Artículo de método

Preparación de matrices descelularizadas 3D a partir de músculo esquelético fetal de ratón para cultivo celular

DOI:

10.3791/65069

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3 de marzo de 2023

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1Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes and Global Change & Sustainability Institute, Department of Animal Biology, Faculty of Sciences, University of Lisbon

En este artículo

Resumen

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En este trabajo, se optimizó un protocolo de descelularización para obtener matrices descelularizadas del músculo esquelético fetal del ratón. Los mioblastos C2C12 pueden colonizar estas matrices, proliferar y diferenciarse. Este modelo in vitro se puede utilizar para estudiar el comportamiento celular en el contexto de enfermedades del músculo esquelético, como las distrofias musculares.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La matriz extracelular (ECM) juega un papel crucial en proporcionar soporte estructural para las células y transmitir señales que son importantes para diversos procesos celulares. Los modelos de cultivo celular bidimensionales (2D) simplifican en exceso las complejas interacciones entre las células y la ECM, ya que la falta de un soporte tridimensional completo (3D) puede alterar el comportamiento celular, haciéndolos inadecuados para comprender los procesos in vivo . Las deficiencias en la composición de la ECM y las interacciones célula-ECM son contribuyentes importantes a una variedad de enfermedades diferentes.

Un ejemplo es la distrofia muscular congénita LAMA2 (LAMA2-CMD), donde la ausencia o reducción de laminina funcional 211 y 221 puede conducir a hipotonía severa, detectable en o poco después del nacimiento. Trabajos previos utilizando un modelo de ratón de la enfermedad sugieren que su inicio ocurre durante la miogénesis fetal. El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un modelo 3D in vitro que permitiera el estudio de las interacciones entre las células musculares y la ECM del músculo fetal, imitando el microambiente nativo. Este protocolo utiliza músculos profundos de la espalda diseccionados de fetos de ratón E18.5, tratados con un tampón hipotónico, un detergente aniónico y DNasa. Las matrices descelularizadas resultantes (dECM) retuvieron todas las proteínas ECM probadas (laminina α2, lamininas totales, fibronectina, colágeno I y colágeno IV) en comparación con el tejido nativo.

Cuando los mioblastos C2C12 se sembraron sobre estos dECM, penetraron y colonizaron los dECM, lo que apoyó su proliferación y diferenciación. Además, las células C2C12 produjeron proteínas ECM, contribuyendo a la remodelación de su nicho dentro de las dECM. El establecimiento de esta plataforma in vitro proporciona un nuevo enfoque prometedor para desentrañar los procesos involucrados en la aparición de LAMA2-CMD, y tiene el potencial de adaptarse a otras enfermedades del músculo esquelético donde las deficiencias en la comunicación entre la ECM y las células del músculo esquelético contribuyen a la progresión de la enfermedad.

Introducción

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La matriz extracelular (ECM) es un componente importante de los tejidos, que representa su componente no celular. Esta estructura tridimensional (3D) no solo proporciona soporte físico a las células, sino que también desempeña un papel crucial en los procesos bioquímicos involucrados en el desarrollo de los organismos1. La formación de una ECM específica del tejido ocurre durante el desarrollo, como resultado de las complejas interacciones entre las células y sus nichos, influenciadas por diversos estímulos intra y extracelulares. La ECM es una estructura altamente dinámica que sufre reordenamientos químicos y mecánicos de manera temporal-espacial e impacta directamente en el destino celular2. Una de las características más notables de la ECM es su diversidad funcional, ya que cada ECM tisular muestra una combinación única de moléculas que proporcionan diferentes topologías y propiedades que se adaptan a las células que contiene1.

La señalización y el apoyo de la ECM son cruciales para el desarrollo y la homeostasis, y cuando se interrumpen pueden conducir a múltiples condiciones patológicas 3,4. Un ejemplo es la distrofia congénita deficiente en LAMA2 (LAMA2-CMD), que es la forma más común de distrofia muscular congénita. El gen LAMA2 codifica para la cadena α2 de laminina, que está presente en la laminina 211 y la laminina 221, y cuando está mutada puede conducir a LAMA2-CMD 5. La laminina 211 es la principal isoforma que se encuentra en la membrana basal que rodea las fibras del músculo esquelético. Cuando la laminina 211 es anormal o está ausente, el vínculo entre la membrana basal y las células musculares se interrumpe, lo que lleva a la aparición de la enfermedad6. Los pacientes con LAMA2-CMD muestran un fenotipo de leve a grave dependiendo del tipo de mutación en el gen LAMA2.

