Artículo de método

Cuantificación y caracterización del genoma completo del ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire

DOI:

10.3791/65053

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30 de junio de 2023

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1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

En este artículo

Resumen

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Este protocolo tiene como objetivo cuantificar el ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire para ser utilizado en estudios epidemiológicos basados en aguas residuales y evaluar el riesgo de exposición al SARS-CoV-2 en aerosoles interiores y exteriores. Este protocolo también describe un enfoque de secuenciación de plantilla larga de amplicón en mosaico para la caracterización del genoma completo del SARS-CoV-2.

Resumen

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La epidemiología basada en las aguas residuales se ha convertido en un sistema de vigilancia prometedor y eficaz para el SARS-CoV-2 y otras enfermedades infecciosas en muchos países. El proceso suele implicar la concentración de aguas residuales, la extracción de ácidos nucleicos, la amplificación de segmentos genómicos seleccionados y la detección y cuantificación del segmento genómico amplificado. De manera similar, esta metodología se puede aprovechar para detectar y cuantificar agentes infecciosos, como el SARS-CoV-2, en muestras de aire. Inicialmente, se suponía que el SARS-CoV-2 se propagaba principalmente a través del contacto personal cercano con gotitas generadas por una persona infectada al hablar, estornudar, toser, cantar o respirar. Sin embargo, un número creciente de estudios han informado de la presencia de ARN del SARS-CoV-2 en el aire de los centros sanitarios, estableciendo la transmisión aérea como una ruta viable para el virus. Este estudio presenta una combinación de protocolos establecidos para facilitar la detección, cuantificación y secuenciación ambiental de virus a partir de muestras de aguas residuales y aire.

Introducción

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En diciembre de 2019, surgió una nueva enfermedad llamada COVID-19, causada por un coronavirus previamente desconocido, el SARS-CoV-21. La pandemia mundial resultante ha presentado un desafío significativo para los laboratorios clínicos y de salud pública en todo el mundo, ya que un gran número de personas requieren pruebas para evaluar con precisión la transmisión y prevalencia del virus en la comunidad. Sin embargo, en muchas regiones, alcanzar el nivel necesario de pruebas de manera oportuna y espacialmente exhaustiva es económicamente inviable 2,3. Los sistemas de vigilancia actuales, basados en el diagnóstico clínico individual, dependen en gran medida de la gravedad de los síntomas y de la notificación individual, así como de la medida en que estos síntomas se solapan con las enfermedades existentes que circulan en la población 4,5,6,7,8,9,10. En consecuencia, un elevado número de casos asintomáticos contribuye a una subestimación significativa de la carga de enfermedad 7,11.

Debido a estos desafíos, se propuso la epidemiología basada en aguas residuales (WBE, por sus siglas en inglés) para la vigilancia de la COVID-19 como una estrategia de vigilancia complementaria. El WBE se describió por primera vez en 200112, y se utilizó inicialmente para rastrear cocaína y otras drogas ilegales13. Este enfoque se basa en la suposición de que es posible calcular la concentración inicial de cualquier sustancia que sea estable en las aguas residuales y excretada por los seres humanos 8,12. WBE se ha implementado con éxito en muchos países como un sistema de vigilancia complementario y eficiente para el SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. La mayoría de los métodos para detectar virus humanos en ambientes acuáticos siguen estos pasos: concentración, extracción de ácidos nucleicos, amplificación del segmento (o segmentos) genómicos elegidos y detección/cuantificación del segmento genómico amplificado3.

