Presentamos un método para la estimulación química flexible y multimodal y el registro de la actividad neuronal simultánea de muchos gusanos Caenorhabditis elegans . Este método utiliza microfluídica, hardware y software de código abierto y análisis de datos automatizados supervisados para permitir la medición de fenómenos neuronales como la adaptación, la inhibición temporal y la diafonía de estímulos.
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Artículo de método
Estimulación multimodal automatizada y registro neuronal simultáneo de múltiples organismos pequeños
En este artículo
Resumen
Resumen
Los indicadores fluorescentes de calcio codificados genéticamente han contribuido en gran medida a nuestra comprensión de la dinámica neuronal desde el nivel de las neuronas individuales hasta los circuitos cerebrales completos. Sin embargo, las respuestas neuronales pueden variar debido a la experiencia previa, los estados internos o los factores estocásticos, lo que genera la necesidad de métodos que puedan evaluar la función neuronal en muchos individuos a la vez. Mientras que la mayoría de las técnicas de registro examinan un solo animal a la vez, describimos el uso de microscopía de campo amplio para ampliar las grabaciones neuronales a docenas de Caenorhabditis elegans u otros organismos a escala submilimétrica a la vez. El hardware y el software de código abierto permiten una gran flexibilidad en la programación de experimentos totalmente automatizados que controlan la intensidad y el tiempo de varios tipos de estímulos, incluidos los estímulos químicos, ópticos, mecánicos, térmicos y electromagnéticos. En particular, los dispositivos de flujo microfluídico proporcionan un control preciso, repetible y cuantitativo de los estímulos quimiosensoriales con una resolución de tiempo inferior a un segundo. La tubería de análisis de datos semiautomatizada NeuroTracker extrae respuestas neuronales individuales y de toda la población para descubrir cambios funcionales en la excitabilidad y dinámica neuronal. Este artículo presenta ejemplos de medición de la adaptación neuronal, la inhibición temporal y la diafonía de estímulos. Estas técnicas aumentan la precisión y la repetibilidad de la estimulación, permiten la exploración de la variabilidad de la población y son generalizables a otras señales fluorescentes dinámicas en pequeños biosistemas, desde células y organoides hasta organismos completos y plantas.
Introducción
Las técnicas de imagen de calcio han permitido el registro no invasivo de la dinámica neuronal in vivo en tiempo real utilizando microscopía de fluorescencia e indicadores de calcio codificados genéticamente expresados en células diana 1,2,3. Estos sensores suelen utilizar una proteína fluorescente verde (GFP), como la familia de péptidos GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar la intensidad de fluorescencia tras la activación neuronal y los niveles elevados de calcio intracelular. Las imágenes de calcio han sido especialmente poderosas en el nematodo C. elega....
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Protocolo
1. Equipo de imagen neuronal
NOTA: Consulte Lawler y Albrecht15 para obtener instrucciones detalladas sobre la construcción del sistema de imágenes y estimulación, que controla el tiempo de iluminación del microscopio, la adquisición de imágenes y la entrega de estímulos (Figura 1). Un controlador de estímulo Arduino Nano de bajo costo acciona las válvulas fluídicas a través de señales digitales a un controlador de válvula y controla la iluminación optogenética a través de señales de voltaje analógicas a un controlador LED. Otros estímulos, como los motores de vibración y ....
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Resultados
Presentamos varios ejemplos de patrones de estímulo que evalúan diferentes fenómenos neuronales, incluida la inhibición temporal, la adaptación y la desinhibición. La inhibición temporal es la supresión momentánea de una respuesta neural a una segunda presentación de estímulo que ocurre poco después de la presentación inicial14. Para probar este fenómeno, en un experimento de pulso pareado, se presentaron ocho patrones que consisten en dos pulsos odorantes de 1 s separados por un .......
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Discusión
En este protocolo, describimos un sistema de microscopía de acceso abierto para la evaluación de fenómenos de actividad neuronal utilizando la entrega temporalmente precisa de diferentes patrones de estímulo. La plataforma microfluídica ofrece estímulos repetibles mientras mantiene a decenas de animales en el campo de visión del microscopio. Pocos paquetes de software de microscopía comerciales permiten la fácil programación de varios patrones de sincronización de estímulos, y los que lo hacen a menudo requieren la entra.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Fox Avery por probar estos protocolos y revisar el manuscrito y a Eric Hall por la asistencia de programación. El financiamiento para los métodos presentados en este documento fue proporcionado en parte por la National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cepas bacterianas | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Centro de Genética (CGC) | Cat# OP50 | |
| Modelos experimentales: Organismos/cepas | |||
| C. elegans cepas que expresan GCaMP (y opcionalmente, Chrimson) en las neuronas deseadas | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) o autores correspondientes del trabajo publicado | NZ1091, por ejemplo | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetilo, ejemplo químico estímulo |
| Cloruro de calcio, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluoresceína, Sal de sodio | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Vidrio repelente al agua | Rain-X | Cat #800002250 | vidrio tratamiento hidrofóbico (de un solo uso) |
| Cloruro de magnesio, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Medio de crecimiento de nematodos (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Placas de Petri (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poli(dimetilsiloxano) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Fosfato de potasio dibásico | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Cloruro de sodio, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctilo)triclorosilano (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | vidrio tratamiento hidrofóbico (duradero) |
| Software y algoritmos | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | ||
| Microscopio software de control | Albrecht Lab https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | ||
| Neurotracker software de análisis de datos | Albrecht Lab https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | ||
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 microscopio invertido configurado para epifluorescencia (cubos de filtro GFP, 5 veces; objetivo o similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS Iluminador LED | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Cámara digital sCMOS | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| Válvula de aislamiento de diafragma en miniatura de 3 vías (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Válvula 1: Control |
| de 2 vías normalmente cerrada (NC) Válvula de pellizco | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Válvula 2: |
| Válvula de pellizco de 3 vías | de salida NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Estímulo selección |
| LED y controlador de estimulación optogenética (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S y #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 controlador de válvulas digital/manual | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Cables y conectores | varios | Ver Fig. 2 del Protocolo Cell STARS (Lawler, 2021) | |
| Preparación de dispositivos microfluídicos | |||
| Cortadora rotativa de velocidad variable Dremel 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Ajuste la velocidad a 5k RPM para cortar vidrio |
| Dremel taladro estación de trabajo de herramienta rotativa | Dremel | Cat #220-01 | |
| Broca de diamante | Dremel | Cat #7134 | |
| Corredera de vidrio, 1 mm de espesor | VWR | Cat #75799-268 | |
| Trazador de vidrio (Trazador de diamante) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Llave de paso de 3 vías | Luer Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G Aguja roma | VWR | Cat #89134-100 | |
| Dispositivo microfluídico | Autor correspondiente o fabricación a partir de archivos CAD asociados con este artículo | N/A | |
| Pinza para dispositivo microfluídico | Warner Instruments (o taller mecánico) | P-2 | |
| Tubo microfluídico, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tubo 19 g, 0.5′ | Tubo pequeño de Nueva Inglaterra | Cat #NE-1027-12 |
Referencias
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H.
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Reimpresiones y permisos