Cuando la función de la proteína laminina α2 se ve afectada, los pacientes pueden experimentar hipotonía muscular severa al nacer y desarrollar inflamación crónica, fibrosis y atrofia muscular, lo que lleva a una esperanza de vida reducida. Hasta la fecha, no se han desarrollado tratamientos dirigidos y los enfoques terapéuticos se limitan a aliviar los síntomas de la enfermedad7. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes involucrados en la aparición de esta enfermedad es crucial para el desarrollo de estrategias terapéuticas apropiadas 6,8. Trabajos previos con el ratón dyW 9, un modelo para LAMA2-CMD, sugieren que el inicio de la enfermedad comienza en el útero, específicamente durante la miogénesis fetal10. Una mejor comprensión de cómo surge el defecto de miogénesis fetal sería un cambio de juego en la generación de nuevos enfoques terapéuticos para LAMA2-CMD.

Los sistemas in vitro proporcionan un entorno controlado para estudiar las interacciones célula-célula y célula-ECM, pero los modelos de cultivo 2D carecen de la complejidad de los tejidos nativos. La descelularización de los tejidos produce andamios de ECM acelulares específicos para el tejido y la etapa de desarrollo que imitan con mayor precisión el microambiente celular natural en comparación con los modelos 2D y los andamios diseñados / sintéticos. Las matrices descelularizadas (dECMs) tienen el potencial de preservar las señales moleculares y mecánicas del tejido huésped, convirtiéndolas en mejores modelos alternativos para la comprensión de los procesos in vivo 11.

Existen diversas técnicas, reactivos y condiciones que pueden ser utilizadas para la descelularización12,13. En este estudio, un protocolo de descelularización para el corazón fetal del ratón, descrito por Silva et al.14,15, se adapta al músculo esquelético fetal del ratón y se encuentra que retiene todos los componentes de la ECM probados (laminina α2, lamininas totales, fibronectina, colágeno I y colágeno IV). El protocolo incluye tres pasos: lisis celular por choque osmótico (tampón hipotónico), disolución de la membrana plasmática y disociación de proteínas (dodecil sulfato de sodio al 0,05% [SDS]) y destrucción enzimática del ADN (tratamiento con DNasa). Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo establecido para descelularizar el músculo esquelético fetal del ratón.

Para utilizar este sistema 3D in vitro para estudiar LAMA2-CMD, es crucial mantener la cadena α2 de laminina después de la descelularización. Por lo tanto, se implementó un protocolo de optimización donde se probaron diferentes detergentes (SDS y Triton X-100) y concentraciones (0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% y 0.5%) (datos no mostrados). Se encontró que la opción óptima para la eliminación celular y la preservación de la proteína laminina α2 era 0.05% SDS. Se utilizaron células C2C12, una línea celular de mioblastos bien establecida16,17, para sembrar los dECM. Estas células invaden la dECM, proliferan y se diferencian dentro de estos andamios, sintetizando nuevas proteínas ECM. La producción exitosa de este modelo 3D in vitro ofrece un nuevo enfoque para comprender los procesos moleculares y celulares involucrados en la miogénesis fetal, el inicio de LAMA2-CMD, y puede extenderse a otras enfermedades musculares donde se interrumpe la comunicación entre la ECM y las células del músculo esquelético.

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Protocolo

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Todas las metodologías descritas fueron aprobadas por el Comité de Bienestar Animal (ORBEA) de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Lisboa y la Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), y están de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/UE.

1. Preparación de tampones y reactivos de descelularización

NOTA: Todas las soluciones utilizadas durante el protocolo de descelularización deben esterilizarse en autoclave y almacenarse hasta 3 meses, a menos que se indique lo contrario.

