En este trabajo, se optimizó un protocolo de descelularización para obtener matrices descelularizadas del músculo esquelético fetal del ratón. Los mioblastos C2C12 pueden colonizar estas matrices, proliferar y diferenciarse. Este modelo in vitro se puede utilizar para estudiar el comportamiento celular en el contexto de enfermedades del músculo esquelético, como las distrofias musculares.
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Artículo de método
Preparación de matrices descelularizadas 3D a partir de músculo esquelético fetal de ratón para cultivo celular
En este artículo
Resumen
Resumen
La matriz extracelular (ECM) juega un papel crucial en proporcionar soporte estructural para las células y transmitir señales que son importantes para diversos procesos celulares. Los modelos de cultivo celular bidimensionales (2D) simplifican en exceso las complejas interacciones entre las células y la ECM, ya que la falta de un soporte tridimensional completo (3D) puede alterar el comportamiento celular, haciéndolos inadecuados para comprender los procesos in vivo . Las deficiencias en la composición de la ECM y las interacciones célula-ECM son contribuyentes importantes a una variedad de enfermedades diferentes.
Un ejemplo es la distrofia muscular congénita LAMA2 (LAMA2-CMD), donde la ausencia o reducción de laminina funcional 211 y 221 puede conducir a hipotonía severa, detectable en o poco después del nacimiento. Trabajos previos utilizando un modelo de ratón de la enfermedad sugieren que su inicio ocurre durante la miogénesis fetal. El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un modelo 3D in vitro que permitiera el estudio de las interacciones entre las células musculares y la ECM del músculo fetal, imitando el microambiente nativo. Este protocolo utiliza músculos profundos de la espalda diseccionados de fetos de ratón E18.5, tratados con un tampón hipotónico, un detergente aniónico y DNasa. Las matrices descelularizadas resultantes (dECM) retuvieron todas las proteínas ECM probadas (laminina α2, lamininas totales, fibronectina, colágeno I y colágeno IV) en comparación con el tejido nativo.
Cuando los mioblastos C2C12 se sembraron sobre estos dECM, penetraron y colonizaron los dECM, lo que apoyó su proliferación y diferenciación. Además, las células C2C12 produjeron proteínas ECM, contribuyendo a la remodelación de su nicho dentro de las dECM. El establecimiento de esta plataforma in vitro proporciona un nuevo enfoque prometedor para desentrañar los procesos involucrados en la aparición de LAMA2-CMD, y tiene el potencial de adaptarse a otras enfermedades del músculo esquelético donde las deficiencias en la comunicación entre la ECM y las células del músculo esquelético contribuyen a la progresión de la enfermedad.
Introducción
La matriz extracelular (ECM) es un componente importante de los tejidos, que representa su componente no celular. Esta estructura tridimensional (3D) no solo proporciona soporte físico a las células, sino que también desempeña un papel crucial en los procesos bioquímicos involucrados en el desarrollo de los organismos1. La formación de una ECM específica del tejido ocurre durante el desarrollo, como resultado de las complejas interacciones entre las células y sus nichos, influenciadas por diversos estímulos intra y extracelulares. La ECM es una estructura altamente dinámica que sufre reordenamientos químicos y mecánicos de manera temporal-espac....
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Protocolo
Todas las metodologías descritas fueron aprobadas por el Comité de Bienestar Animal (ORBEA) de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Lisboa y la Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), y están de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/UE.
1. Preparación de tampones y reactivos de descelularización
NOTA: Todas las soluciones utilizadas durante el protocolo de descelularización deben esterilizarse en autoclave y almacenarse hasta 3 meses, a menos que se indique lo contrario.
- Prepare solución salina tamponada con fosfato 10x (10x PBS) agregando cloruro de sodi....
