Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine FeCl3-vermittelte Verletzung verwendet werden kann, um eine arterielle Thrombose zu induzieren, und wie arterielle Verletzungsproben in verschiedenen Stadien der Thrombose für die elektronenmikroskopische Analyse gesammelt und vorbereitet werden.
Abstract
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Aberrante Thrombosen sind ein häufiges Merkmal von systemischen Erkrankungen wie Diabetes und Fettleibigkeit sowie chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose, Krebs und Autoimmunerkrankungen. Bei einer Gefäßverletzung wirken in der Regel das Gerinnungssystem, die Blutplättchen und das Endothel orchestriert, um Blutungen zu verhindern, indem sie an der Stelle der Verletzung ein Gerinnsel bilden. Anomalien in diesem Prozess führen entweder zu übermäßigen Blutungen oder zu unkontrollierten Thrombosen/unzureichender antithrombotischer Aktivität, was sich in einem Gefäßverschluss und seinen Folgen niederschlägt. Das FeCl 3-induzierte Carotis-Verletzungsmodell ist ein wertvolles Werkzeug, um zu untersuchen, wie eine Thrombose in vivo beginnt und fortschreitet. Dieses Modell beinhaltet eine Endothelschädigung/Denudation und die anschließende Gerinnselbildung an der verletzten Stelle. Es bietet einen hochempfindlichen, quantitativen Assay zur Überwachung von Gefäßschäden und Gerinnselbildung als Reaktion auf unterschiedlich schwere Gefäßschäden. Nach der Optimierung kann diese Standardtechnik verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Thrombose zugrunde liegen, sowie die ultrastrukturellen Veränderungen der Blutplättchen in einem wachsenden Thrombus. Dieser Assay ist auch nützlich, um die Wirksamkeit von Antithrombotika und Thrombozytenaggregationshemmern zu untersuchen. In diesem Artikel wird erläutert, wie eine FeCl 3-induzierte arterielle Thrombose initiiert und überwacht wird und wie Proben für die elektronenmikroskopische Analyse entnommen werden.
Introduction
Thrombose ist die Bildung eines Blutgerinnsels, das ein Blutgefäß teilweise oder vollständig blockiert und den natürlichen Blutfluss behindert. Dies führt zu schweren und tödlichen kardiovaskulären Ereignissen wie ischämischen Herzerkrankungen und Schlaganfällen. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität und verursachen weltweit jeden vierten Todesfall 1,2,3. Obwohl sich eine Thrombose als Fehlfunktion des Gefäßsystems manifestiert, kann sie auf eine zugrunde liegende mikrobielle oder virale Infektion, eine Immunstörung, eine Malignität oder einen Stoffwechselzustand zurückzuführen sein. Der Blutfluss wird durch das komplexe Zusammenspiel zwischen verschiedenen Komponenten des Gefäßsystems aufrechterhalten, einschließlich Endothelzellen, roten/weißen Blutkörperchen, Blutplättchen und Gerinnungsfaktoren4. Bei einer Gefäßverletzung interagieren Blutplättchen mit adhäsiven Proteinen auf der subendothelialen Matrix und setzen ihren körnigen Inhalt frei, der mehr Blutplättchen rekrutiert5. Gleichzeitig wird die Gerinnungskaskade aktiviert, was zur Fibrinbildung und -ablagerung führt. Letztendlich wird ein Gerinnsel gebildet, das Blutplättchen und rote Blutkörperchen enthält, die in einem Fibrinnetzeingeschlossen sind 6. Obwohl Thrombozytenaggregationshemmer und Antikoagulanzien zur Modulation von Thrombosen zur Verfügung stehen, bleiben unechte Blutungen bei diesen Therapien ein großes Problem, das eine Feinabstimmung der Dosierungen und Kombinationen dieser Medikamente erfordert. Daher besteht nach wie vor ein dringender Bedarf, neue antithrombotische Medikamente zu entdecken7.
Thrombosen werden mit mehreren Methoden untersucht, um Gefäßverletzungen zuzufügen: mechanisch (Gefäßligatur), thermisch (Laserverletzung) und chemisch (FeCl3 / Rose Bengal-Anwendung). Die Art der Thrombose variiert je nach Lokalisation (arteriell vs. venös), Methode oder Ausmaß der Verletzung. Unter all diesen Typen ist die FeCl 3-induzierte Gefäßverletzung die am weitesten verbreitete Methode. Es wurde bei Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen und Hundeneingesetzt 8,9,10,11,12. Die Methode ist relativ einfach, leicht anzuwenden, und wenn die wichtigsten Parameter standardisiert sind, ist sie in verschiedenen Gefäßsystemen (z. B. Arterien [Halsschlagader und Femur], Venen [Jugular] und Arteriolen [Kremaster und Mesenterium]) empfindlich und reproduzierbar (Ergänzungstabelle 1).