  1. Prepare solución salina tamponada con fosfato 10x (10x PBS) agregando cloruro de sodio (NaCl) a 137 mM, cloruro de potasio (KCl) a 2.68 mM, fosfato de potasio-dihidrógeno (KH 2 PO 4) a 8.1 mM y dihidrato de disodio-hidrógeno-fosfato (Na 2 HPO4) a 1.47 mM al agua desmineralizada (dH2O) y ajuste el pH a 6.8. Agregue 100 mL de 10x PBS a 900 mL deH2Odesmineralizado para generar 1x PBS. Autoclave y conservar a temperatura ambiente (RT). Agregue una solución madre estéril de penicilina/estreptomicina (10,000 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina [pluma/estreptococo]) a una concentración final de 1% antes de usar.
  2. Preparar el tampón hipotónico disolviendo 1,21 g de Tris(hidroximetil)aminometano (Tris base) y 1 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en 1 L dedH2O(10 mM Tris base 0,1% EDTA). Use un agitador magnético hasta que se disuelva y ajuste el pH a 7.8 con NaOH / HCl. Esterilizar en autoclave y almacenar en RT. Agregue la pluma/estreptococo a una concentración final del 1% antes de usar.
  3. Preparar el tampón de lavado hipotónico disolviendo 1,21 g de Tris base en 1 L dedH2O(10 mM de base Tris). Use un agitador magnético hasta que se disuelva y ajuste el pH a 7.8 con NaOH / HCl. Autoclave y guárdelo en RT. Agregue la pluma / estreptococo al 1% antes de usar.
  4. Prepare el tratamiento con detergente aniónico agregando 0,05 g de dodecil sulfato de sodio (SDS) a 100 ml de tampón de lavado hipotónico para producir una solución de tratamiento SDS al 0,05%. Filtrar a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Almacenar en RT por hasta 1 mes.
    NOTA: La solución SDS no debe esterilizarse en autoclave, ya que SDS precipita y se degrada al esterilizarse en autoclave.
  5. Preparar la solución de tratamiento con DNasa disolviendo 1,21 g de Tris base en 0,5 mL dedH2Oy añadir 1 mL de cloruro de magnesio 1 M (MgCl2). Ajuste el pH a 7.8 con NaOH/HCl. Autoclave y almacenar en RT. Agregue DNasa I antes de usar (50 U/mL).

2. Recogida de muestras

NOTA: En el estudio se utilizaron ratones C57/BL6 de tipo salvaje. Todas las técnicas se realizaron en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.

  1. Eutanasia de ratones hembra hembra embarazadas adultos en el día embrionario (E) 18.5 del embarazo utilizando la inhalación de isoflurano seguida de luxación cervical. Someter a los ratones a una disección terminal para extraer los fetos.
    1. Rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70%.
    2. Usando fórceps quirúrgicos y tijeras, levante un pliegue de piel en la parte inferior del abdomen y haga una incisión en forma de U para exponer la cavidad abdominal18.
    3. Recoja los cuernos uterinos que contienen los fetos E18.5 cortando los oviductos y el cuello uterino y transfiéralos inmediatamente a una placa de Petri con PBS 1x helado con 1% de pluma/estreptococo18.
    4. Extraer rápidamente los fetos del útero y de los tejidos extraembrionarios y sacrificarlos por decapitación con tijeras18.
  2. Transfiera un feto a la vez a una placa de Petri con 1x PBS helado. Con un microscopio estereoscópico, retire la piel y corte las extremidades. Desde el lado ventral, corte a través de la caja torácica y retire el esternón y los órganos subyacentes.
  3. Voltea el lado dorsal del tronco fetal hacia arriba. Retire la porción cervical de la columna vertebral, los depósitos de grasa dorsal y el tejido conectivo en la parte superior de los músculos profundos de la espalda.
  4. Use fórceps quirúrgicos para anclar la caja torácica y raspe y separe cuidadosamente los músculos profundos de la espalda de los tejidos circundantes con un micro bisturí10. Este procedimiento da como resultado el aislamiento de dos piezas musculares por feto (izquierda y derecha), ambas compuestas principalmente por músculos longissimus e iliocostalis , con algunos de los músculos transversoespinal y elevador costarum incluidos.
  5. Almacene las muestras musculares en 1x PBS con pluma/estreptococo al 1% a 4 °C para almacenamiento a corto plazo (<1 semana), o a -80 °C durante períodos más largos.
    NOTA: Utilice muestras recién recolectadas para obtener mejores resultados. Las muestras congeladas durante períodos prolongados (>3 meses) muestran una menor eficiencia de descelularización y una mayor degradación de proteínas. Se utilizaron masas musculares epaxiales para los experimentos de descelularización, pero otros músculos (por ejemplo, los músculos de las extremidades) pueden procesarse para la descelularización utilizando el mismo protocolo.

