Artículo de método

Métodos para estudiar la óptica, la fisiología y la bioquímica del ojo compuesto de mosca

24 de marzo de 2023

 , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

En este artículo

Resumen

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ARTÍCULOS DISCUTIDOS:

Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling M. F., Stavenga, D. G. Cartografía automatizada del espacio visual de los ojos compuestos de la mosca doméstica. Revista de Experimentos Visualizados. (181), E63643 (2022).

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP. Revista de Experimentos Visualizados. (179), E63375 (2022).

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmentos en los fotorreceptores de Drosophila. Revista de Experimentos Visualizados. (184), E63514 (2022).

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purificación de los canales de potencial del receptor transitorio endógeno de Drosophila. Revista de Experimentos Visualizados. (178), E63260 (2021).

Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Análisis de la señalización lipídica en fotorreceptores de Drosophila mediante espectrometría de masas. Revista de Experimentos Visualizados. (181), E63516 (2022).

Editorial

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El ojo compuesto de mosca es un importante sistema de modelo biológico para dilucidar mecanismos biológicos fundamentales. Algunos de los mecanismos que se han estudiado con este sistema son los siguientes: visión ocular compuesta con un campo de visión casi panorámico1; la biofísica, el ensamblaje de proteínas y la biogénesis del receptor acoplado a proteína G sensible a la luz 2,3,4; el sistema de transducción de señales mediado por fosfolipasa Cβ 5,6; activación y modulación del canal TRP en tejido nativo 5,6; el ensamblaje y la función del complejo de señalización multiproteica 7,8; la estructura molecular, la bioquímica y la función del reciclaje de inositol-fosfolípidos 9,10; y la translocación subcelular mediada por señales de proteínas de señalización11,12. La estructura anatómica y la óptica únicas del ojo compuesto de mosca se han estudiado ampliamente, revelando mecanismos fundamentales de desarrollo y capacidades visuales.

Esta colección de métodos comprende el trabajo de científicos líderes que han desarrollado y refinado métodos para estudiar algunos de los mecanismos anteriores en el ojo compuesto de la mosca. Muñoz et al. describen un método para analizar cuantitativamente la disposición óptica del ojo de la mosca que proporciona una representación precisa del ojo compuesto y su organización espacial13. Este método es esencial para estudiar en detalle el procesamiento neuronal de la información visual. Es importante destacar que ha habido muchos intentos de producir ojos artificiales bioinspirados, y estos se han basado en estudios cuantitativos de ojos compuestos existentes. Wagner et al. utilizan la pseudopupila profunda, un fenómeno óptico único del ojo compuesto, y la microscopía de alta amplificación con la neutralización óptica de la córnea para localizar proteínas marcadas con eGFP dentro de las células fotorreceptoras de Drosophila 14. Este método permite la detección de defectos estructurales en los rabdomeros debido a la degeneración de los fotorreceptores y la localización celular y el tráfico de importantes proteínas de señalización. Gutorov et al. utilizan mediciones electrofisiológicas de todo el ojo o de células fotorreceptoras individuales para medir el nivel de estados fotopigmentados in vivo y sus modulaciones por mutaciones específicas en proteínas de señalización15. Este método explota los desplazamientos de carga dentro de un estado de pigmento visual (R) inducido por la absorción de fotones, lo que da como resultado la formación de un segundo estado de pigmento que es estable en la oscuridad (M). Un método adicional utiliza la despolarización prolongada después del apagado de la luz (PDA) que explota las propiedades biestables oscuras del pigmento visual y las diferencias en los espectros de absorción de los estados R y M de la mosca. Dado que el CAP depende de la conversión de una gran cantidad de fotopigmento, incluso el más mínimo defecto en la biogénesis del fotopigmento puede conducir a un CAP anormal fácilmente detectable. De hecho, los mutantes de Drosophila que muestran CAP anormal han llevado al descubrimiento de nuevas proteínas de señalización. Un ejemplo destacado de esto es el descubrimiento del nuevo complejo proteico compuesto por la inactivación de la proteína del andamio pero sin la D pospotencial (INAD), la proteína quinasa C específica del ojo (eyePKC), la fosfolipasa Cβ (PLCβ) y el canal de potencial receptor transitorio (TRP). Por primera vez, Liu et al. presentan una técnica para purificar el canal16 de Drosophila TRP. Este método de purificación de afinidad modificado utiliza una estrategia de competencia que se basa en el mecanismo de ensamblaje del complejo de señalización INAD. Esta estrategia permite la purificación del canal TRP endógeno. De acuerdo con este método, primero un fragmento de PLCβ unido a perlas de Ni se marca con histidina y se usa para extraer el complejo de proteínas INAD endógeno obtenido de homogeneizados de cabeza de Drosophila. A continuación, los fragmentos de TRP que están marcados con glutatión S-transferasa (GST) excesivamente purificada se agregan a las perlas de Ni para competir con el canal TRP endógeno unido al INAD. Finalmente, se utiliza la cromatografía de exclusión por tamaño para separar los fragmentos del canal TRP marcados en el sobrenadante del canal TRP endógeno. Panda et al. informan de una técnica sensible para identificar y cuantificar varias clases de lípidos en células fotorreceptoras de Drosophila mediante espectrometría de masas17. La activación de PLCβ es crucial para la fototransducción, ya que conduce a la hidrólisis del fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato (PI(4,5)P2) en la membrana superficial. Esta reacción finalmente conduce a la activación del canal TRP. Además, la actividad de PLCβ da como resultado la generación de muchas especies de lípidos. Se ha propuesto que varias de estas especies lipídicas pueden participar en la activación de TRP y desempeñar un papel clave en la organización funcional de los fotorreceptores para optimizar la transducción sensorial. En el estudio de Panda et al.17, estos hallazgos se evaluaron aislando mutantes de Drosophila que albergan enzimas defectuosas que controlan los niveles de lípidos específicos.