Otro entorno importante para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2 es en muestras de aire. Inicialmente, se pensaba que el SARS-CoV-2 se transmitía principalmente a través del contacto personal cercano con gotitas respiratorias de aerosoles generados por una persona infectada al hablar, estornudar, toser, cantar o respirar17. Sin embargo, varios estudios comenzaron a relatar la presencia de ARN del SARS-CoV-2 en el aire, especialmente en establecimientos de salud y otros espacios cerrados 18,19,20,21. Se han encontrado evidencias de viabilidad del SARS-CoV-2 en muestras de aire tomadas en interiores de hospitales y otros espacios cerrados cuando la concentración del virus era lo suficientemente alta22,23,2 4. En general, los estudios al aire libre no han encontrado evidencia de SARS-CoV-2, excepto en espacios al aire libre concurridos 21,25,26,27,28,29. Hasta el momento, la transmisión aérea del SARS-CoV-2 ha sido reconocida como un modo de transmisión30,31. Un estudio de revisión reciente muestra las diferencias entre el aire libre, donde los riesgos de transmisión aérea son mínimos fuera de las áreas concurridas, y el interior, donde los riesgos más grandes podrían estar presentes en entornos mal ventilados en los que podría haber fuentes fuertes (es decir, el número de personas infectadas). Un reciente estudio de revisión exhaustiva ha puesto de relieve las diferencias sustanciales entre los riesgos de transmisión aérea en entornos exteriores frente a interiores, especialmente en zonas concurridas con poca ventilación. El estudio indica que el riesgo de transmisión aérea es mínimo en ambientes exteriores, donde existe un mayor volumen de aire disponible para la dilución y dispersión de partículas virales32. Estos hallazgos tienen implicaciones importantes para las políticas y directrices de salud pública relacionadas con la COVID-19. Al reconocer las diferencias significativas en los riesgos de transmisión entre ambientes interiores y exteriores, los responsables de la formulación de políticas pueden desarrollar estrategias más eficaces para mitigar la propagación del virus y proteger la salud pública.

Existe una variedad de métodos y protocolos para la detección, cuantificación y secuenciación del SARS-CoV-2 a partir de diferentes muestras ambientales. Este artículo de método tiene como objetivo presentar una combinación de protocolos bien establecidos que permiten a los laboratorios con diferentes niveles de capacidad realizar la detección, cuantificación y secuenciación ambiental de virus a partir de muestras de aguas residuales y aire.

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Protocolo

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Todos los métodos descritos aquí han sido publicados en otros lugares y contienen pequeñas modificaciones con respecto a los métodos originales.

1. Recogida de aguas residuales y preprocesamiento de muestras

NOTA: Debido a las bajas concentraciones de ARN del SARS-CoV-2 en muestras ambientales, la implementación de un paso de concentración es crucial para una detección exitosa33,34,35. Aquí se describe el primer método reportado para la detección del SARS-CoV-2 en aguas residuales36.