3. Descelularización del músculo esquelético fetal

NOTA: Todas las técnicas se realizaron en una campana de flujo laminar en condiciones estériles. Para obtener una representación esquemática detallada, consulte la figura 1A. Todos los pasos se realizaron con agitación en un agitador orbital con un diámetro de 120 mm (165 rpm) a 25 °C a menos que se indique lo contrario. Agregue un 1% de pluma/estreptococo a las soluciones antes de usarlas. Al extraer las soluciones, aspirar cuidadosamente para evitar que la muestra quede atrapada en la pipeta.

  1. Día 1 - Prepare aproximadamente fragmentos de tejido de 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3.5 mg) de las masas musculares epaxiales. Agregue 3 ml de tampón hipotónico con pluma/estreptococo al 1% a cada pocillo de una placa de 12 pocillos y agregue un fragmento de tejido muscular completo por pocillo.
    1. Incubar los fragmentos de tejido en tampón hipotónico con agitación durante 18 h (durante la noche) (O/N).
  2. Día 2 - Aspirar el tampón hipotónico con una pipeta de punta fina y lavar las muestras 3 x 1 h con 3 mL de 1x PBS cada vez con agitación.
    1. Incubar las muestras durante 24 h con 3 mL de solución detergente SDS al 0,05% con agitación.
      NOTA: (PUNTO DE VERIFICACIÓN) Después de la incubación de SDS, las muestras deben ser transparentes en apariencia. Las muestras muestran una consistencia similar a la gelatina y, por lo tanto, son más propensas a adherirse a la pipeta al eliminar los líquidos.
  3. Día 3 - Retire la solución detergente SDS con una pipeta de punta fina y lave los fragmentos de tejido 3 x 20 min con 3 ml de tampón de lavado hipotónico cada vez con agitación.
    NOTA: (PUNTO DE PAUSA) Las muestras pueden mantenerse en tampón de lavado hipotónico a 4 °C durante 18 h (O/N). Asegúrese de que el SDS se elimine bien durante los pasos de lavado, ya que el SDS residual puede ser citotóxico.
    1. Incubar los fragmentos de tejido durante 3 h con 2 ml de solución de DNasa con agitación a 37 °C.
    2. Retire la solución de DNasa con una pipeta de punta fina y lave los fragmentos de tejido 3 x 20 min con 3 ml de 1x PBS cada vez con agitación. Finalmente, lavar O/N con agitación (60 rpm).
      NOTA: Después del tratamiento con DNasa, los dECM se vuelven pegajosos debido a la presencia de residuos de ADN. Por lo tanto, es necesario un lavado cuidadoso.
    3. Almacenar los dECM en 1x PBS con 1% de pluma/estreptococo a 4 °C hasta la recelularización (<1 semana). Para otros usos, conservar a -80 °C.

4. Evaluación de la calidad de la descelularización

NOTA: Se realizó cuantificación de ADN, tinción DAPI/verde de metilo y tinción de faloidina para evaluar la presencia de contenido celular residual después de la descelularización. Se realizaron análisis inmunohistoquímicos y Western blot para evaluar la retención de proteínas clave de la ECM después de la descelularización.