Dieses Modell kann auch verwendet werden, um unser Verständnis der Mechanik und Morphologie der Gerinnselbildung zu erweitern. Diese Technik bietet auf einzigartige Weise den Vorteil, die Thrombose an verschiedenen Flussratenpunkten zu stoppen, um die Zwischenstadien des Prozesses zu untersuchen, bevor er okklusiv wird. Jüngste Fortschritte in der Thromboseforschung haben dieses Modell verwendet, um die Aufmerksamkeit auf nicht-pharmakologische Methoden der Thrombolyse13 oder die nicht-invasive Verabreichung von antithrombotischen und/oder fibrinolytischen Wirkstoffen14,15 zu lenken. Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass, wenn Thrombozytenmembranen mit diesen Therapeutika beschichtet sind, die Medikamente bei thermischer Stimulation aktiviert werden können, um auf Gerinnsel16 abzuzielen. Die hier beschriebenen Techniken können für Studien wie die Validierung ihrer Ergebnisse auf der Ebene einzelner Blutplättchen nützlich sein. In diesem Manuskript beschreibt Protokoll 1 das grundlegende FeCl 3-vermittelte Gefäßverletzungsverfahren, während Protokoll 2 die Methode zum Sammeln und Fixieren der Gefäßverletzungsprobe für die weitere Analyse durch Elektronenmikroskopie beschreibt.
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Protocol
Alle hier besprochenen Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Kentucky geprüft und genehmigt.
HINWEIS: Chirurgische Instrumente sind in Abbildung 1 und der Materialtabelle aufgeführt. Es wurden C57BL/6J-Mäuse, 8-10 Wochen alt, männlich/weiblich oder relevante genetisch manipulierte (Knockout oder Knockin) Stämme verwendet.
1. FeCl 3-induzierte Verletzung der Halsschlagader
- Induktion der Mausanästhesie
- Wiegen Sie die Maus.
- Anästhesieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 0,2 g/kg Tribromethanollösung (i.p.). Stellen Sie sicher, dass die Anästhesielösung Raumtemperatur (RT) hat, bevor Sie sie injizieren. Diese Dosis reicht aus, um die Maus etwa 1 h lang zu beruhigen.
- Überprüfen Sie den Zehenreflex, indem Sie den Zeh 5 Minuten nach der Injektion einklemmen, um sicherzustellen, dass die Maus sediert ist. Wenn die Maus nicht sediert ist, zieht sie ihren Zeh weg. Warten Sie in diesem Fall 5 Minuten und überprüfen Sie es erneut.
- Wenn die Maus immer noch nicht vollständig sediert ist, verabreichen Sie 1/4 der Anfangsdosis und warten Sie 5 Minuten.
- Überwachen Sie während des gesamten Verfahrens regelmäßig die Anästhesieebene der Maus über eine Zehenklemme. Darüber hinaus könnten auch die Atemfrequenz und die Körpertemperatur überwacht werden, um eine optimale Anästhesie aufrechtzuerhalten.
- Immobilisieren Sie die Maus
- Legen Sie die Maus in Rückenlage auf das Heizkissen (37 °C) und fixieren Sie die Extremitäten mit Klebeband.
- Verwenden Sie einen chirurgischen Faden (0,1 mm), um vorsichtig an den oberen Vorderzähnen der Maus zu ziehen, um den Hals-/Halsbereich zu verlängern. Dies ist wichtig für eine bessere Visualisierung des Operationsbereichs und die Stabilität der Dopplersonde. Die Fadengröße ist nicht wichtig, da sie nur dazu dient, die Vorderzähne des Tieres zu ziehen, um den Hals zu verlängern.
- Einschnitt
- Besprühen Sie den Operationsbereich mit 70% Ethanol oder wischen Sie ihn mit einem Alkoholtuch ab.
- Tragen Sie mit einem Wattestäbchen eine kleine Menge Haarentfernungscreme auf den Operationsbereich auf. Warten Sie 1-2 Minuten und entfernen Sie dann die Creme mit einem feuchten Papiertuch oder Taschentuch.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig für einen sauberen Operationsbereich. - Machen Sie mit einer Schere und einer Pinzette (Abbildung 1B11,1B13) einen Mittellinienschnitt vom Unterkiefer bis zur suprasternalen Kerbe. Ziehen Sie die Haut zurück, um eine bessere Visualisierung des Bereichs zu erhalten (Abbildung 2A).
- Exposition der Halsschlagader
- Mit einer chirurgischen Pinzette und einer Mikropräparierungszange die überlagernde oberflächliche Faszie stumpf präparieren und entfernen, um die linke Halsschlagader freizulegen (Abbildung 1B12,1B13). Achten Sie darauf, in diesem Stadium keine Schere zu verwenden, um Verletzungen anderer Gefäße in diesem Bereich zu vermeiden.
- Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, das die Halsschlagader umgibt. Vermeiden Sie eine übermäßige Dissektion des umgebenden Gewebes, da sich in diesem Bereich der Vagusnerv und die Arteria vertebralis befinden.
- Trennen Sie die Halsschlagader vom umgebenden Gewebe, indem Sie sie mit einer chirurgischen und nahtbindenden Pinzette präparieren (Abbildung 1B12,1B15,2C). Achten Sie darauf, die Arterie nicht zu verlängern oder zu ziehen, um mechanische Verletzungen der Arterie oder des umgebenden Gefäßsystems zu vermeiden.
- Legen Sie ein Stück Plastik unter die Arterie, um den Ort der Verletzung zu markieren (Abbildung 2D). Verwenden Sie eine farbige Transparenzfolie, um das Sehen im Operationsfeld zu erleichtern.
