TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) es un complemento de código abierto de ImageJ para el análisis de imágenes de calcio en 3D que examina el movimiento en el eje z e identifica el valor máximo de cada pila z para representar la intensidad de una celda en el punto de tiempo correspondiente. Puede separar neuronas que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero en diferentes planos z.
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Artículo de método
TACI: Un plugin de ImageJ para el análisis de imágenes de calcio 3D
En este artículo
Resumen
Resumen
La investigación en neurociencia ha evolucionado para utilizar imágenes complejas y herramientas computacionales para extraer información completa de conjuntos de datos. La imagen de calcio es una técnica ampliamente utilizada que requiere un software sofisticado para obtener resultados confiables, pero muchos laboratorios luchan por adoptar métodos computacionales al actualizar los protocolos para cumplir con los estándares modernos. Las dificultades surgen debido a la falta de conocimientos de programación y paywalls para el software. Además, las células de interés muestran movimientos en todas las direcciones durante las imágenes de calcio. Se han desarrollado muchos enfoques para corregir el movimiento en la dirección lateral (x / y).
Este documento describe un flujo de trabajo utilizando un nuevo complemento de ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), para examinar el movimiento en el eje z en imágenes de calcio 3D. Este software identifica el valor máximo de fluorescencia de todas las posiciones z en las que aparece una neurona y lo utiliza para representar la intensidad de la neurona en la posición t correspondiente. Por lo tanto, esta herramienta puede separar neuronas que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero que aparecen en distintos planos z. Como complemento de ImageJ, TACI es una herramienta computacional de código abierto fácil de usar para el análisis de imágenes de calcio en 3D. Validamos este flujo de trabajo utilizando neuronas termosensibles larvales de mosca que mostraban movimientos en todas las direcciones durante la fluctuación de la temperatura y un conjunto de datos de imágenes de calcio en 3D adquiridos del cerebro de la mosca.
Introducción
El nivel de calcio intracelular es un marcador preciso de excitabilidad neuronal. La imagen de calcio mide los cambios en el calcio intracelular para comprender la actividad neuronal1. Los estudios en neurociencia han utilizado cada vez más este método debido al desarrollo de técnicas para medir la concentración intracelular de calcio, incluidos los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP2,3, que pueden expresarse de forma no invasiva en conjuntos específicos de neuronas a través de enfoques genéticos. Los menores costos de los láseres y los componentes del mi....
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Protocolo
1. Imágenes de calcio
- Preparación de larvas de mosca
NOTA: Las moscas y larvas se mantienen a 25 °C bajo un ciclo de luz:oscuridad de 12 h:12 h.- Anestesiar las moscas conCO2. Clasificar 20-45 machos y 20-45 hembras en cada vial de mosca, y darles al menos 24 h a 48 h para recuperarse de la exposición alCO2 .
NOTA: La exposición de las moscas alCO2 debe durar el menor tiempo posible. - Para sincronizar la edad de las larvas, golpee sobre las moscas en nuevos viales que contengan gránulos de levadura y déjelas 4-8 h para poner huevos. Retire las moscas volteándolas en viales nuevos. ....
- Anestesiar las moscas conCO2. Clasificar 20-45 machos y 20-45 hembras en cada vial de mosca, y darles al menos 24 h a 48 h para recuperarse de la exposición alCO2 .
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Resultados
Flujo de trabajo del análisis de imágenes de calcio 3D
En este estudio, desarrollamos un nuevo complemento de ImageJ, TACI, y describimos un flujo de trabajo para rastrear la deriva z y analizar imágenes de calcio 3D que señalan las respuestas de las células individuales que aparecen en múltiples posiciones z (Figura 1). Esta herramienta tiene cuatro funciones: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT y MERGE. En primer.......
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Discusión
Este estudio desarrolló un nuevo complemento de ImageJ, TACI, y describió un flujo de trabajo que analiza las imágenes de calcio en 3D. Muchas herramientas actualmente disponibles se centran en corregir el movimiento x/y, aunque el movimiento en el eje z también necesita ser diagnosticado o corregido explícitamente6. Durante la adquisición de imágenes en un organismo vivo, el movimiento en el eje z es inevitable incluso cuando el organismo está inmovilizado, y algunos estímulos, como el cambio de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Se utilizó un Zeiss LSM 880 en el Fralin Imaging Center para recopilar los datos de imágenes de calcio. Agradecemos a la Dra. Michelle L Olsen y Yuhang Pan por su ayuda con el software IMARIS. Agradecemos al Dr. Lenwood S. Heath por sus comentarios constructivos sobre el manuscrito y a Steven Giavasis por sus comentarios sobre el archivo README de GitHub. Este trabajo fue apoyado por NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) y NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Needel | BD 303129 | ||
| Cloruro de calcio dihidratado | Fisher Scientific | 10035-04-8 Ingrediente de | alimento para moscas |
| Dióxido de carbono | Airgas | UN1013 | Tamaño 200 Cilindro de acero de alta presión |
| Kit de burbujeo CO2 | Genesee 59-180 | ||
| Microscopio confocal LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | Un Axio Observer Z1 invertido, equipado con 5 láseres, 2 detectores PMT estándar, detectores GaAsP de 32 canales, un detector Airyscan y Definite Enfoque.2. |
| DAQami software Computación | de medición | ||
| Dextrosa | Genesee | 62-113 Ingrediente de | alimento para moscas |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Ingrediente de alimento para moscas |
| Etanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 Ingrediente de | alimento para moscas Línea |
| mosca: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity laboratorio | Un amable regalo | |
| Línea de mosca: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni laboratorio | ||
| Línea de mosca: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel laboratorio | Un amable regalo | |
| Línea de mosca: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity laboratorio | Un regalo amable | |
| Línea de moscas: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| Regulador de latón forjado de uso general | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Tubo de Drosophila verde | Genesee | 59-124 | |
| Compuesto de transferencia de calor | MG Chemicals | 860-60G | |
| Disipador | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Cambiar tamaño a 12,9 x 5,5 cm |
| Iluminador | AmScope | LED-6W | |
| Levadura seca inactiva | Genesee | 62-108 | Ingrediente de alimento para moscas |
| Incubadora | Pervical | DR-41VL | Ciclo de luz: oscuridad: 12h:12h; Temperatura: 25 ° C; humedad: 40-50% HR. |
| Metil-4-hidroxibenzoato | Thermo Scientific | 126965000 | Alimento para moscas ingrediete |
| Micro cubreobjetos | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1,0 mm |
| Esmalte de uñas | Kleancolor | ||
| Viales estrechos de Drosophila | Genesee | 32-113RL | |
| Objetivo | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Módulo de refrigeración Peltier | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Enchufes | Genesee | 49-102 | |
| Fuente de alimentación | Especialistas en circuitos | CSI1802X | 10 voltios DC 2.0 amperios fuente de alimentación de banco lineal |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Serie 4750, tamaño 2 | |
| L-tartrato de sodio y potasio tetrahidratado | Thermo Scientific | 033241-36 | Ingrediente de alimento para moscas |
| Inserto de etapa | Wienecke y Sinske | 432339-9030-000 | |
| Microscopio estereoscópico | Olympus | SZ61 | Cualquier microscopio estereoscópico funciona |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Dispositivo de adquisición de datos de termopar | Cálculo de medición | USB-2001-TC | Microsonda de |
| termopar | Physitemp | IT-24P | |
| Harina de maíz amarilla | Genesee | 62-101 | Ingrediente de alimento para moscas |
| etapa piezoeléctrica del eje Z | Wienecke y Sinske | 432339-9000-000 |
Referencias
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y.....
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Reimpresiones y permisos