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Resultados
El objetivo del protocolo de descelularización es producir dECMs que se asemejen mucho a la composición del tejido nativo. Para determinar la efectividad del proceso de descelularización, se emplearon varios métodos, incluido el examen de la morfología del tejido, la medición de los niveles de ADN, la tinción de F-actina y el análisis de componentes clave de la ECM utilizando inmunohistoquímica y técnicas de western blotting. Específicamente, se analizaron cinco componentes principales de ECM de los tejidos del músculo e.......
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Discusión
La ECM es una red compleja de macromoléculas que está presente en todos los tejidos y desempeña un papel crucial en la regulación del comportamiento y la función celular2. La ECM actúa como un andamio físico para que las células se adhieran y proporciona señales que modulan activamente los procesos celulares como la proliferación, la motilidad, la diferenciación y la apoptosis. Por lo tanto, la formación y el mantenimiento adecuados de la MCE son esenciales tanto para el desarrollo como para la ho.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Asociación Francesa contra las Miopatías (AFM-Téléthon; contrato no. 23049), el proyecto MATRIHEALTH y la unidad de financiación del cE3c UIDB/00329/2020. Nos gustaría agradecer a nuestro donante Henrique Meirelles que eligió apoyar el Proyecto MATRIHEALTH. Este trabajo se benefició de las infraestructuras de la Instalación de Microscopía de la Facultad de Ciencias, un nodo de la Plataforma Portuguesa de BioImagen (referencia PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), y agradecemos a Luís Marques por su ayuda con la adquisición y procesamiento de imágenes. Finalmente, agradecemos a Marta Palma por el apoyo técnico y a nue....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo celular de 12 pocillos, plana, TC, estéril | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato | Merck | D8417 | |
| 4– 20% Mini-PROTEAN TGX Gel prefabricado | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 pocillos placa de cultivo celular, plana, TC, estéril | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 pocillos placa de cultivo celular, plana, TC, estéril | Abdos Labware | P21024 | |
| Albúmina de suero bovino, fracción V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 microscopio de fluorescencia | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM alta glucosa con glutamina estable con piruvato de sodio | Biowest | L0103-500 | |
| DNasa I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Kit de tisú | Qiagen | 69506 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Suero fetal bovino | Biowest | S1560-500 | |
| Pipeta de transferencia de punta fina | ThermoFisher | 15387823 | |
| Suero de cabra | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 Incubadora de CO2 | Thermo Scientific | ||
| HiMark Proteína preteñida | Invitrogen | ||
| Estándar Suero de caballo, origen de Nueva Zelanda | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- IgG de conejo | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- IgG de rata | abcam | ab205720 | |
| HRP-α- Ratón IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Verde de metilo | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Lyser de tejidos | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Espectrofotómetro | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehído, 16% c/v aq. soln., libre de metanol | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicilina-estreptomicina (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Placa de Petri de poliestireno 60x15mm con rejillas de ventilación (estéril) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS | kit Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorómetro | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Microscopio estereoscópico | Leica | ||
| Sulfato de Dodecilo Sódico | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Portaobjetos de adherencia Plus | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Sustrato quimioluminiscente | |||
| TCS SPE | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥ 99 % | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Solución de azul de tripano, 0,4 % | Gibco | 15250061 | |
| tripsina-EDTA (0,05 %) en DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (solución al 50 %) | Rollo | 3005 | |
| WesternBright (0,22 y micro; m) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Colágeno I | abcam | ab21286 | |
| α-Colágeno IV | Millipore | AB756P | |
| α-Colágeno IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectina | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminina α 2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Sondas moleculares de ratón Alexa 488 | A11017 | ||
| α-Sondas moleculares de ratón Alexa 568 | A11019 | ||
| α-pan-laminina | Sigma | L- 9393 | |
| α-fosfo-histona 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Sondas | moleculares de Rabbit Alexa 568A21069 | ||
| α-Sondas moleculares Rabbit Alexa 488 | A11070 | ||
| α-Sondas moleculares Rat Alexa 488 | A11006 |
Referencias
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F.
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Reimpresiones y permisos