- Platzierung der Strömungssonde
- Legen Sie die transsonische Doppler-Flusssonde vor der Operation für ca. 10 min in Kochsalzlösung (0,9% NaCl in dH2O). Führen Sie das andere Ende der Sonde in eine Befestigung im Durchflussmesser ein, um das Ablesen des Durchflusses zu erleichtern. Schließen Sie den Durchflussmesser an einen Computer an.
HINWEIS: Zwischen den Operationen sollte sich die transsonische Doppler-Durchflusssonde in Kochsalzlösung befinden. Achten Sie darauf, die Sonde während des gesamten Verfahrens feucht und sauber zu halten. - Platzieren Sie die transsonische Ultraschall-Doppler-Flusssonde um die Arterie stromaufwärts des Kunststoffs (Abbildung 2D). Achten Sie darauf, dass der Gefäßhalterbereich der Sonde nicht zu stark gestreckt ist (Abbildung 1C, roter Pfeil).
HINWEIS: Stützen Sie die Sonde bei Bedarf mit Mullbinden ab (Abbildung 1B1), um eine angemessene Höhe der Sonde zu erreichen und die optimale Leseposition zu erleichtern. - Wenn der Operationsbereich zu diesem Zeitpunkt trocken ist, fügen Sie ein paar Tropfen RT-Kochsalzlösung hinzu, um den Bereich feucht zu halten. Überwachen Sie den Messwert der Durchflusssonde. Der optimale Messwert variiert für jedes Tier und kann zwischen 0,6 und 1,2 ml / min liegen. Wenn es weniger oder nicht stabil ist, ändern Sie die Position der Durchflusssonde, um einen optimalen Messwert zu erhalten.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Hals der Maus nicht zu stark gestreckt ist und dass der Operationsbereich sauber ist.
- Legen Sie die transsonische Doppler-Flusssonde vor der Operation für ca. 10 min in Kochsalzlösung (0,9% NaCl in dH2O). Führen Sie das andere Ende der Sonde in eine Befestigung im Durchflussmesser ein, um das Ablesen des Durchflusses zu erleichtern. Schließen Sie den Durchflussmesser an einen Computer an.
- Aufzeichnen der Flow-Baseline
- Überwachen Sie nach dem Einsetzen der Sonde den Blutfluss 2 Minuten lang, um sicherzustellen, dass der Fluss gleichmäßig ist. Zeichnen Sie dann den Durchfluss für 2 Minuten auf (Abbildung 3B) als Basislinie. Eine detaillierte Beschreibung des Durchflussmessers finden Sie in Subramaniam et al.17.
- Um den Blutfluss aufzuzeichnen, starten Sie die WinDAQ-Software. Klicken Sie auf die Option Datei und dann auf Aufzeichnen. Erstellen Sie einen neuen Ordner und eine neue Datei und starten Sie die Aufnahme. Um die Aufnahme zu beenden, klicken Sie im Dateibereich auf Stopp .
HINWEIS: Die WinDAQ-Software ist kostenlos erhältlich über den Herausgeber: https://www.dataq.com/products/windaq/.
- Verletzung
- Stoppen Sie die Aufzeichnung des Flusses. Stellen Sie sicher, dass Sie die Sondenposition nicht ändern, damit die Messwerte nach der Verletzung konstant bleiben.
- Trocknen Sie den Bereich gründlich mit einem Wisch-/Papiertuch ab.
HINWEIS: Selbst ein kleines Volumen Restflüssigkeit kann die Konzentration der FeCl3-Lösung verändern, die zur Verursachung von Gefäßverletzungen verwendet wird. Dies führt zu variablen Ergebnissen und beeinträchtigt die Reproduzierbarkeit. Wenn der Bereich vollständig trocken ist, kann die Sonde den Durchfluss nicht messen. - Legen Sie in ein Kunststoff-Wiegeboot ein kreisförmiges Filterpapier (1 mm Durchmesser, geschnitten mit einem Ohrstanzer mit 1 mm Durchmesser). 1 μl 6%ige FeCl3 -Lösung (hergestellt indH 2O) auf das Filterpapier geben.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie FeCl3-Lösung hinzufügen, bevor Sie das Filterpapier verwenden. Ein zu frühes Einweichen des Papiers kann zur Verdunstung der FeCl3-Lösung führen und die Schwere der Verletzung verändern. - Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette das Filterpapier auf und legen Sie es auf die Arterie vor der Sonde, auf den Teil der Arterie, der durch den Kunststoff markiert ist (Abbildung 2D, E). Dieser Kunststoff fungiert als Markierung und Abstandshalter. Es markiert den verletzten Bereich und verhindert eine versehentliche Verdünnung des FeCl3 , indem es den Kontakt mit dem umgebenden feuchten Bereich vermeidet.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier gerade ist, nicht eingeklemmt oder anderweitig gefaltet ist. Ändern Sie nach dem Auflegen auf die Arterie nicht die Position des Filterpapiers. Dadurch ändert sich das Ausmaß der Verletzung. - Starten Sie nach dem Einlegen des Filterpapiers den Timer und zeichnen Sie den Blutfluss auf. Entfernen Sie nach 3 Minuten das Papier und fügen Sie Kochsalzlösung an der Verletzungsstelle hinzu, um das FeCl3 zu entfernen und den Verletzungsprozess zu stoppen. Es macht auch den Bereich feucht. In diesem Stadium sollte der Blutfluss auf das Ausgangsniveau zurückkehren, wie es vor der Verletzung aufgezeichnet wurde.