El ojo compuesto de mosca es un sistema experimental útil para dilucidar mecanismos fundamentales en biología. La poderosa metodología genética desarrollada en Drosophila se puede utilizar para analizar y descubrir las proteínas de señalización involucradas en la fototransducción de moscas. Esta colección de métodos describe en detalle las principales técnicas para investigar los mecanismos fundamentales de la visión de las moscas, incluido el análisis anatómico y óptico del ojo compuesto y los componentes moleculares y las reacciones bioquímicas de las células fotorreceptoras. Los artículos en video también incluyen consejos importantes sobre las dificultades inherentes a estas metodologías. Esta recopilación de métodos también debería ser beneficiosa para los científicos fuera de este campo de investigación, ya que estas técnicas podrían adaptarse a otras preparaciones biológicas.

Divulgaciones

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El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

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El autor no tiene agradecimientos.

Referencias

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  1. Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 202 (12), 839-851 (2016).
  2. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  3. Rosenbaum, E. E., et al. XPORT-dependent transport of TRP and rhodopsin. Neuron. 72 (4), 602-615 (2011).
  4. Vought, B. W., et al. Characterization of the primary photointermediates of Drosophila rhodopsin. Biochemistry. 39 (46), 14128-14137 (2000).
  5. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  6. Minke, B., Pak, W. L. The light-activated TRP channel: The founding member of the TRP channel superfamily. Journal of Neurogenetics. 36 (2-3), 55-64 (2022).
  7. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store-operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. The EMBO Journal. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  8. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  9. Raghu, P., Basak, B., Krishnan, H. Emerging perspectives on multidomain phosphatidylinositol transfer proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (9), 158984(2021).
  10. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  11. Bahner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  12. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  13. Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling, M. F., Stavenga, D. G. Automated charting of the visual space of housefly compound eyes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63643(2022).
  14. Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged proteins. Journal of Visualized Experiments. (179), e63375(2022).
  15. Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological methods for measuring photopigment levels in Drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments. (184), e63514(2022).
  16. Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of endogenous Drosophila Transient Receptor Potential channels. Journal of Visualized Experiments. (178), e63260(2021).
  17. Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analysis of lipid signaling in Drosophila photoreceptors using mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (181), e63516(2022).

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DrosophilaPhotoreceptor CellsMembrane Protein TraffickingPhotopigment LevelsElectrophysiological MethodsEndogenous ChannelsLipid SignalingMass SpectrometryVisualized Experiments

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