  1. Cuantificación del ADN presente en el dECM
    NOTA: Los dECM deben compararse con el tejido nativo para detectar la presencia de ADN.
    1. Antes de la descelularización, pese un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en una báscula digital de alta precisión. Antes de transferir la muestra de músculo al tubo, retire todo el PBS 1x restante con una toalla de papel. Pese el tubo con la muestra. Calcule el peso húmedo de las muestras usando la ecuación (1):
      Peso húmedo de la muestra =peso tubo con muestras- pesotubo vacío (1)
    2. Descelularizar las muestras siguiendo el protocolo descrito en la sección 3.
    3. Coloque las muestras en tubos de microcentrífuga de 2 ml.
      NOTA: Las muestras pueden mantenerse a -20 °C hasta la extracción y cuantificación del ADN.
    4. Realice la extracción de ADN de los dECM y muestras de tejido nativo utilizando un kit basado en columnas de centrifugado. Agregue el tampón de digestión de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    5. Homogeneice las muestras en un molino de perlas dos veces durante 2,5 minutos cada vez (volteando los soportes) usando una perla de carburo de tungsteno por tubo (use soportes de tubo refrigerados).
    6. Añadir proteinasa K e incubar O/N con agitación lenta a 56 °C.
    7. Proceda con el protocolo como se describe en las instrucciones del fabricante.
    8. Eluya con el tampón proporcionado por el fabricante y centrifugar 2 x 1 min a ≥6,000 x g, cada vez a 4 °C para aumentar el rendimiento de ADN.
      NOTA: El ADN se puede almacenar a -20 °C hasta la cuantificación.
    9. Cuantificar el ADN presente en las muestras utilizando un kit de detección de dsDNA fluorescente siguiendo las instrucciones del fabricante.
    10. Normalice el contenido de ADN como nanogramos de ADN por miligramo de peso húmedo original de la muestra.
    11. Analice los datos utilizando una prueba t de Student de dos colas y exprese como la media ± error estándar de la media (SEM).
  2. Inmunohistoquímica
    NOTA: Las soluciones 1, 2 y 3 y la solución fijadora deben prepararse antes de su uso y pueden mantenerse congeladas hasta por 6 meses. Todos los anticuerpos y colorantes utilizados y las diluciones respectivas se enumeran en Cuadro 1.
    1. Preparación de soluciones
      1. Preparar la solución fijadora añadiendo 2 g de paraformaldehído (PFA), 8 g de sacarosa y 24 μL de 1 M CaCl 2 a 77 mL de 0,2 M Na2 HPO 4 y 23 mL de 0,2 MNaH2PO 4, a un volumen final de 200 mL añadiendodH2O. Ajustar el pH a 7,4.
      2. Preparar tampón fosfato 0,12 M añadiendo 13,5 g deNa2HPO 4 y 3,2 g deNaH2PO 4 a 1 L dedH2O. Ajustar el pH a7,4.
      3. Preparar la solución 1 añadiendo 4 g de sacarosa a 100 ml de tampón fosfato 0,12 M.
      4. Preparar la solución 2 añadiendo 15 g de sacarosa a 100 ml de tampón fosfato 0,12 M.
      5. Preparar la solución 3 añadiendo 15 g de sacarosa y 7,5 g de gelatina a 100 ml de tampón fosfato 0,12 M. Calentar a 37 °C hasta que la gelatina se disuelva.
      6. Preparar la solución madre de verde de metilo (polvo verde de metilo al 2% disuelto endH2O)19.
    2. Inmunodetección
      1. Fijar las muestras con la solución fijadora durante al menos 4 h a 4 °C.
      2. Lave las muestras 2 veces durante 10 minutos con 1 PBS.
      3. Conservar O/N, o durante 1 día, en solución 1 a 4 °C.
      4. Lavar y conservar O/N o durante 1 día en solución 2 a 4 °C. Deje que las muestras se calienten a RT.
      5. Incubar durante 3 h en solución 3 a 37 °C. Conservar la solución extra 3 a 37 °C para utilizarla más tarde.
      6. Moldee recipientes pequeños (2 cm x 1 cm x 1 cm) en papel de aluminio. Coloque una capa delgada de solución 3 en el recipiente moldeado y déjelo reposar. Coloque las muestras sobre la solución solidificada 3 y cubra con la solución tibia 3. Orientar las muestras y dejar que se solidifiquen. Marque la ubicación en la solución solidificada 3 con un bolígrafo de color.
      7. Congele colocando los recipientes sobre la superficie del isopentano seco refrigerado con hielo o nitrógeno líquido.
      8. Utilizando el compuesto de temperatura de corte óptima (O.C.T.), fije los cubos de gelatina congelados que contienen las muestras al soporte de criostato.
      9. Secciona los cubos de gelatina congelada y transfiere las secciones de tejido a los portaobjetos. Dejar secar durante 60 min.
      10. Use un marcador hidrofóbico para trazar una línea alrededor de las secciones.
      11. Lave las diapositivas 3 x 10 min en 1x PBS.
      12. Cubra las secciones con albúmina sérica bovina (BSA) al 1%, suero de cabra al 1% y Triton X-100 al 0,05% diluido en 1x PBS (solución de bloqueo) durante 30 minutos (paso de bloqueo).
      13. Diluir los anticuerpos primarios en solución de bloqueo y cubrir las secciones. Incubar O/N a 4 °C en una caja cerrada, con papel húmedo, para evitar que las secciones se sequen.
      14. Lave las diapositivas 3 x 10 min con 1x PBS.
      15. Diluir los anticuerpos secundarios en solución de bloqueo y cubrir las secciones. Incubar durante 1,5 h a RT en la oscuridad.
        NOTA: Evite la exposición a la luz para evitar la degradación del fluoróforo.
      16. Lave las diapositivas 3 x 10 min con 4x PBS.
        NOTA: Se puede usar una mayor concentración de PBS cuando hay un fondo fuerte.
      17. Sumergir los portaobjetos en solución DAPI (5 μg/mL 1,4-diazabiciclo-2,2,2-octano en Triton X-100/1x PBS al 0,1%) durante 30 s cada uno.