- Überwachen und zeichnen Sie den Durchfluss auf, bis er auf 10 % der ursprünglichen Aufnahme reduziert wird oder Null erreicht. Es kommt zu einer stetigen Abnahme, sobald sich der Thrombus an der Verletzungsstelle zu bilden beginnt (Abbildung 3C). Beachten Sie während dieser Zeit signifikante Schwankungen des Durchflusses.
- Um die Stabilität des Thrombus zu untersuchen, notieren Sie den schnellen Anstieg des Blutflusses nach jeder signifikanten und konsistenten Abnahme. Diese Ereignisse werden als Embolisation aufgrund einer instabilen Thrombose klassifiziert (Abbildung 4D). Nach der gleichmäßigen Abnahme des Flusses kann der Bediener die Verletzung an der Arterie am Ende des Experiments sehen (Abbildung 2F, blauer Pfeil/gepunktetes Oval).
- Die Gefäßverschlusszeit ist definiert als die vollständige Unterbrechung des Blutflusses für mindestens 1 Minute. Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem sich ein okklusiver Thrombus bildet, wie der Nullwert oder die signifikante Abnahme des Flusses zeigen.
- Beenden Sie das Experiment nach 30 Minuten. Wenn sich der Thrombus nicht innerhalb von 30 Minuten nach der Überwachung bildet, zeichnen Sie den Fluss auf, stoppen Sie die Aufzeichnung und entfernen Sie die Sonde.
- Reinigen Sie die Sonde mit 70% Ethanol und einer Bürste, um restliches Gewebe/Haare oder Ablagerungen zu entfernen. Trocknen Sie die Sonde vollständig ab, bevor Sie sie in die Aufbewahrungsbox legen. Trocknen Sie die Sonde vollständig ab, bevor Sie sie zur Langzeitlagerung in die Aufbewahrungsbox legen.
- Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation. Legen Sie den Kadaver in den Schlachtkörperentsorgungsbeutel, der mit dem Namen des Labors und dem Datum beschriftet ist.
2. Entnahme und Aufbereitung von Proben für serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie-Studien (SBF-REM) nach FeCl 3-induzierter Schädigung
HINWEIS: Das vorgestellte EM-Protokoll ist für die Probenvorbereitung für SBF-REM geeignet. Diese bildgebende Technik bietet eine beispiellose Möglichkeit, die dreidimensionale Struktur von Blutplättchen in einem Gerinnsel zu untersuchen. Mit dieser Technik wird die Probe als eine Reihe von sequentiellen Block-REM-Bildern visualisiert, die im Laufe der Probe erzeugt werden. Die wichtigsten Punkte für diese Vorbereitung sind: 1) Die Probe muss vor dem Einbetten mit Schwermetallen gefärbt werden; und 2) die in Kunststoff eingebettete Probe muss für die Montage im REM geeignet zugeschnitten werden (siehe Abbildung 6 für eine Darstellung der beschnittenen Proben). Eine Färbung nach der Einbettung ist innerhalb des REMS nicht möglich. Bei der Entnahme einer Probe aus einer FeCl 3-induzierten Gefäßverletzung für die EM-Analyse müssen während der Operation die folgenden Änderungen vorgenommen werden. Die Modifikationen im vorgestellten FeCl 3-Operationsprotokoll sind auch auf jede Form der Elektronenmikroskopie anwendbar. Die Anästhesiebedingungen und die Schritte zum Einschneiden und Freilegen der Halsschlagader sind die gleichen wie in Protokoll 1.
- Markieren Sie nach dem Freilegen der Halsschlagader die Verletzungsstelle, indem Sie den Bereich zwischen zwei chirurgischen Fäden (Größe: 0,1 mm) locker umschließen (Abbildung 5A, B).
- Platzieren Sie die Sonde unter der Arterie, distal vom unteren Gewinde (Abbildung 5C).
- Führen Sie das Plastikstück unter die Arterie zwischen den beiden Fäden ein, um die Stelle für eine FeCl3-Verletzung zu markieren (Abbildung 5C).
- Führen Sie Durchflussmessungen durch, bevor Sie eine Verletzung durchführen, um den Basalfluss zu notieren. Diese Messungen werden verwendet, um zu entscheiden, in welchem Stadium die Probe entnommen wird.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Fixiermittel (3% Paraformaldehyd/PFA + 0,1% Glutaraldehyd, beide hergestellt in 1x PBS) fertig und bei RT ist. Alternativ kann auch eine Fixierung mit 2,5% Glutaraldehyd in einem salzhaltigen Hintergrund verwendet werden.