  1. Recogida y concentración de muestras de aguas residuales
    1. Recoja 1 L de muestra compuesta de aguas residuales de 24 h. Almacenar la muestra a 4 °C y continuar con el protocolo en un plazo de 24 h.
    2. Homogeneizar la muestra agitando suavemente el frasco. Recoja 70 ml en un tubo centrífugo de 100 ml o divida la muestra en dos tubos centrífugos de 50 ml.
    3. Espigar 20 μL de mengovirus (3,2 x 103 copias/μL) a 70 mL de cada muestra como control interno del proceso de concentración. Alternativamente, inyecte 10 μL de mengovirus (3,2 x 103 copias/μL) en cada tubo de centrífuga de 50 mL.
    4. Homogeneizar la muestra y centrifugar a 700 x g durante 10 min para eliminar partículas grandes y organismos (pellet).
    5. Utilizar el sobrenadante resultante para la concentración con dispositivos de ultrafiltración centrífuga con un corte de 10 KDa centrifugando a 4.000 x g durante 40 min a 4 °C. Eluir el concentrado centrifugando a 700 x g durante 40 min e invirtiendo la posición del dispositivo de ultrafiltración.
    6. Mide el volumen del concentrado resultante. El volumen cambiará dependiendo de la cantidad de sólidos en la muestra que obstruyan los filtros centrífugos. En este estudio, los volúmenes de concentrado obtenidos estuvieron entre 200-1.200 μL.
    7. Utilice el concentrado resultante para la extracción de ARN utilizando un kit comercial o un método interno. Para las muestras utilizadas en este estudio, se utiliza un kit comercial específico para la extracción de ARN viral con un volumen de elución de 50 μL.
    8. Mida la concentración del ARN extraído con un kit de cuantificación fluorométrica de ARN. Divida el ARN extraído en alícuotas y congele a -80 °C hasta su posterior análisis.
      NOTA: Para cada conjunto de procedimientos de aislamiento de ARN, se debe incluir un control negativo de aislamiento (NCI), que contenga solo tampones para detectar una posible contaminación durante la extracción.
  2. Recogida de muestras de aire con un muestreador de aire compacto Coriolis
    1. Elija una estrategia de muestreo de acuerdo con el objetivo de la investigación definiendo la frecuencia de muestreo y los lugares de muestreo.
    2. Ajuste el caudal en el muestreador de aire (en este caso, 50 L/min durante 30 min). Tenga en cuenta que un caudal superior a 200 L/min puede degradar el ARN viral, por lo que se recomienda utilizar un caudal inferior a 200 L/min.
    3. Coloque un cono estéril en el muestreador de aire antes de iniciar la recolección pulsando el botón de inicio. Una vez finalizada la toma de muestras, agregue 5-15 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en el cono. Agite suavemente la muestra con la mano durante 15 s. Almacenar las muestras durante un máximo de 24 h a 4 °C o a -80 °C en criotubos.
    4. Se puede realizar un paso de concentración opcional. Limpie y descontamine los conos después de cada experimento con lejía.
    5. Extraiga el ARN utilizando un kit comercial o un método interno. Para las muestras de este estudio se utiliza un kit comercial específico para la extracción de ARN viral con un volumen de elución de 50 μL.
    6. Mida la concentración del ARN extraído con un kit de cuantificación fluorométrica de ARN. Divida el ARN extraído en alícuotas y congele a -80 °C hasta su posterior análisis.
      NOTA: Para cada conjunto de procedimientos de aislamiento de ARN, se debe incluir un control negativo de aislamiento (NCI), que contenga solo tampones para detectar una posible contaminación durante la extracción.

2. Cuantificación del ARN del SARS-CoV-2 mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

NOTA: El siguiente protocolo está de acuerdo con el panel de diagnóstico RT-PCR37 de los CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV). Divida la mezcla de cebador/sonda en varias alícuotas para evitar ciclos de congelación y descongelación.

  1. Preparar la mezcla maestra de reacción para cada objetivo (mengovirus; SARS-CoV-2 [genes N1 y N2]) como en la Tabla 1, en una campana limpia en la sala de preparación de reactivos. Mezcle la mezcla de cebadores/sonda y la enzima por inversión cinco veces. Alternativamente, pulse la luz en el vórtice de la mezcla de cebadores / sonda y enzima cinco veces.
    NOTA: Mantenga todos los reactivos fríos durante la preparación y el uso. Con el fin de minimizar los ciclos de congelación-descongelación, se recomienda encarecidamente congelar en alícuotas.
  2. Girar hacia abajo (1.000 x g durante 15-30 s) los tubos para recoger el contenido en el fondo y colocarlos en una rejilla fría o sobre hielo.
  3. Etiquete tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para cada objetivo. Añadir a cada tubo de microcentrífuga la cantidad de cada reactivo necesario (volumen por reacción multiplicado por el número de reacciones, incluidos los controles necesarios). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrifugar durante 5 s para recoger el contenido en el fondo.
  4. Mantenga los tubos de microcentrífuga en una rejilla fría y dispense 15 μL en tubos de PCR en tiras o en una placa de 96 pocillos en una rejilla de enfriamiento. Cubra la placa y muévala al área de manipulación de ácidos nucleicos (manténgala en una rejilla de enfriamiento).
  5. Descongele una alícuota de ARN extraído y un vórtice suave durante 5 s. Pipetear 5 μL de ARN (además de 5 μL de control no molde [NTC], control negativo de aislamiento [NCI] y control positivo [PC]) a cada pocillo o tubo de reacción que contenga la mezcla maestra previamente preparada. Cámbiese los guantes con frecuencia según sea necesario para evitar la contaminación cruzada.
  6. Cubra toda la placa o tubos de reacción y haga un vórtice suave. Centrifugar (1.000 x g durante 15-30 s) la placa o los tubos de PCR.
  7. Iniciar la RT-qPCR de 25 μL con las siguientes condiciones cíclicas: transcriptasa inversa a 45 °C durante 10 min; activación de la polimerasa a 95 °C durante 10 min; 45 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s; y recocido/extensión a 60 °C durante 45 s.
  8. Calcular la eficiencia de recuperación de los controles de mengovirus según lo reportado por Conte et al.38:
    figure-protocol-1 × 100

