La malaria se transmite a través de la inoculación de la etapa de esporozoíto de Plasmodium por mosquitos infectados. El Plasmodium transgénico nos ha permitido comprender mejor la biología de la malaria y ha contribuido directamente a los esfuerzos de desarrollo de vacunas contra la malaria. En este trabajo se describe una metodología simplificada para generar esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei .
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Artículo de método
Generación de esporozoítos de Plasmodium berghei modificados genéticamente
En este artículo
Resumen
Resumen
La malaria es una enfermedad mortal causada por el parásito Plasmodium y se transmite a través de la picadura de mosquitos Anopheles hembra. La etapa de esporozoíto de Plasmodium depositada por los mosquitos en la piel de los huéspedes vertebrados pasa por una fase de desarrollo obligatorio en el hígado antes de iniciar la malaria clínica. Sabemos poco sobre la biología del desarrollo de Plasmodium en el hígado; El acceso a la etapa de esporozoíto y la capacidad de modificar genéticamente dichos esporozoítos son herramientas críticas para estudiar la naturaleza de la infección por Plasmodium y la respuesta inmunitaria resultante en el hígado. Aquí, presentamos un protocolo integral para la generación de esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei . Modificamos genéticamente el estadio sanguíneo de P. berghei y usamos esta forma para infectar a los mosquitos Anopheles cuando se alimentan de sangre. Después de que los parásitos transgénicos experimentan el desarrollo en los mosquitos, aislamos la etapa de esporozoíto del parásito de las glándulas salivales del mosquito para la experimentación in vivo e in vitro . Demostramos la validez del protocolo mediante la generación de esporozoítos de una nueva cepa de P. berghei que expresa la subunidad 11 de la proteína verde fluorescente (GFP) (GFP11), y mostramos cómo podría usarse para investigar la biología de la malaria en etapa hepática.
Introducción
A pesar de los avances en el desarrollo de medicamentos y la investigación sobre la prevención y el tratamiento del paludismo, la carga mundial de morbilidad del paludismo sigue siendo alta. Más de medio millón de personas mueren de malaria cada año, y los niveles más altos de mortalidad se observan entre los niños que viven en regiones donde la malaria es endémica, como el África subsahariana1. La malaria es causada por el parásito Plasmodium, que se transmite a los humanos a través de la picadura de mosquitos Anopheles hembra que portan el parásito en sus glándulas salivales. La etapa infecciosa de ....
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Protocolo
Todas las investigaciones con animales vertebrados en nuestro laboratorio se realizaron de acuerdo con las pautas y protocolos de uso de animales de la Universidad de Georgia.
1. Generación de ratones infectados por P. berghei
- Iniciar la infección en la etapa sanguínea en ratones C57BL/6 (B6) machos o hembras de 6 a 8 semanas de edad utilizando parásitos de P. berghei de tipo salvaje. Para ello, se transfiere sangre criopreservada infectada con P. berghei (2 x 105 glóbulos rojos infectados), reconstituida en 400 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), a uno o dos ra....
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Resultados
Determinar la frecuencia y el desarrollo de los esquizontes es fundamental para asegurar que suficientes parásitos viables estén en la etapa óptima para la transfección. Los esquizontes inmaduros se pueden diferenciar de los esquizontes completamente maduros por la presencia de menos merozoítos que no llenan todo el espacio intracelular de los glóbulos rojos (Figura 1B). Es importante tener en cuenta que al hacer frotis de sangre a partir de sangre cultivada, los glóbulos rojos infectados pu.......
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Discusión
Hemos utilizado el protocolo anterior en nuestro laboratorio para crear varias líneas de parásitos transgénicos de P. berghei. Aunque optimizado para P. berghei, también hemos utilizado con éxito este protocolo para generar esporozoítos transgénicos de P. yoelii. Después de inyectar los esquizontes transfectados en ratones, los parásitos son detectables típicamente a más tardar 3 d.p.i. en todos los grupos, incluido el control sin plásmido. La selección se inicia solo una vez que se ha detectad.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud AI168307 a SPK. Agradecemos al núcleo de citometría de flujo CTEGD de la UGA y al núcleo de microscopía CTEGD de la UGA. También reconocemos las contribuciones de Ash Pathak, Anne Elliot y el personal de UGA Sporocore en la optimización del protocolo. Queremos agradecer al Dr. Daichi Kamiyama por sus valiosas ideas, discusiones y los plásmidos padres que contienen GFP11 y GFP 1-10. También nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Kurup por su constante apoyo, paciencia y aliento.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 30 G x 1/2" Aguja de jeringa | Exel international | 26437 | |
| Solución de Alsever | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoetanol) | TCI America | T1420 | |
| Tubos de extracción de sangre | BD bioscience | 365967 | para la colección de sueros |
| Hematocitómetro desechable C-Chip | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Placa de cultivo celular | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrífuga 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| centrífuga 5910R | Eppendorf | 5910R | Para centrifugación en gradiente |
| Delta Vision II - Sistema de microscopio invertido | Olympus | IX-71 | |
| Dimetilsulfóxido Sigma | D5879-500ml | ||
| Suero fetal bovino | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plásmido | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generado a partir del plásmido PL0017 |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 | células Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generado a partir de células Hepa 1-6 (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Suero | utilizado para medios de disección de mosquitos | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1,5 M y 0,15 M para solución de percoll |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Programa U-033 utilizado para la electroporación de glóbulos rojos | |
| Pipeta Pasteur | VWR | 14673-043 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Medio madre con gradiente de densidad) | Cytivia | 17-0891-02 | Detalles en el protocolo |
| PL0017 Plásmido | BEI Recursos | MRA-786 | |
| Pirimetamina (para administración oral) | Sigma | 46706 | Detalles de la preparación: Añadir 17,5 mg de pirimetamina a 2,5 mL de DMSO. Vórtice, si es necesario disolverse por completo; Ajuste el pH de 225 mL de dH2O a 4 usando HCL. Agregue pirimetamina en DMSO al agua y lleve a 250 mL. Añadir 10 g de azúcar para fomentar el consumo regular de agua drogada. La pirimetamina es sensible a la luz. Use una botella oscura o una botella cubierta con papel de aluminio cuando trate a los ratones. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx software de microscopía | Applied Precision | v6.1.3 |
Referencias
- WHO. Geneva. World Health Organization. , 1(2020).
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
- Crompton, P. D., et al.
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Reimpresiones y permisos