      18. Enjuague en 1x PBS.
      19. Monte las secciones en medio antidecolorante (50 mg/ml de n-propil-galato en 1x PBS:glicerol [1:9]) y selle con un cubreobjetos. Conservar a 4 °C hasta la observación y adquisición de imágenes en un microscopio de fluorescencia20.
        NOTA: Para los experimentos de inmunohistoquímica in toto , se utilizó el mismo protocolo (ver pasos 4.2.2.12-4.2.2.18), excepto que las muestras se fijaron previamente en PFA al 4% diluido en 1x PBS durante 3 h en RT. La tinción de ADN se realizó agregando verde de metilo a la solución secundaria de anticuerpos. Todos los anticuerpos y colorantes utilizados, y sus respectivas diluciones, se enumeran en la Tabla 1. Luego, las muestras se montaron en medio antidecolorante entre dos cubreobjetos separados por anillos de acero, pegados con cera de abejas, y se adquirieron pilas de imágenes de 100 μm utilizando un microscopio confocal21.
  3. Análisis de Western blot
    NOTA: Todos los anticuerpos utilizados y las diluciones respectivas se enumeran en Cuadro 1.
    1. Preparación de soluciones
      1. Prepare el tampón de carga 2x SDS-PAGE agregando 20 ml de glicerol, 4 g de SDS y 0,2 ml de azul de bromofenol a 80 ml de solución base de Tris de 100 mM. Ajuste el pH a 6.8. Agregue ditiothreitol fresco (DTT) antes de usar.
      2. Prepare el tampón de lavado salino tamponado Tris con solución Tween 20 (TBST) agregando 2.4 g de base de Tris, 8.8 g de NaCl y 1 ml de Tween-20 adH2Oa un volumen final de 1 L. Ajuste el pH a 7.4-7.6 usando HCl.
      3. Prepare el tampón de funcionamiento 10x (RB) agregando 30.2 g de base de Tris, 144.2 g de glicina y 10 g de SDS a 1 L de dH2O. Antes de usar, agregue 100 ml de 10x RB a 900 ml dedH2Opara preparar 1x RB (solución de trabajo).
        NOTA: Mientras que 10x RB se puede almacenar en RT durante varios meses, 1x RB se puede reutilizar en diferentes ejecuciones.
      4. Prepare el tampón de transferencia (TB) agregando 5.82 g de Tris base, 2.93 g de glicina y 0.5 g de SDS a 800 mL dedH2O. Después de disolver los componentes, agregue 200 ml de metanol. Enfriar a 4 °C.
        NOTA: La TB debe prepararse recién antes de cada uso.
    2. Extracción de proteínas
      1. Recoja los músculos epaxiales de ratones E18.5 y colóquelos inmediatamente en un tubo de microcentrífuga (2 ml) que contenga 2 tampones de carga SDS-PAGE con TDT recién agregado (100 mM DTT). Procese E18.5 dECM de la misma manera.
      2. Agregue una perla de carburo de tungsteno por tubo. Homogeneice 2x en un molino de perlas durante 2,5 minutos cada vez (voltee los soportes).
      3. Sonicar las muestras durante 5 minutos en un baño de ultrasonido.
      4. Calentar las muestras durante 10 min a 50 °C.
      5. Centrifugar las muestras a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C.
      6. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml.
      7. Cuantificar la proteína usando un espectrofotómetro de microvolumen.
      8. Conservar a -20 °C hasta su uso posterior.
    3. Electroforesis en gel de poliacrilamida
      1. Use gel de gradiente de acrilamida prefabricado (4% -20%)
      2. Monte el gel en el tanque de electroforesis. Retire el peine con cuidado. Agregue 1x RB hasta que la línea se muestre en el tanque de electroforesis. Asegúrese de que los pozos estén llenos de RB.
      3. Cargar 100 μg de proteína por muestra en los pocillos. Carga 12 μL de proteína estándar de alto peso molecular.
      4. Funcionamiento durante un total de 100 min con voltaje constante (10 min a 150 V y 90 min a 185 V).
    4. Transferencia
      1. Remoje las almohadillas filtrantes y las esponjas con TB refrigerada (4 °C) mientras el gel está funcionando.
      2. Corte las membranas de difluoruro de polivinilideno al tamaño del gel. Actívalos con metanol y lavar condH2O. Remojar en la TB.
      3. Monte el casete de transferencia con las esponjas, almohadillas filtrantes, geles y membranas activadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      4. Coloque el casete en el tanque de electroforesis que contiene la TB refrigerada (sobre un lecho de hielo). Añada la unidad de refrigeración. Correr durante 90 minutos a 100 V.
      5. Después de la transferencia, tiñe con un sustituto azul Coomassie para evaluar la calidad de la transferencia.
    5. Inmunodetección
      1. Prepare la solución de bloqueo (TBST con leche baja en grasa al 5%). Incubar las membranas con agitación durante 1 h a RT.
      2. Enjuague 3 x 5 s con TBST.
      3. Incubar las membranas O/N con los anticuerpos primarios diluidos en TBST con BSA al 2% y azida sódica al 0,02% (3 mL por membrana) en cámara fría (4 °C) con agitación.
      4. Al día siguiente, lavar 3 x 5 min con TBST.
      5. Incubar las membranas con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluidos en TBST con leche baja en grasa al 5% (5 ml para cada membrana) durante 1 h en RT.
      6. Lave las membranas con TBST 3 x 5 min. Mantener en TBST hasta el paso de detección.
      7. Visualice la proteína utilizando un kit de desarrollo disponible comercialmente. Agregue reactivos de detección de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Adquiere imágenes de las bandas.
      8. Para probar más de un anticuerpo por membrana, después de la etapa de detección, elimine los anticuerpos anteriores con tres lavados (5 minutos cada uno) usando TBST y repita los pasos 4.3.5.2-4.3.5.7.