3. Variantes de secuenciación en aguas residuales y análisis de datos

NOTA: El protocolo descrito es un protocolo modificado creado por Quick et al.39,40. Utiliza dos juegos de cebadores para la amplificación del genoma del SARS-CoV-2 mediante la metodología de mosaico de PCR: cebadores ARTIC y cebadores VarSkip. Se utiliza una combinación de cebadores para garantizar la mejor cobertura del genoma y minimizar la posibilidad de nuevas mutaciones que provoquen el fallo de los cebadores de un tipo. En general, el protocolo se divide en tres partes: transcripción inversa (RT) y generación de amplicones, preparación de la biblioteca de secuenciación y secuenciación y análisis de datos.

  1. Transcripción inversa y generación de amplicones
    1. Asegúrese de que las muestras de entrada tengan un valor de umbral de ciclo (Ct) de qPCR conocido para diluirlas correctamente en agua de grado PCR. El valor de Ct se obtiene durante la cuantificación con qPCR. Las diluciones son las siguientes: si el valor de Ct es 12-15, diluir las muestras 1:100; si el valor de Ct es 15-18, diluir las muestras 1:10; si el valor de Ct es de 18-35, no diluya la muestra. Las muestras por encima de un valor de Ct de 35 tienen una alta probabilidad de no funcionar.
    2. En una placa de PCR, pipetear 16 μL de cada muestra hasta su posición en la placa. Añadir 4 μL de mezcla maestra de transcripción inversa (RT) (5x). Cubra la placa e inicie la reacción de PCR con las siguientes condiciones: 25 °C durante 2 min, 55 °C durante 20 min y 95 °C durante 1 min.
    3. Preparar diluciones de 10 μM de cada juego de cebadores (ARTIC pool A y pool B, y VarSkip pool A y pool B). Prepare la mezcla maestra para cada juego de cebadores (ARTIC set A y B, y VarSkip set A y B) como se muestra en la Tabla 2. De esto resultarán cuatro mastermixes.
    4. En una nueva placa de PCR, pipetear 20 μL de la mezcla maestra en cada pocillo correspondiente. Añadir 5 μL de la muestra RT a cada mezcla.
      NOTA: Cada muestra tendrá cuatro mezclas de reacción: el grupo ARTIC A y B, y el grupo VarSkip A y B.
    5. Cubra la placa e inicie la reacción de PCR de la siguiente manera: activación de la polimerasa a 98 °C durante 30 s; 35 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 15 s; y recocido/extensión a 65 °C durante 4 min. Girar hacia abajo (1.000 x g durante 15-30 s) el plato. Combine los grupos de reacción ARTIC y combine por separado los grupos de reacción VarSkip. Cada muestra tendrá dos reacciones de amplicón de 50 μL.
    6. Agregue 50 μL de reactivo a base de perlas para la purificación por PCR a cada pocillo y mezcle bien mediante pipeteo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
      NOTA: Antes de cada uso, mezcle vigorosamente el reactivo de purificación por PCR para resuspender las perlas.
    7. Coloque la placa en un soporte de separación magnética y espere a que las perlas formen un gránulo y el líquido se aclare (~ 5 min). Pipetear y desechar el sobrenadante. Mantenga la placa de PCR en el soporte magnético.
    8. Manteniendo la placa de PCR en el soporte magnético, agregue 200 μL de etanol al 80% a cada muestra sin tocar el gránulo de perlas. Retira el etanol.
    9. Repita el paso anterior. Deje la placa en el soporte magnético descubierta durante 30 s para permitir que el etanol se evapore.
    10. Retire la placa del soporte magnético y agregue 15 μL de agua de grado PCR a cada muestra. Vuelva a suspender el gránulo pipeteando. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
    11. Vuelva a colocar la placa en el soporte magnético y deje que las cuentas se despeguen (2 min). Pipetear cuidadosamente 15 μL del sobrenadante de cada muestra en una nueva placa de PCR.