ACHTUNG: Sowohl Paraformaldehyd als auch Glutaraldehyd sind hochgiftig und reizend. Beim Umgang mit ihnen sollten Handschuhe, ein Augenschutz und Masken verwendet werden, um sich vor Exposition zu schützen. Alle Fixierlösungen sind giftig und die Fixierschritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden. - Führen Sie die Verletzung durch, indem Sie FeCl 3-getränktes Filterpapier für 3 Minuten auf die Arterie legen (8% FeCl3 wird verwendet) (diese Zeit kann ebenfalls variieren). Entfernen Sie nach 3 Minuten das Filterpapier und fügen Sie Kochsalzlösung an der Verletzungsstelle hinzu, um überschüssiges FeCl3 zu entfernen. Dieser Schritt ist notwendig, um das variable Ausmaß der Verletzung zu verhindern und die Durchflusszählung durch die Sonde zu erleichtern (Abbildung 5D).
- Überwachen Sie den Durchflusswert. Wenn der Durchfluss unter 50 % des Ausgangswerts fällt, entfernen Sie die Sonde. Trocknen Sie den Bereich schnell ab und fügen Sie das Fixiermittel in den Bereich ein, um den Verletzungsbereich äußerlich zu fixieren.
- Halten Sie die Arterie sofort mit einer Pinzette in der Nähe des Verletzungsbereichs und schneiden Sie stromabwärts des Unterfadens und stromaufwärts des Oberfadens. Bitten Sie gegebenenfalls eine andere Person, Ihnen beim Abschneiden eines Endes zu helfen. Legen Sie das Gewebe in der gleichen Ausrichtung auf die Kunststoff-Gewebekulturschale, in der es gesammelt wurde, und fügen Sie ein paar Tropfen des Fixiermittels hinzu.
HINWEIS: Das Schneiden der Arterie verursacht sofortige ausgedehnte Blutungen, also stellen Sie sicher, dass Sie die Arterie halten, bevor Sie sie zum ersten Mal durchtrennen. In diesem Szenario wird die Maus ausgeblutet. Die Maus wird durch Ausbluten und Zervixluxation eingeschläfert. - Reinigen Sie mit einem Skalpell das zusätzliche Gewebe um die Arterie. Achten Sie darauf, die Ausrichtung des Blutflusses aufzuzeichnen. Um dies zu markieren, schneiden Sie ein Ende horizontal und das andere sich verjüngend/schräg (Abbildung 5E).
- Bewahren Sie die Probe 1 h bei RT in Fixiermittel (3% PFA und 0,1% Glutaraldehyd) auf. Lagern Sie die Probe dann in 1 % PFA bei 4 °C, bis sie auf nassem Eis zur EM-Analyse an das Probenverarbeitungslabor geschickt wird.
HINWEIS: Die Proben sollten nicht eingefroren werden. Die Herausforderungen bei dieser Methode der Probenentnahme sind:- Der anfängliche Messwert ist möglicherweise nicht optimal oder kann nach der Verletzung schwanken. Dies kann sich auf das Ausmaß der Verletzung auswirken, die für die EM-Analyse ausgewählt wird. Um dieses Problem zu beheben, stellen Sie sicher, dass Sie den Basiswert einige Minuten lang aufzeichnen, nachdem Sie verschiedene Positionen der Sonde ausprobiert haben, um zu entscheiden, welche Position optimal ist.
- Die Zeit, um die Verletzung durch Hinzufügen eines externen Fixiermittels und eines tatsächlichen Schneidens des arteriellen Abschnitts für die Analyse zu stoppen, kann die Variabilität des Ausmaßes der Thrombose erhöhen. Seien Sie bei der Probenentnahme schnell, nachdem Sie sie extern befestigt haben.
- Erhalten Sie die Proben zur Verarbeitung für die EM-Analyse in 1% PFA auf nassem Eis. Spülen Sie die Proben 3 Minuten lang auf Eis mit 0,1 M Cacodylatpuffer, um die weitere Verarbeitung einzuleiten.
- Fixieren Sie die Proben für 1 h auf Eis in 0,1 M Cacodylatpuffer + 2,5% Glutaraldehyd + 2 mM CaCl2.
- Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Proben mit kaltem 0,1 M Natriumcacodylatpuffer mit 2 mM CaCl2 (5 x 3 min) (Abbildung 6A).
- Die Proben werden mit Osmiumlösung (3% Kaliumferrocyanid [K 4 C 6 N6Fe] + 0,3 M Cacodylatpuffer + 4 mM CaCl 2 gemischt mit einem gleichen Volumen von4% wässrigem Osmiumtetroxid [OsO4; in ddH2 O]) für 1 h auf Eis fixiert.
- Während die Proben fixiert werden, wird eine frische 1%ige Trichloracetaldehydhydrat (TCH)-Lösung in ddH2O hergestellt. Inkubieren Sie die Lösung bei 60 °C für 1 Stunde unter vorsichtigem Mischen.
- Waschen Sie die Proben nach dem Fixieren mit ddH2O bei RT für 5 x 3 min.
- Inkubieren Sie die Proben in filtrierter 1%iger TCH-Lösung (hergestellt in ddH2O) für 20 Minuten bei RT.
- Waschen Sie die Proben mit ddH2O bei RT (5 x 3 min).
- Fixieren Sie die Proben in 2% Osmiumtetroxid in ddH2O für 30 min bei RT.
