada cotiledón en un tubo de microcentrífuga que contenga 1 ml de una solución de fijación (etanol 9:1 a ácido acético) usando fórceps, y deje la muestra en la solución de fijación durante la noche, como mínimo y a temperatura ambiente.
      NOTA: Las muestras se pueden almacenar hasta por un par de años en esta condición. La imagen Figura 2E se tomó de una muestra de cotiledón que se almacenó en solución de fijación durante más de 3 años. Es importante mantener el cotiledón en una solución de fijación inmediatamente después del corte y no colocar más de cinco cotiledones en cada tubo de microcentrífuga para la preparación homogénea de la muestra más adelante.
   3. Retire la solución de fijación y agregue 1 ml de etanol al 70%. Después de invertir el tubo un par de veces, deje el tubo que contiene las muestras en RT durante ~ 30 min.
   4. Repita el paso 1.2.3 usando 1 ml de etanol al 50% y luego etanol al 20%.
   5. Reemplace el 1 ml de etanol al 20% con 1 ml de agua destilada, y luego deje el tubo que contiene las muestras de cotiledón durante ~ 30 minutos después de invertir el tubo varias veces.
      NOTA: Las muestras pueden permanecer en agua destilada durante más de 24 h, pero esto no se recomienda para obtener imágenes de buena calidad (imágenes bien teñidas para diferentes tipos de células epidérmicas) para el análisis cuantitativo.
   6. Retire toda el agua destilada del tubo. Luego, agregue inmediatamente ~ 200 μL de solución de tinción TBO (0.5% TBO en H 2 O, filtrado) durante ~₂min.
      NOTA: Asegúrese de que cada muestra de cotiledón esté expuesta uniformemente a la solución TBO moviendo suavemente los tubos durante la incubación. Para evitar la sobretinción con TBO (el momento de la tinción es esencial y puede ser variable para cada genotipo), no procese más de seis tubos que contengan muestras a la vez.
   7. Retire la solución de tinción TBO lo más completamente posible, y luego lave inmediatamente las muestras un par de veces agregando 1 ml de agua destilada fresca.
3. Imágenes y análisis de datos
   1. Tome un portaobjetos de microscopio y agregue una gota de glicerol al 15% (~ 50 μL). Coloque el cotiledón con el lado abaxial hacia arriba en glicerol al 15% en el portaobjetos usando pinzas finas. Luego, cúbralo suavemente con un cubreobjetos para que cualquier burbuja de aire formada pueda eliminarse de la muestra.
   2. Obtener imágenes del lado abaxial de la epidermis del cotiledón utilizando un microscopio de campo claro (Figura 1 y Figura 2), y luego examinar el fenotipo epidérmico contando el número de estomas y otros tipos de células epidérmicas.
   3. Para cada genotipo, calcular el fenotipo epidérmico utilizando las siguientes fórmulas descritas por Jangra et ^al.17:
      Índice estomatológico (%) = (Número de estomas/Número total de células epidérmicas) × 100
      Densidad estomática (mm⁻²) = Número de estomas/área (mm²)
      NOTA: Imagine al menos ocho cotiledones (N = 8) para cada genotipo, y documente el fenotipo epidérmico de cada genotipo comparándolo con el fenotipo de la planta de tipo silvestre y / o plantas transgénicas que expresan un transgen químicamente inducible cultivado sin un inductor.

2. Bioensayos para péptidos estomatizados

NOTA: El procedimiento para los bioensayos se muestra en la Figura 3.