    12. Mida la concentración de cada muestra con un kit de cuantificación fluorométrica de ARN. Tome aproximadamente 50 ng de cada muestra en 12,5 μL para el siguiente paso. Si es necesario, diluya la muestra en agua apta para PCR.
  2. Preparación de la biblioteca
    1. Añadir 1,75 μL de tampón de reacción del kit de preparación de la biblioteca de ADN de Illumina y 0,75 μL de mezcla de enzimas a cada muestra. Cubra la placa, haga un vórtice brevemente y gire hacia abajo (1.000 x g durante 15-30 s). Incubar a 21 °C durante 5 min y a 65 °C durante 5 min.
    2. En una placa nueva, pipetee 3 μL de agua apta para PCR para cada muestra en una nueva placa de PCR. Agregue 0,75 μL de las muestras preparadas, 1,25 μL de códigos de barras para la preparación de la biblioteca de secuenciación y 5 μL de mezcla maestra de ADN ligasa T4. Mezclar bien pipeteando, centrifugar brevemente (1.000 x g durante 15-30 s) en una centrífuga e incubar a 21 °C durante 20 min y a 65 °C durante 10 min.
      NOTA: Si utiliza menos de 25 muestras, duplique todos los volúmenes en este paso.
    3. Agrupe todas las muestras añadiendo 10 μl de cada muestra al mismo tubo de baja unión. Lleve 480 μL al siguiente paso.
    4. Añadir 192 μL de reactivo a base de perlas para la purificación por PCR a la piscina y mezclar bien mediante pipeteo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Coloque el tubo en un soporte magnético y espere a que el sobrenadante se aclare y se forme una bolita de perlas. Retire el sobrenadante. Retire el tubo del soporte magnético.
    6. Añadir 700 μL del tampón de fragmentos cortos (SFB) y mezclar mediante pipeteo. Vuelva a colocarlo en el soporte magnético y espere a que se forme el gránulo y el líquido se aclare (~5 min). Pipetear el sobrenadante y desecharlo.
    7. Repita el paso anterior. Deje el tubo en el soporte magnético. Añadir 100 μL de etanol al 80% sin tocar la perla. Pipetear el etanol y dejar que la perla se seque durante 30 s.
      NOTA: No permita que el cordón se seque demasiado.
    8. Retire el tubo del soporte magnético y agregue 35 μL de agua de grado PCR. Mezclar pipeteando e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Coloque el tubo en el soporte magnético y deje que la perla se granule y el líquido se aclare. Pipetear 35 μL del sobrenadante a un tubo nuevo.
    9. Mida la concentración de ARN de la biblioteca agrupada. Pipetear el volumen necesario para alcanzar una cantidad de 30-50 ng de ARN y llenarlo con agua de grado PCR para alcanzar un volumen final de 30 μL.
    10. Prepare la mezcla de reacción de ligadura del adaptador: 30 μL de la biblioteca agrupada, 5 μL de la mezcla adaptadora II, 10 μL del tampón de reacción de ligadura (5x) y 5 μL de ADN ligasa T4. Mezclar por pipeteo y centrifugado (1.000 x g durante 15-30 s). Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    11. Añadir 20 μL del reactivo a base de perlas para la purificación por PCR y mezclar mediante pipeteo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    12. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere a que se forme la bolita de cuentas y el sobrenadante se vuelva incoloro. Pipetee con cuidado y deseche el sobrenadante.
    13. Retirar del soporte magnético y añadir 125 μL de SFB. Mezcle pipeteando y vuelva a colocar en el soporte magnético para separar las perlas. Cuando el líquido esté claro, pipetear y desechar el sobrenadante.
    14. Repita el paso anterior. Deje el tubo abierto en el soporte magnético durante 30 s para que se evapore parte del líquido sobrante.
    15. Retire el tubo del soporte magnético y agregue 15 μL del tampón de elución. Mezclar bien pipeteando y centrifugar brevemente (1.000 x g durante 15-30 s). Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque en el soporte magnético durante 2 min.