- Waschen Sie die Proben mit ddH2O bei RT jeweils 5 x 3 min.
- Die Proben werden in 1 % Uranylacetat (wässrig) eingelegt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
- Waschen Sie die Proben mit ddH2O bei RT für jeweils 5 x 3 min und verarbeiten Sie sie mit der Bleiaspartatfärbung en bloc Walton.
- En bloc Waltons Blei-Aspartat-Färbung3:
- 30 mM L-Asparaginsäurelösung in ddH2O herstellen.
HINWEIS: Die Asparaginsäure löst sich schneller auf, wenn der pH-Wert auf 3,8 erhöht wird. Diese Stammlösung ist im Kühlschrank 1-2 Monate haltbar. - Stellen Sie 20 mM Bleinitratlösung in 10 ml Asparaginsäurevorrat her und stellen Sie den pH-Wert mit 1 N KOH auf 5,5 ein.
- Die Proben werden 30 Minuten lang bei 60 °C in Bleiaspartatlösung gegeben, nachdem sie fünf Mal mit ddH2O bei RT jeweils 3 Minuten lang gewaschen wurden.
- 30 mM L-Asparaginsäurelösung in ddH2O herstellen.
- Dehydrieren Sie die Proben mit einer abgestuften Ethanolreihe. Verwenden Sie die chemische Dehydratisierung nach dem Valdivia-Protokoll18.
- Waschen Sie die Proben in jeder der folgenden Lösungen, um die Probe schrittweise zu dehydrieren (Abbildung 6B):
25% Ethylalkohol für 3 min
50% Ethylalkohol für 3 min
75% Ethylalkohol für 3 min
95% Ethylalkohol für 3 min
100% Ethylalkohol für 10 Minuten und wiederholen Sie den Schritt zweimal (insgesamt drei Wäschen).
- Waschen Sie die Proben in jeder der folgenden Lösungen, um die Probe schrittweise zu dehydrieren (Abbildung 6B):
- Waschen Sie die Proben 10 Minuten lang in 100% Propylenoxid (PO) und wiederholen Sie den Schritt zweimal (insgesamt drei Wäschen).
- Inkubation in 50%/50% PO/Harz mit DMP 30 Aktivator über Nacht bei RT und Einbettung in 100% Araldite 502/embed 812/DDSA mit DMP30 Aktivator für 48 h.
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Representative Results
Die Daten werden im Allgemeinen als Zeit bis zum Verschluss oder als Zeit dargestellt, die benötigt wird, um einen vollständig okklusiven Thrombus zu bilden. Diese Daten können als Kaplan-Meier-Überlebenskurve (Abbildung 4A)19, als Punktdiagramm mit Balken, die den terminalen Blutfluss zum Zeitpunkt der Beendigung des Blutflusses oder der Beendigung eines Experiments (Abbildung 4B) zeigen, oder als Liniendiagramm (Abbildung 4C) dargestellt werden. Die Thrombusstabilität kann mit dieser Technik untersucht werden. In den meisten Fällen bildet sich der Thrombus nach einer FeCl3-Verletzung allmählich, und wenn er wächst, nimmt der Blutfluss allmählich ab und erreicht bei vollständigem Verschluss des Gefäßes Null. In einigen Fällen steigt der Blutfluss nach einer allmählichen Abnahme für einige Minuten plötzlich an. Dies wird als partielles Ablösen des wachsenden Thrombus interpretiert und kann als Embolisationsereignis betrachtet werden (Abbildung 4D). Auch die Morphologie des okklusiven Thrombus (Abbildung 7A) kann mit dieser Methode untersucht werden.
Tabelle 1: Mögliche technische Herausforderungen im FeCl 3-induzierten Thrombosemodell und Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Abbildung 1: Chirurgische Instrumente, die zur Durchführung einer FeCl 3-induzierten Halsschlagaderthrombose bei Mäusen benötigt werden. (A) 1: LEICA S8AP0 Mikroskop und Stativ. 2: Beheiztes Kleintierkissen mit Aluminiumfolie überzogen. (B) 1: Mullschwämme. 2: 26 G x 3/8 Nadel. 3: 1 ml Spritze. 4: Sterile Applikatoren mit Baumwollspitze. 5: Schwarze geflochtene Seidennaht. 6: Chirurgische Klinge. 7: Messergriff aus rostfreiem Stahl. 8: Kommerzielle Haarentfernungscreme. 9: Ohrenschlag. 10: Schere sezieren. 11: Feine Schere. 12: Chirurgische Pinzette. 13: Mikropräparierzange. 14: Augen-Dressing-Pinzette. 15: Nahtbindezange. (C) Transsonische Strömungssonde mit dem flexiblen Bereich (roter Pfeil) und einer Kerbe, die ein Gefäß hält (schwarzer Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Chirurgische Schritte zur Vorbereitung der Halsschlagader auf Verletzungen und zur Messung des Gefäßverschlusses. Machen Sie mit einer Schere und einer chirurgischen Pinzette einen Mittellinienabschnitt und ziehen Sie das Gewebe (A) vorsichtig weg, um die darunter liegende Halsschlagader freizulegen (B). Der schwarze Pfeil zeigt die Richtung des Blutflusses (B). Reinigen Sie das umgebende Gewebe, das die Halsschlagader (C) umgibt, und legen Sie ein Stück Plastikpapier (gelber Kunststoff dargestellt durch einen schwarzen Pfeil) und die Sonde (D) ein. Verletzen Sie das Gefäß, indem Sie mit FeCl3 getränktes Filterpapier (dargestellt durch einen roten Pfeil) auf die Arterie (E) legen. Entfernen Sie das Papier und überwachen Sie die Verletzung. Am Ende ist die Verletzung als gelb-weißer Streifen sichtbar, der durch die blaue Pfeilspitze (F) angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Blutflussanzeige mit dem Durchflussmesser. Der Blutfluss in der Halsschlagader wird mit einem Durchflussmesser (A) gemessen. Der Flow wird über eine Record-Funktion im Datei-Tab (B) aufgezeichnet. Der Ausgangsfluss sollte vor der Durchführung der Verletzung relativ konstant sein (ca. 0,8 ml/min, dargestellt durch einen schwarzen Pfeil) (B). Nach der Verletzung nimmt der Blutfluss gleichmäßig ab (ca. 50% Abnahme gegenüber dem Ausgangswert, ca. 0,4 ml/min), dargestellt durch einen schwarzen Pfeil (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Datenpräsentationen aus dem FeCl 3-induzierten Carotis-Verletzungsmodell. Es werden verschiedene Methoden gezeigt, die zur Darstellung von Daten aus FeCl 3-induzierten Gefäßverletzungen zur Verfügung stehen. Kaplan-Meier-Überlebenskurven zeigen die Zeit bis zur Okklusion für jede Maus. Für die statistische Analyse wird ein Log-Rank-Test durchgeführt. p ≤ 0,001 (A). Der Blutfluss am Ende des Experiments konnte auch in einem Balkendiagramm (B) dargestellt werden. Für die in B dargestellten Daten wurde ein ungepaarter t-Test *** p ≤ 0,001 durchgeführt. Der Fehlerbalken stellt den Mittelwert ± SD dar. Die Doppler-Flussdaten, die nach der Verletzung von einem einzelnen Tier gesammelt wurden, konnten in einem Liniendiagramm (C) dargestellt werden. Beispiel für ein potentielles Embolisationsereignis durch den plötzlichen Anstieg des Blutflusses nach einer anhaltenden allmählichen Abnahme des Flusses in einer einzelnen Maus zu verschiedenen Zeitpunkten (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Sammlung von FeCl 3-induzierten Verletzungsgerinnseln für elektronenmikroskopische Untersuchungen. Nachdem Sie eine Arterie (A) freigelegt haben, markieren Sie die Verletzungsstelle, indem Sie die Fäden (B) locker binden, und legen Sie das Plastikpapier unter die Arterie und die Sonde stromabwärts (C). Führen Sie die Verletzung durch und überwachen Sie den Schaden (D). Sammeln Sie das Gewebe wie im Text beschrieben, und reinigen und schneiden Sie die Probe auf der einen Seite gerade und auf der anderen Seite schräg, um die Richtung des Blutflusses anzuzeigen (der schwarze Pfeil zeigt die Richtung des Blutflusses und der rote Umriss zeigt die verletzte Region an) (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Nachfixierung von Proben für die Elektronenmikroskopie. Die Proben werden zwischen den Verarbeitungsschritten (A) in Mikrozentrifugenröhrchen gewaschen und mit einer erhöhten Ethanolkonzentration (B) seriell entwässert. Nach der Verarbeitung werden sie in Harz (C) eingebettet, und die Blöcke werden mit der Richtung des Blutflusses (D) markiert und dann zur Bildgebung in Scheiben geschnitten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahmen der proximalen und distalen Regionen eines vollständig okklusiven Thrombus nach FeCl3-vermittelter Karotisverletzung. (A) Ein vollständiger Querschnitt einer verschlossenen Arterie, proximal zur Verletzungsstelle, mit Einsätzen darunter, die Strukturen bei höherer Vergrößerung zeigen (a: 2x und a': 4x). Der verletzte Bereich ist mit einem Pfeil in A gekennzeichnet. Maßstabsleiste: 100 μm. (B) Ein vollständiger Querschnitt einer verschlossenen Arterie, distal zur Verletzungsstelle, mit Einsätzen darunter, die Strukturen bei höherer Vergrößerung zeigen (b: 2x und b': 4x). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Tabelle 1: Ein kurzer Überblick über die Variationen in Tiermodellen, die FeCl 3-Verletzungsstelle, die FeCl3-Konzentration, die Verletzungsmethode und die Thrombosezeiten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die topische Anwendung von FeCl3 auf das Gefäßsystem zur Induktion von Thrombosen ist eine weit verbreitete Technik und hat maßgeblich dazu beigetragen, Rollen für verschiedene Thrombozytenrezeptoren, Ligandensignalwege und ihre Inhibitorenzu etablieren 20,21,22,23. Der Mechanismus, durch den FeCl3 eine Thrombose verursacht, ist vielfältig; Früher wurde die endotheliale Denudation als Ursache für Thrombosen angesehen, aber in den letzten Jahren haben mehrere Berichte die Rolle von roten Blutkörperchen und Plasmaproteinen in diesem Prozess vorgeschlagen24,25,26,27.
Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind: die Platzierung der Dopplersonde, um einen optimalen Durchfluss zu erhalten, die Platzierung des Filterpapiers und die sofortige Beendigung der Verletzung, um die Probe zu entnehmen und sofort zu fixieren. Die Folgen von Pannen in diesen Schritten und wie sie behoben werden können, sind in Tabelle 1 beschrieben. Obwohl diese Technik einfach und empfindlich ist, kann sie je nach Tiermodell, Tierhintergrund, Ort der Gefäßverletzung, Konzentration von FeCl 3, FeCl 3-Anwendungsmethode, Dauer der Anwendung, Alter und Geschlecht des Tieres und Art der verwendeten Anästhesie schwierig anzuwenden sein. Diese Unterschiede können für die relativ große Bandbreite der Thrombosezeiten bei C57BL/6J verantwortlich sein, die in der Literatur berichtet wird (Ergänzende Tabelle 1)27,28,29,30,31,32. Dieses Protokoll schlägt vor, 8-10 Wochen alte Mäuse für das Experiment zu verwenden, da die Gefäßgröße leichter zu visualisieren und zu chirurgisch ist. Einige Gruppen haben Mäuse im Alter von 6 Wochen verwendet33. Es ist unbedingt erforderlich, die Mäuse altersgerecht zu gestalten, um einen konsistenten und reproduzierbaren Vergleich zwischen verschiedenen Tiergruppen zu ermöglichen. Die beschriebene Anästhesie, Tribromethanol, wird bevorzugt, weil sie leicht verfügbar ist, einfacher zu verabreichen ist, eine Anästhesieebene für die erforderliche Dauer beibehält und die erforderliche Dosierung reproduzierbar ist. Viele andere Anästhesieoptionen sind verfügbar, einschließlich Isofluran und verschiedene Kombinationen von Tribromethanol mit tertiärem Amylalkohol mit Xylazin und/oder Acepromazin. Es ist unbedingt erforderlich, eine optimale Dosis zu verwenden, um eine Sedierung zu erreichen, ohne die Herzfrequenz oder den Blutdruck des Tieres negativ zu beeinflussen. Die Verwendung der gleichen Anästhesiemethode während des gesamten Experiments verhindert mögliche Compounding-Effekte auf die Thrombosezeit.
Dieses Manuskript stellt ein detailliertes Verfahren vor, um Datenvariationen zu minimieren und die Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Eine Tabelle wird zur Verfügung gestellt, um einige Probleme zu beheben, die während dieser Operation auftreten können (Tabelle 1). Darüber hinaus schlägt dieses Manuskript eine Methode vor, um Proben am Ende der Verletzung zu sammeln, um die Struktur und Morphologie eines okklusiven Thrombus zu untersuchen (Abbildung 7). Die Auflösung der EM bietet eine bessere Visualisierung als bishermöglich 25 von Blutplättchen in einem wachsenden Thombus und wie sie mit anderen Blutplättchen und dem Endothel sowohl proximal als auch distal der Gefäßverletzung interagieren. Es kann auch verwendet werden, um verschiedene Aktivierungsstadien von Blutplättchen an der Verletzungsstelle zu untersuchen.
Ein weiterer wichtiger Vorteil dieser Technik besteht darin, dass der Bediener anhand von Baseline-Messwerten entscheiden kann, in welchem Stadium die Thrombusprobe entnommen wird. Es ist zu beachten, dass es sich hierbei um ungefähre Zeitangaben handelt, die nicht das genaue Ausmaß der Verletzung/Thrombose angeben. Die basalen Messwerte hängen von der optimalen Platzierung der Sonde ab, und wenn sie nicht richtig platziert sind, können die Messwerte nur einen Teilfluss aufzeichnen. Dies führt zu einer fehlerhaften Interpretation der Beendigungszeit und damit der Morphologie der entnommenen Probe. Eine sofortige Beendigung des Verletzungsprozesses und eine sofortige Fixierung der Proben sind erforderlich, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Dieses Protokoll enthält die minimal erforderlichen Einstellungen für die Beurteilung der Okklusionsthrombose. Mit den Fortschritten in der Mikroskopie haben mehrere Gruppen diese Technik verwendet, um die Thrombozyten/Endothelzellen und/oder das Thrombozytenreeasat, wie PF4 und P-Selektin und Fibrin, fluoreszierend zu markieren, um spezifische Aspekte der In-vivo-Thrombose zu visualisieren und ihre Kinetik zu bestimmen34,35. Wie beschrieben, kann die Methode hier über Embolisationsereignisse berichten, die auf eine Thrombusinstabilität hindeuten (Abbildung 4D).
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie.
ORCID-Profile: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitgliedern des Whiteheart Laboratory für die sorgfältige Durchsicht dieses Manuskripts. Die Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH, des NHLBI (HL56652, HL138179 und HL150818) sowie durch einen Verdienstpreis des Department of Veterans Affairs an S.W.W., R01 HL 155519 an BS und einen Zuschuss des NIBIB intramuralen Programms an R.D.L. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
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