Tabla 1: Anticuerpos y colorantes utilizados en inmunohistoquímica y análisis de Western blot y las diluciones respectivas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.10,22

5. Cultivo celular en matrices descelularizadas

NOTA: Todas las técnicas se realizaron en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Todas las incubaciones se realizaron a 37 °C y con 5% deCO2.

  1. Preparar el medio de cultivo celular, medio de águila modificado de Dulbecco con glucosa alta con glutamina estable y con piruvato de sodio (DMEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de pluma/estreptococo (medio de cultivo completo).
  2. Coloque los dECM en una placa de Petri en 1x PBS con 1% de pluma/estreptococo en una campana de flujo laminar y sepárelos en trozos de aproximadamente 500 μm x 500 μm x 250 μm, utilizando un micro bisturí y pinzas.
    NOTA: Las dECM tienen una textura suave y, por lo tanto, a menudo es más fácil usar pinzas para separarlas en trozos aproximadamente del mismo tamaño en lugar de cortarlas con el micro bisturí.
  3. Transfiera los fragmentos a una placa de 96 pocillos (tres o cuatro piezas por pocillo) con 200 μL de medio de cultivo completo, previamente calentado a 37 °C. Incubar durante 2 h en la incubadora.
  4. Añadir 500 μL de tripsina a un matraz T25 sembrado con células C2C12 subconfluentes (~70%). Resuspender en 1 mL de medio completo.
  5. Añadir 10 μL de la resuspensión a 10 μL de colorante azul de tripano y cargar en un hemocitómetro. Contar y calcular el número de células y confirmar la viabilidad celular.
  6. Aspirar el medio de la placa de 96 pocillos que contiene los dECM y añadir 200 μL de medio de cultivo completo que contenga 50.000 células C2C12 viables.
  7. Incubar durante 2 días y luego, usando pinzas, transferir las dECM (con las células) a una placa de 48 pocillos con 400 μL de medio de cultivo completo. Cada 2 días, aspirar cuidadosamente el medio con una micropipeta para evitar que los dECM se desprendan del fondo del pozo y añadir medio fresco hasta el día 8.
    NOTA: Las matrices se mantienen durante 2 días en placas de 96 pocillos para promover la adhesión de las células C2C12 a los dECM, y luego se transfieren a una placa de 48 pocillos para permitir el acceso a un mayor volumen de medio con nutrientes. Los dECM deben adherirse al fondo de los pozos.
  8. Para el experimento de diferenciación, reemplace el medio de cultivo completo con medio de diferenciación (DMEM suplementado con 2% de suero de caballo y 1% de pluma/estreptococo) el día 8, seguido de incubación en medio de diferenciación durante 4 días hasta el día 12.