    16. Pipetear 15 μL del sobrenadante en un nuevo tubo de baja fijación. Esta es la biblioteca final. Mida la concentración con un kit de cuantificación fluorométrica de ADN.
      NOTA: En el siguiente paso, se necesitan 12 μL. Si la concentración es muy alta y se necesitan menos de 12 μL de la biblioteca, llene hasta 12 μL con el reactivo tampón de elución.
  3. Carga y secuenciación de celdas de flujo
    1. Inserte la celda de flujo (R9.4.1) en el dispositivo de secuenciación de ADN y ARN en tiempo real.
    2. Prepare la mezcla de cebado añadiendo 30 μL de reactivo de fijación de lavado (FLT) a un tubo de reactivo tampón de lavado (FB). Vórtice para mezclar y centrifugar (1.000 x g durante 15-30 s).
    3. Abra la tapa del puerto de cebado. Con una pipeta de 1.000 μL, ajústela a 200 μL e inserte la punta en el puerto de cebado. Gire la rueda de ajuste de volumen y aumente el volumen hasta que se vea el líquido en la punta. Deseche la punta.
      NOTA: Solo gire la rueda hasta que se vean unos pocos μL de líquido en la punta. Extraer cantidades más grandes podría dañar la celda de flujo.
    4. Agregue lentamente 800 μL de la mezcla de cebado al puerto de cebado, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Espere 5 min.
    5. Mientras tanto, prepare las bibliotecas para la carga. Mezcle 37,5 μL del tampón de secuenciación, 25,5 μL del tampón de carga y 12 μL de la biblioteca.
      NOTA: Mezcle el tampón de carga antes de pipetear. Las perlas de este reactivo se asientan muy rápidamente.
    6. Abra la tapa del puerto. Pipetear 200 μL de la mezcla de cebado en el puerto de cebado.
      NOTA: Al pipetear en el puerto de cebado con el puerto de la tapa abierto, se notarán pequeñas gotas que salen del puerto de muestra. Pipetea lo suficientemente lento como para que el puerto de muestra pueda aspirar las gotas sin que se derramen.
    7. Antes de cargar la biblioteca preparada, mezcle bien pipeteando. Con una pipeta de 100 μL ajustada a 75 μL, lleve la biblioteca y la pipeta gota a gota en el puerto de muestra. No toque el puerto y espere a que cada gota se absorba en el puerto antes de cargar la siguiente gota para evitar el desbordamiento del líquido.
    8. Cierre el puerto de la cubierta y el puerto de cebado. Abra el software e inicie el experimento de secuenciación. Seleccione Llamada base activada. Para una biblioteca con 96 muestras multiplexadas, 10-12 h de secuenciación suelen ser suficientes para generar datos suficientes.
      NOTA: Usando el software, se puede insertar la hoja de muestra en formato .csv. La hoja de muestra requiere los siguientes datos: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code y kit. Se necesita el ID de la celda de flujo (que aparece en el costado de la celda de flujo) junto con el kit utilizado. Para el protocolo sugerido, se debe seleccionar el kit LSK109.
  4. Análisis de datos de secuenciación
    1. Inserte las lecturas fastq comprimidas en el flujo de trabajo wf-artic41. Ejecute el flujo de trabajo por separado con dos esquemas de imprimación diferentes (ARTIC/V4.1 y NEB-VarSkip/v1a). Dos". primertrimmed.rg.sorted.bam" para cada ejemplo.
    2. Combine los archivos BAM en un solo archivo con el comando "samtools merge"42. Inserte el archivo BAM combinado en la herramienta Freyja, dejando la configuración predeterminada, para recuperar las abundancias relativas de linaje43.
    3. Para crear un archivo FASTA, inserte el archivo BAM combinado en las herramientas "samtools mpileup" e "ivar" con la configuración predeterminada44,45. Para la llamada de mutación, cargue el archivo FASTA en la herramienta Nextclade46,47.

