Artículo de método

TACI: Un plugin de ImageJ para el análisis de imágenes de calcio 3D

DOI:

10.3791/64953

⸱

16 de diciembre de 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2CMU-Pitt Joint Computational Biology, School of Medicine, University of Pittsburgh, 3Eastern Virginia Medical School, 4Department of Physics, University of Miami

En este artículo

Resumen

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TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) es un complemento de código abierto de ImageJ para el análisis de imágenes de calcio en 3D que examina el movimiento en el eje z e identifica el valor máximo de cada pila z para representar la intensidad de una celda en el punto de tiempo correspondiente. Puede separar neuronas que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero en diferentes planos z.

Resumen

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La investigación en neurociencia ha evolucionado para utilizar imágenes complejas y herramientas computacionales para extraer información completa de conjuntos de datos. La imagen de calcio es una técnica ampliamente utilizada que requiere un software sofisticado para obtener resultados confiables, pero muchos laboratorios luchan por adoptar métodos computacionales al actualizar los protocolos para cumplir con los estándares modernos. Las dificultades surgen debido a la falta de conocimientos de programación y paywalls para el software. Además, las células de interés muestran movimientos en todas las direcciones durante las imágenes de calcio. Se han desarrollado muchos enfoques para corregir el movimiento en la dirección lateral (x / y).

Este documento describe un flujo de trabajo utilizando un nuevo complemento de ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), para examinar el movimiento en el eje z en imágenes de calcio 3D. Este software identifica el valor máximo de fluorescencia de todas las posiciones z en las que aparece una neurona y lo utiliza para representar la intensidad de la neurona en la posición t correspondiente. Por lo tanto, esta herramienta puede separar neuronas que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero que aparecen en distintos planos z. Como complemento de ImageJ, TACI es una herramienta computacional de código abierto fácil de usar para el análisis de imágenes de calcio en 3D. Validamos este flujo de trabajo utilizando neuronas termosensibles larvales de mosca que mostraban movimientos en todas las direcciones durante la fluctuación de la temperatura y un conjunto de datos de imágenes de calcio en 3D adquiridos del cerebro de la mosca.

Introducción

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El nivel de calcio intracelular es un marcador preciso de excitabilidad neuronal. La imagen de calcio mide los cambios en el calcio intracelular para comprender la actividad neuronal1. Los estudios en neurociencia han utilizado cada vez más este método debido al desarrollo de técnicas para medir la concentración intracelular de calcio, incluidos los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP2,3, que pueden expresarse de forma no invasiva en conjuntos específicos de neuronas a través de enfoques genéticos. Los menores costos de los láseres y los componentes del mi....

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Protocolo

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1. Imágenes de calcio

  1. Preparación de larvas de mosca
    NOTA: Las moscas y larvas se mantienen a 25 °C bajo un ciclo de luz:oscuridad de 12 h:12 h.
    1. Anestesiar las moscas conCO2. Clasificar 20-45 machos y 20-45 hembras en cada vial de mosca, y darles al menos 24 h a 48 h para recuperarse de la exposición alCO2 .
      NOTA: La exposición de las moscas alCO2 debe durar el menor tiempo posible.
    2. Para sincronizar la edad de las larvas, golpee sobre las moscas en nuevos viales que contengan gránulos de levadura y déjelas 4-8 h para poner huevos. Retire las moscas volteándolas en viales nuevos.
      3. ....

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Resultados

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Flujo de trabajo del análisis de imágenes de calcio 3D
En este estudio, desarrollamos un nuevo complemento de ImageJ, TACI, y describimos un flujo de trabajo para rastrear la deriva z y analizar imágenes de calcio 3D que señalan las respuestas de las células individuales que aparecen en múltiples posiciones z (Figura 1). Esta herramienta tiene cuatro funciones: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT y MERGE. En primer.......