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Resultados

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El objetivo del protocolo de descelularización es producir dECMs que se asemejen mucho a la composición del tejido nativo. Para determinar la efectividad del proceso de descelularización, se emplearon varios métodos, incluido el examen de la morfología del tejido, la medición de los niveles de ADN, la tinción de F-actina y el análisis de componentes clave de la ECM utilizando inmunohistoquímica y técnicas de western blotting. Específicamente, se analizaron cinco componentes principales de ECM de los tejidos del músculo e...

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Discusión

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La ECM es una red compleja de macromoléculas que está presente en todos los tejidos y desempeña un papel crucial en la regulación del comportamiento y la función celular2. La ECM actúa como un andamio físico para que las células se adhieran y proporciona señales que modulan activamente los procesos celulares como la proliferación, la motilidad, la diferenciación y la apoptosis. Por lo tanto, la formación y el mantenimiento adecuados de la MCE son esenciales tanto para el desarrollo como para la ho...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por la Asociación Francesa contra las Miopatías (AFM-Téléthon; contrato no. 23049), el proyecto MATRIHEALTH y la unidad de financiación del cE3c UIDB/00329/2020. Nos gustaría agradecer a nuestro donante Henrique Meirelles que eligió apoyar el Proyecto MATRIHEALTH. Este trabajo se benefició de las infraestructuras de la Instalación de Microscopía de la Facultad de Ciencias, un nodo de la Plataforma Portuguesa de BioImagen (referencia PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), y agradecemos a Luís Marques por su ayuda con la adquisición y procesamiento de imágenes. Finalmente, agradecemos a Marta Palma por el apoyo técnico y a nuestro equipo de investigación por sus generosas contribuciones.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de cultivo celular de 12 pocillos, plana, TC, estérilAbdos LabwareP21021
4′,6-diamidino-2-fenilindol diclorhidratoMerckD8417
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Gel prefabricadoBio-Rad4561093
48 pocillos placa de cultivo celular, plana, TC, estérilAbdos LabwareP21023
96 pocillos placa de cultivo celular, plana, TC, estérilAbdos LabwareP21024
Albúmina de suero bovino, fracción VNZYtechMB04601
BX60 microscopio de fluorescenciaOlympus
Cryostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM alta glucosa con glutamina estable con piruvato de sodioBiowestL0103-500
DNasa IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & Kit de tisú Qiagen69506
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Merck108418
Suero fetal bovinoBiowestS1560-500
Pipeta de transferencia de punta finaThermoFisher15387823
Suero de cabraBiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 Incubadora de CO2Thermo Scientific
HiMark Proteína preteñidaInvitrogen
Estándar Suero de caballo, origen de Nueva ZelandaGibco16050122
HRP-α- IgG de conejoabcamab205718
HRP-α- IgG de rataabcamab205720
HRP-α- Ratón IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Verde de metiloSigma-Aldrich67060
MM400 Lyser de tejidosRetsch
NanoDrop ND-1000 Espectrofotómetro ThermoFisher
Paraformaldehído, 16% c/v aq. soln., libre de metanolAlfa Aesar043368-9M
Penicilina-estreptomicina (100x) GRiSPGTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Placa de Petri de poliestireno 60x15mm con rejillas de ventilación (estéril)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HSkit Thermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 FluorómetroInvitrogen15387293
S6E Zoom Microscopio estereoscópicoLeica
Sulfato de Dodecilo SódicoMerck11667289001
SuperFrost® Portaobjetos de adherencia PlusThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Sustrato quimioluminiscente
TCS SPELeica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥ 99 %VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Solución de azul de tripano, 0,4 %Gibco15250061
tripsina-EDTA (0,05 %) en DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (solución al 50 %)Rollo3005
WesternBright (0,22 y micro; m)AdvanstaL-08024-001
α-Colágeno Iabcamab21286
α-Colágeno IVMilliporeAB756P
α-Colágeno IVSanta Cruz Biotechnologysc-398655
α-FibronectinaSigmaF-3648
α-Laminina α 2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-Sondas moleculares de ratón Alexa 488A11017
α-Sondas moleculares de ratón Alexa 568A11019
α-pan-lamininaSigmaL- 9393
α-fosfo-histona 3Merk Millipore06-570
α-Sondasmoleculares de Rabbit Alexa 568A21069
α-Sondas moleculares Rabbit Alexa 488A11070
α-Sondas moleculares Rat Alexa 488A11006
Microscopio confocal Thermo Scientific 15626144 de membrana PVDF-CL ThermoFisher

Referencias

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