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Resultados

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Los resultados resumidos en la Tabla 3 muestran ejemplos de detección y cuantificación de ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire utilizando el método descrito en este artículo. Las muestras de aguas residuales se recogieron en plantas de tratamiento de aguas residuales de España y Eslovenia y se consideraron positivas si el Ct era inferior a 40 en al menos dos de las tres réplicas, considerándose válida la cuantificación si el Ct tenía una variación inferior al 5%. En España y Portugal...

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Discusión

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La detección y cuantificación microbiana y viral mediante métodos de (RT-)qPCR ha obtenido una amplia aceptación debido a su notable sensibilidad. Sin embargo, estas técnicas se enfrentan a numerosos retos a la hora de analizar muestras ambientales. Las muestras de aguas residuales contienen una gran cantidad de sustancias inhibidoras que pueden sesgar las mediciones y generar resultados engañosos. Para hacer frente a estas limitaciones y mejorar la precisión, se concibió, diseñó e implementó un protocolo complejo. Este ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses económicos contrapuestos ni otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo se ha realizado con el apoyo financiero de la Junta de Castilla y León y del programa FEDER (proyectos CLU 2017-09, UIC315 y VA266P20).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Adaptador + A25 + A2: D19 + A2: D20 + A2 + A2: D19Oxford NanoporeEXP-AMII001Secuenciación
AllPrep PowerViral Kit de ADN/ARNQiagen28000-50Kit de extracción de ARN
AMPure XPBeckman CoulterA63880Purificación de PCR, limpieza de NGS, limpieza de PCR
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon PanelIDT10011442del genoma del SARS-CoV-2
Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367S Preparación dela biblioteca
CENTRICON PLUS­ 70 10KDA.Fisher Scientific10296062Filtros de concentración
MUESTREADOR DE AIRE COMPACTO PORIOLIS,Bertin Technologies083-DU001Muestreador de aire
Duran  frascos de laboratorioMerckZ305200-10EA Botellas demuestreo
Célula de flujo (R9.4.1)Oxford NanoporeFLO-MIN106D
Secuenciación Consumibles generales de laboratorio (tubos, placas qPCR, etc)
Kit de secuenciación de ligaduraOxford NanoporeSQK-LSK109Secuenciación
LunaScript  Kit RT SuperMixNEBE3010  Síntesis de ADNc
Kit de control de extracción de mengovirus Biomé rieuxKMGControl de concentración
Nalgene General Almacenamiento a largo plazo Tubos criogénicos Thermofisher5011-0012Almacenamiento de muestras
Expansión de código de barras nativo 1-12 (sin PCROxford NanoporeEXP-NBD104Códigos de barras
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNEBE7595Reparación de ADN
NEBNext VarSkip Mezclas cortas de cebadores para SARS-CoV-2NEBE7658Amplificación del genoma del SARS-CoV-2
NEBNext  Tampón de reacción de ligadura rápidaNEBB6058SSecuenciación 
Solución salina tamponada con fosfatoMerckP4474Tampón de colección
Solución salina tamponada con fosfato (PBS, 1X), filtrada estérilmenteThermofisherJ61196. APElución de muestras de aire
Q5  Mezcla maestra de alta fidelidad 2X de arranque en calienteNEBM0494Spolimerasa de inicio en caliente
Qubit ARN HS Kit de ensayoThermofisherQ32852Cuantificación de ARN
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Kit de sondaIDT10006713Mezcla de cebador-sonda y control positivo qPCR
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master MixThermofisherA15299Kit RT-qPCR
ADN

Referencias

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