Este trabajo desarrolla un ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes de la señalización de Notch / DeltaD intra-linaje en la división de progenitores de glía radial del cerebro embrionario del pez cebra.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Ensayo de captación de anticuerpos para el seguimiento de la endocitosis notch/delta durante la división asimétrica de los progenitores radiales de la glía del pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
La división celular asimétrica (ACD), que produce dos células hijas de diferentes destinos, es fundamental para generar diversidad celular. En los órganos en desarrollo tanto de invertebrados como de vertebrados, la división asimétrica de progenitores genera una Notchhi auto-renovadora y una hija Notchlo diferenciadora. En el cerebro embrionario del pez cebra, los progenitores de la glía radial (RGP), las principales células madre neurales de vertebrados, se someten principalmente a ACD para dar a luz a un RGP y una neurona diferenciadora. La claridad óptica y la fácil accesibilidad de los embriones de pez cebra los hacen ideales para obtener imágenes de lapso de tiempo in vivo para visualizar directamente cómo y cuándo se establece la asimetría de la señalización Notch durante ACD. Estudios recientes han demostrado que la endocitosis dinámica del ligando Notch DeltaD juega un papel crucial en la determinación del destino celular durante la ACD, y el proceso está regulado por el regulador de polaridad conservado evolutivamente Par-3 (también conocido como Pard3) y el complejo motor de dineína. Para visualizar los patrones de tráfico in vivo de los endosomas de señalización de Notch en los RGP mitóticos, hemos desarrollado este ensayo de captación de anticuerpos. Usando el ensayo, hemos descubierto el dinamismo de los endosomas que contienen DeltaD durante la división RGP.
Introducción
La señalización de Notch controla la decisión y el patrón del destino celular durante el desarrollo en metazoos1, y estudios recientes han demostrado que la señalización de Notch en la división de células madre depende principalmente del tráfico endocítico 2,3. Endocytosed Notch/Delta puede activar la señalización de Notch en el núcleo y mejorar la transcripción de los genes diana de Notch 4,5,6. El tráfico endosomal direccional Notch/Delta se observó por primera vez en células precursoras de ó....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Hemos utilizado la línea de tipo salvaje AB y la línea transgénica Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] para el estudio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, San Francisco, EE.UU. (Número de aprobación: AN179000).
1. Preparación de embriones de pez cebra
- Instale tanques de cruce de peces por la tarde antes de las 5:00 p.m., con un pez hembra de tipo salvaje y un pez macho Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] usando divisores para separarlos en cada tanque.
- Retire los divisores antes de las 11:00 a.m.....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En la Figura 2A, los embriones inyectados con Atto647N, sin unirse con el anticuerpo primario, mostraron fluorescencia de fondo en el ventrículo cerebral. Se pueden observar muy pocas partículas fluorescentes engullidas en las células. Los embriones de pez cebra inyectados anti-Dld-Atto647N mostraron grandes cantidades de partículas fluorescentes internalizadas en la mayoría de las células del cerebro anterior en desarrollo (Figura 2A, panel derecho). Después de.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Hemos desarrollado un ensayo de captación de anticuerpos para el etiquetado y la obtención de imágenes del tráfico endosomal de Notch/Delta en progenitores radiales de la glía del pez cebra con alta eficiencia. En comparación con los métodos anteriores utilizados para rastrear anticuerpos anti-DeltaD marcados en células SOP de Drosophila 7,8, nuestro método utilizó microinyección en lugar de incubaciónde muestras en el anticuerpo conjugado. Se microinyectaron ant.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El proyecto fue apoyado por NIH R01NS120218, el Premio Mary Anne Koda-Kimble Seed a la Innovación de la UCSF y Chan Zuckerberg Biohub.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plato de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm; | de presión de aire P35GC-1.5-10-C | la corporación MatTek | |
| Narishige | IM300 | ||
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capilares, 1,2 mm de diámetro exterior, 0,9 mm de diámetro interior, con filamento | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Disco giratorio/Nikin de campo amplio de alta velocidad | N/A | Nikon Microscopio de fluorescencia invertida Ti con CSU-W1 confocal de gran campo de visión. | |
| Pinzas Médicas Dumont Estilo 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Tirador P897 Marrón Flameado | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Micromanipuladores | ||
| World Precision Instruments | WPI M3301R | ||
| Ratón anti-DLD | Abcam | AB_1268496 | |
| Tampón de bloqueo de IgG para ratones de Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM agarosa de bajo punto de fusión | Invitrogen | 16520050 |
Referencias
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daed....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