1. Esterilización de semillas y condiciones de crecimiento
   1. Esterilice ~ 25 semillas para cada tratamiento como se mencionó anteriormente, y siembre aproximadamente la mitad de las semillas en cada una de las dos placas de agar 1/2 MS en una campana de flujo laminar.
      NOTA: Utilice el genotipo con células epidérmicas altas y/o bajas (por ejemplo, epf2²) en lugar de utilizar un fondo de tipo salvaje (por ejemplo, Col-0) para detectar fácilmente las actividades biológicas de los péptidos en el patrón y la diferenciación de las células epidérmicas (Figura 4).
   2. Estratificar las semillas durante 3 días a 4 °C en la oscuridad.
   3. Sacar cada una de las dos placas a intervalos de ~10 h, e incubar las semillas en placas a 22 °C bajo 120 μmol·m−²·s⁻¹ de luz con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad durante 1 día.
2. Tratamiento con péptidos e imágenes
   1. En una campana de flujo laminar, transplante cuidadosamente 10-12 plántulas de Arabidopsis de un día de edad de cada una de las dos placas preparadas en una placa de 24 pocillos que contenga 1.5 ml de medio líquido de 1/2 MS en cada pocillo (~ 20 plántulas por pozo).
      NOTA: El momento del tratamiento con péptidos para las plántulas es crítico para los resultados fenotípicos del tratamiento con péptidos, así que prepare las semillas en dos placas separadas para obtener dos etapas diferentes de desarrollo de plántulas para el tratamiento.
   2. Agregue un tampón solo (50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) o dos concentraciones diferentes del péptido (típicamente, péptido 1 μM y 2.5 μM en 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) a cada pocillo que contiene ~ 20 plántulas de Arabidopsis de un día germinadas en placas de agar MS de 1/2.
      NOTA: Retire las alícuotas de la solución peptídica de un congelador y manténgalas en RT durante unos minutos antes del tratamiento. Los péptidos almacenados en un congelador a -80 °C son estables durante un par de años, pero los ciclos de congelación-descongelación deben evitarse almacenando la solución peptídica en pequeñas alícuotas.
   3. Después de mezclar suavemente las plántulas con un tampón solo o una solución peptídica con una pipeta, selle la placa con cinta de microporos. Incubar la placa de ensayo en condiciones de días largos (fotoperiodo de 16 h, 120 μmol·m−2·s⁻¹ luz) durante 5-7 días a ²² °C.
      NOTA: Evite que las plántulas crezcan demasiado juntas para permitir que cada plántula tenga una exposición uniforme a la solución peptídica. Gire suavemente la placa durante 2-3 h antes de incubar la placa en una cámara de crecimiento para aumentar la aireación.
   4. Transfiera cada plántula del pozo que contiene tampón solo o péptido en un portaobjetos de cobertura, y diseccione el cotiledón de la plántula. Coloque el lado abaxial del cotiledón con pinzas y córtelo en trozos pequeños.
   5. Tome otro portaobjetos de microscopio limpio y coloque sobre él una gota de solución de yoduro de propidio (~ 25 μL, 2 mg / ml en H₂O).
   6. Coloque uno de los trozos pequeños de cotiledón en una gota de solución de yoduro de propidio con fórceps y coloque suavemente el cubreobjetos. Aplique una solución adicional de yoduro de propidio en el borde del cubreobjetos para eliminar cualquier burbuja de aire que se haya formado.
   7. Obtener una imagen del lado abaxial del cotiledón usando un microscopio confocal y comparar las imágenes con las imágenes de plántulas cultivadas en medio 1/2 MS que contiene tampón solamente.
      NOTA: Las imágenes presentadas en la Figura 4 se tomaron de plántulas Col-0 o epf2^2,5 de tipo silvestre que se trataron solo con tampón (Figura 4A, B) o dos lotes de solución peptídica EPF2 (Figura 4C-F) y se almacenaron a -80 °C durante 1 año.

Resultados

Varias plantas y mutantes transgénicos estomatizados que se sabe que tienen menos o más densidad y agrupamiento estomatático (epf2 2,5, epf1 epf2 ^2,5, tmm^12, una^{línea 4} silenciada por STOMAGEN, y líneas transgénicas que llevan la construcción de sobreexpresión Est::EPF1 o Est::EPF2 inducible por estradiol

Discusión

Los dos métodos de análisis fenotípico para identificar y caracterizar los genes que controlan el patrón estomatológico y la diferenciación presentados aquí son ensayos convenientes y confiables, ya que los protocolos no requieren el uso de peelings epidérmicos y equipos especializados (que requieren mucho tiempo y requieren capacitación especial para la preparación de muestras), pero producen imágenes de alta calidad para el análisis cuantitativo de fenotipos epidérmicos.

Una limitación de es...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos de 18 mm x 18 mm	VWR	16004-326
Placas estériles de 24 pocillos con tapa	VWR	CA62406-183
3M Cinta quirúrgica Micropore	Fisher Scientific	19-027-761	Cinta de papel quirúrgico microporosa utilizada para sellar placas MS
76 x 26 mm Portaobjetos de microscopio	TLG	GEW90-2575-03
Ácido acético, ≥ 99.8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Lejía doméstica (por ejemplo, Clorox)
Microscopio confocal	Nikon		Nikon C2 operado por NIS-Elements
Etanol	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Descargado de https://imagej.net/software/fiji/
Pinzas	Sigma-Aldrich	F6521
Mezcla de vitaminas de Gamborg	Cassson Labs	GBL01-100ML	Tienda en 4 & deg; C
Glicerol	Fisher Scientific	G33-4
Cámaras de crecimiento	Conviron,  modelo E15		ciclo de luz de 16 horas, ajustado a 21 grados; C con una intensidad de luz de 120 µ mol· m-2· s-1.
Luces	HD Supply	25272	Fluorescentes  luces en cámaras de crecimiento, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Tubo de microcentrífuga	Fisher Scientific	14-222-155	Tubos en los que se colocan las semillas de Arabidopsis thaliana para realizar la esterilización
Microscopio	Nikon		Nikon Eclipse TiE equipado con una cámara digital DsRi2
Murashige y sales basales Skoog	Tienda Cassson Labs	MSP01-1LT	en 4 ° C
Placa de Petri 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z Placas	de Petri en las que se vierte MS media con el fin de cultivar Arabidopsis thaliana
Yoduro de propidio	VWR	39139-064
Bisturí	Fisher Scientific	08-916-5A
Sacarosa	BioShop	SUC700.5
Azul de toluidina O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758