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Discusión

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Este estudio desarrolló un nuevo complemento de ImageJ, TACI, y describió un flujo de trabajo que analiza las imágenes de calcio en 3D. Muchas herramientas actualmente disponibles se centran en corregir el movimiento x/y, aunque el movimiento en el eje z también necesita ser diagnosticado o corregido explícitamente6. Durante la adquisición de imágenes en un organismo vivo, el movimiento en el eje z es inevitable incluso cuando el organismo está inmovilizado, y algunos estímulos, como el cambio de .......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Se utilizó un Zeiss LSM 880 en el Fralin Imaging Center para recopilar los datos de imágenes de calcio. Agradecemos a la Dra. Michelle L Olsen y Yuhang Pan por su ayuda con el software IMARIS. Agradecemos al Dr. Lenwood S. Heath por sus comentarios constructivos sobre el manuscrito y a Steven Giavasis por sus comentarios sobre el archivo README de GitHub. Este trabajo fue apoyado por NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) y NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
NeedelBD 303129
Cloruro de calcio dihidratadoFisher Scientific 10035-04-8 Ingrediente dealimento para moscas
Dióxido de carbonoAirgasUN1013Tamaño 200 Cilindro de acero de alta presión
Kit de burbujeo CO2Genesee 59-180
Microscopio confocal LSM880Zeiss4109002107876000Un Axio Observer Z1 invertido, equipado con 5 láseres, 2 detectores PMT estándar, detectores GaAsP de 32 canales, un detector Airyscan y Definite Enfoque.2.
DAQami software Computaciónde medición
DextrosaGenesee62-113 Ingrediente dealimento para moscas
Drosophila AgarGenesee66-111Ingrediente de alimento para moscas
EtanolDecon Labs, Inc.64-17-5 Ingrediente dealimento para moscas Línea
mosca: Ir21a-Gal4Dr. Paul Garrity laboratorioUn amable regalo
Línea de mosca: Ir21a-Gal80Dr. Lina Ni laboratorio
Línea de mosca: Ir68a-Gal4Dr. Aravinthan DT Samuel laboratorioUn amable regalo
Línea de mosca: Ir93a-Gal4Dr. Paul Garrity laboratorioUn regalo amable
Línea de moscas: UAS-GCaMP6Bloomington Drosophila Stock Center42750
FlypadGenesee59-114
Regulador de latón forjado de uso generalGentecG152
Gibco PBS pH 7.4 (1x)Thermo Fisher Scientific10010-031
Tubo de Drosophila verdeGenesee59-124
Compuesto de transferencia de calorMG Chemicals860-60G
DisipadorDigi-Key ElectronicsATS2193-NDCambiar tamaño a 12,9 x 5,5 cm
IluminadorAmScopeLED-6W
Levadura seca inactivaGenesee62-108Ingrediente de alimento para moscas
IncubadoraPervicalDR-41VLCiclo de luz: oscuridad: 12h:12h; Temperatura: 25 ° C; humedad: 40-50% HR.
Metil-4-hidroxibenzoatoThermo Scientific126965000Alimento para moscas ingrediete
Micro cubreobjetosVWR  48382-12622 x 40 mm
Portaobjetos de microscopioFisher Scientific 12-544-225 x 75 x 1,0 mm
Esmalte de uñasKleancolor
Viales estrechos de DrosophilaGenesee32-113RL
Objetivo Zeiss420852-9871-000LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27
Módulo de refrigeración PeltierTE TechnologyTE-127-1.0-0.830 x 30 mm
EnchufesGenesee49-102
Fuente de alimentaciónEspecialistas en circuitosCSI1802X10 voltios DC 2.0 amperios fuente de alimentación de banco lineal
Princeton Artist Brush NepturePrinceton Artist Brush Co.Serie 4750, tamaño 2
L-tartrato de sodio y potasio tetrahidratadoThermo Scientific033241-36Ingrediente de alimento para moscas
Inserto de etapa Wienecke y Sinske432339-9030-000
Microscopio estereoscópicoOlympusSZ61Cualquier microscopio estereoscópico funciona
T-FittingGenesee59-123
Dispositivo de adquisición de datos de termoparCálculo de mediciónUSB-2001-TCMicrosonda de
termoparPhysitempIT-24P 
Harina de maíz amarillaGenesee62-101Ingrediente de alimento para moscas
etapa piezoeléctrica del eje ZWienecke y Sinske432339-9000-000
de monocanal

Referencias

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  1. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Zhang, Y.....

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Etiquetas

Imagen de calcio en 3Dmovimiento del eje Zextracci n de la intensidad de fluorescenciaan lisis con TrackMateneuronas de larvas de moscamicroscop a confocalprocesamiento de im genes TIFFim genes de c digo abierto

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