Concentración de partículas de virus de muestras ambientales de agua y aguas residuales mediante floculación y ultrafiltración de leche desnatada

Resumen

La concentración de virus a partir de muestras ambientales de agua y aguas residuales es una tarea desafiante, llevada a cabo principalmente para la identificación y cuantificación de virus. Si bien se han desarrollado y probado varios métodos de concentración de virus, demostramos aquí la efectividad de la ultrafiltración y la floculación de leche desnatada para virus de ARN con diferentes tipos de muestras.

Resumen

La epidemiología basada en el agua y las aguas residuales ha surgido como métodos alternativos para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades. La recuperación de fracciones microbianas, incluidos virus, bacterias y microeucariotas de aguas residuales y muestras de agua ambiental es uno de los pasos desafiantes en estos enfoques. En este estudio, nos centramos en la eficiencia de recuperación de los métodos secuenciales de ultrafiltración y floculación de leche desnatada (SMF) utilizando ARN blindado como virus de prueba, que también se utiliza como control en algunos otros estudios. Se aplicó prefiltración con filtros de disco de membrana de 0,45 μm y 0,2 μm para eliminar las partículas sólidas antes de la ultrafiltración para evitar la obstrucción de los dispositivos de ultrafiltración. Las muestras de prueba, procesadas con el método de ultrafiltración secuencial, se centrifugaron a dos velocidades diferentes. Una mayor velocidad resultó en menores tasas de recuperación y positividad de ARN blindado. Por otro lado, SMF resultó en tasas de recuperación y positividad relativamente consistentes de ARN blindado. Pruebas adicionales realizadas con muestras de agua ambiental demostraron la utilidad de SMF para concentrar otras fracciones microbianas. La partición de los virus en partículas sólidas podría tener un impacto en las tasas generales de recuperación, teniendo en cuenta el paso de prefiltración aplicado antes de la ultrafiltración de muestras de aguas residuales. SMF con prefiltración funcionó mejor cuando se aplicó a muestras de agua ambiental debido a las concentraciones de sólidos más bajas en las muestras y, por lo tanto, a las tasas de partición más bajas a sólidos. En el presente estudio, la idea de utilizar un método de ultrafiltración secuencial surgió de la necesidad de disminuir el volumen final de los concentrados virales durante la pandemia de COVID-19, cuando el suministro de los dispositivos de ultrafiltración comúnmente utilizados era limitado, y existía la necesidad del desarrollo de métodos alternativos de concentración viral.

Introducción

La determinación de la concentración efectiva de microorganismos en muestras de superficie y aguas residuales para análisis de comunidades microbianas y estudios epidemiológicos, es uno de los pasos importantes para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades ^1,2. La pandemia de COVID-19, puso de manifiesto la importancia de mejorar los métodos de concentración. COVID-19 surgió a fines de 2019 y, a partir de marzo de 2023, todavía representa una amenaza para la salud humana, la vida social y la economía. Las estrategias efectivas de vigilancia y control para aliviar los impactos de los brot....

Protocolo

1. Comparación de la ultrafiltración en serie y la floculación de la leche desnatada para concentrar virus en muestras de aguas residuales

1. Preparación de muestras
   1. Recolectar 2 L de muestras compuestas de aguas residuales crudas (afluentes) proporcionales al caudal de 24 h. Se recogieron muestras de las tres principales plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) en Winnipeg, Canadá, durante el verano y el otoño de 2020 (Tabla 1).
   2. Transportar las muestras al laboratorio en botellas a prueba de luz en una nevera y procesarlas en 24 h. Recopilar datos de características físico-químicas y biológicas de la....

Resultados

Evaluación de métodos de concentración de ARN viral
Las seis muestras procesadas con UF-3k x g fueron positivas y resultaron en una recuperación del 13,38% ± 8,14% (Figura 1). Solo una muestra fue positiva cuando las muestras se procesaron con UF-7.5k x g. Todas las muestras procesadas con SMF fueron positivas y resultaron en una recuperación del 15,27% ± del 2,65% (Figura 1). Las tasas promedio de recuperación de UF-3K x g .......

Discusión

Uno de los pasos críticos en este estudio es la eliminación de partículas sólidas mediante la aplicación de un paso de prefiltración con filtros de membrana de 0,2 μm y 0,45 μm. Considerando la partición de los virus en partículas sólidas, especialmente los virus envueltos, la prefiltración puede causar una pérdida significativa en la recuperación viral³⁰. Si bien un paso de prefiltración para los métodos de ultrafiltración casi siempre es necesario para las muestras ambientales y de aguas residua.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tampón de fosfato sódico 0,2 M con un pH de 7,5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0,2 μ m Filtros de disco de membrana Supor-200 de 47 mm	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μ m Filtros de disco de membrana Supor-200 de 47 mm	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU
RNA blindado Quant IPC-1 Control de procesamiento	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, EE. UU
Marca A, Dispositivo centrífugo Jumbosep, 30 kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Marca B, Microsep Dispositivo centrífugo avanzado, Pall de 30 kDa		MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Tubos centrífugos (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV Cápsulas de muestreo de agua subterránea de alta capacidad - 0.45 µ m	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Ácido clorhídrico, solución estándar 1N	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, Nueva Jersey, EE. UU.
Kit de aislamiento de ácido ultranucleico del microbioma MagMAX	Biosystems aplicados	A42358	Thermo Fisher Scientific
Agua libre de nucleasa	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI,
Bomba peristáltica	Masterflex, instrumento Cole-Parmer	7553-20 Medidor de	Thermo Fisher Scientific
	Instrumento Denver	RK-59503-25	Cole-Parmer. Este producto ha sido descatalogado
Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, EE. UU.
Conjuntos de cebadores y sondas	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, EE. UU.
Qiagen Kit de microbioma de potencia de ADN/ARN de preparación completa	Qiagen Qiagen		Sciences, Inc., Germantown, MD, EE. UU
QuantStudio 5 PCR en tiempo real Sistema	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.
Kit de ensayo Qubit 1X dsDNA de alta sensibilidad (HS)	Invitrogen	Q33231	Fluorímetro Thermo Fisher Scientific
Qubit 4, con WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit Kit de ensayo de ARN de alta sensibilidad (HS)	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
ARNasa A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, EE. UU
Leche desnatada en polvo	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, Nueva Jersey, EE. UU.
Tampón de fosfato de sodio	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canadá
Agua de mar sintética	VWR	RC8363-1	RICCA empresa química
ADN sintético monocatenario gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, EE. UU
Dispositivos de filtración al vacío VacuCap 90 - 0.1 y micro; m, 90 mm, irradiado con rayos gamma	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Dispositivos de filtración al vacío VacuCap 90 - 0.2 y micro; m, 90 mm, irradiado con rayos gamma	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoetanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, Nueva Jersey, EE. UU.

. . de EE. UU. pH . . .