Producción de neuronas humanas inducibles por neurogenina 2 en un biorreactor de suspensión tridimensional

Los trastornos neurológicos son la principal causa de discapacidad en todo el mundo¹. Una de cada seis personas se ve afectada, y la incidencia sigue aumentando. La carga financiera asociada para las sociedades y sus sistemas de atención de la salud es enorme. Una evaluación de 30 países europeos en 2010 estimó los costes anuales de 800.000 millones de euros relacionados con trastornos mentales y neurológicos². La creciente carga socioeconómica exige estrategias de tratamiento efectivas, y aunque nuestra comprensión de la fisiopatología de la enfermedad ha aumentado sustancialmente, la traducción a las clínicas a menudo es insuficiente. En general, solo el 12% de los productos farmacéuticos entran en ensayos clínicos, de los cuales más del 80% fracasan en etapas posteriores, principalmente debido a la ineficacia o toxicidad imprevista ^3,4. Las razones son variadas, pero la transferibilidad limitada de las pruebas con animales en etapas preclínicas a los ensayos en humanos ha pasado a primer plano cada vez más⁵. Los modelos humanos de células y tejidos in vitro pueden cerrar la brecha de la traducción entre especies, y los avances en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) poseen un gran potencial en este sentido. Las hiPSC son ampliamente utilizadas en la investigación básica y comparten características esenciales con las células madre embrionarias (hESCs), como una capacidad de autorrenovación casi ilimitada y la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinales⁶, al tiempo que eluden las preocupaciones éticas asociadas con la destrucción embrionaria.

La derivación de células neuronales a partir de hESCs, y más tarde hiPSCs, marcó un hito en la investigación del cerebro. Los protocolos iniciales de diferenciación se basaron en la aplicación de factores de crecimiento que imitan pasos críticos durante la embriogénesis, la mayoría de ellos con doble inhibición de SMAD en cultivos en suspensión o adherentes ^7,8,9. Las neuronas maduras se han generado con éxito, pero varios inconvenientes de estos protocolos aún dificultan su amplio uso en el desarrollo de fármacos, como el bajo rendimiento y la alta variabilidad de lote a lote de las neuronas generadas, así como la extensa carga de trabajo relacionada con los largos tiempos de cultivo. Se han logrado mejoras mediante la expresión forzada de factores de transcripción críticamente implicados en la neurogénesis, y los miembros de la familia de las neurogeninas (NGN), en particular la NGN2, han sido identificados como impulsores efectivos¹⁰. La expresión ectópica mediada por lentivirus de NGN2 en hiPSCs aceleró significativamente las primeras etapas de la diferenciación neuronal e indujo el destino celular neuronal en solo 1 semana¹¹. La maduración terminal posterior en cocultivos con astrocitos produjo neuronas funcionales en alta pureza y cantidad con propiedades reproducibles. Luego se aplicó la edición génica dirigida al sitio del locus de puerto seguro del sitio de integración de virus adenoasociados 1 (AAVS1) para crear líneas hiPSC con un casete de expresión estable e inducible por doxiciclina para NGN2^12,13, minimizando así los efectos secundarios no deseados de la administración lentiviral.

La diferenciación robusta y eficiente de las neuronas de neurogenina 2 inducibles por doxiciclina (iNGN2) tiene un gran potencial para los exámenes fenotípicos de fármacos de alto rendimiento y los ensayos de toxicidad^10,14,15; y se han logrado avances sustanciales en el bioprocesamiento durante la última década implementando biorreactores para una expansión y diferenciación celular escalable^16,17,18,19. Sin embargo, la mayoría de los protocolos de diferenciación están optimizados para culturas adherentes, y la traducción a un entorno tridimensional (3D) a menudo requiere modificaciones esenciales. Recientemente, se ha reportado el uso exitoso de un biorreactor 3D de sobremesa con características de esfuerzo cortante reducido para la expansión de hiPSCs y para la diferenciación reproducible en hepatocitos, cardiomiocitos y neuronas²⁰. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para la generación y caracterización de neuronas iNGN2 utilizando el biorreactor 3D de sobremesa idéntico.

NOTA: Todas las manipulaciones celulares, así como las placas de cultivo y las preparaciones del medio, deben realizarse en condiciones estériles. La campana de flujo laminar debe limpiarse a fondo antes de su uso y después del procesamiento limpiando todas las superficies con etanol al 70%. El protocolo descrito está optimizado para diferenciaciones neuronales en una Incubadora y Biorreactor 3D CERO (en lo sucesivo denominado biorreactor de sobremesa). Este biorreactor de sobremesa ofrece cuatro ranuras para tubos de biorreactores especializados, cada uno con una capacidad máxima de 50 ml. La temperatura y los niveles de_CO2 se controlan continuamente, y los parámetros de cultivo (por ejemplo, velocidad y tiempo de rotación) se regulan para cada tubo de forma independiente. Todos los pasos de aspiración se han realizado utilizando una pipeta de aspiración y una bomba de vacío, si no se indica lo contrario.

1. Cultivo y expansión de hiPSCs

NOTA: En este protocolo se utiliza la línea NGN2 hiPSC bionª inducible por doxiciclina El protocolo de expansión proporcionado aquí está optimizado para placas de Petri de 6 cm, pero se pueden usar formatos de cultivo alternativos si se prefiere.

1. Cubrir las placas de Petri de 6 cm con la matriz de la membrana basal diluida en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 (-/-) a una concentración final de 0,083 mg/ml/10 cm². Incubar los platos recubiertos a 37 °C durante al menos 30 min.
   NOTA: Puede encontrar un protocolo detallado para la preparación de la solución de matriz de membrana basal en las instrucciones del fabricante. Las hiPSCs se pueden cultivar en matrices extracelulares alternativas para su expansión.
2. Descongelar hiPSCs criopreservados según el EBiSC Cell line User^{Protocol 21} en medio de mantenimiento iPSC sin alimentador + inhibidor ROCK de 10 μM (Y-27632). Se recomienda una densidad de siembra de 1 × 10⁶ células viables por plato de 60 mm.
3. Cambie el medio al día siguiente a un medio de mantenimiento iPSC sin alimentador sin inhibidor de ROCK, y realice cambios diarios de medios.
4. Comience a pasar cuando los cultivos hiPSC alcancen una confluencia del 60%-80%. Verifique las áreas diferenciadas y limpie las colonias manualmente si el área supera el 5%.
   NOTA: Las hiPSC indiferenciadas aparecen como células redondas con un nucléolo prominente y menos citoplasma. Las colonias planas y apretadas se forman temprano después de la descongelación o el paso. En la Figura 1 se muestran imágenes ejemplares de campo claro de cultivos hiPSC. Se proporciona más información en el Protocolo de usuario de línea celular EBiSC²¹. Para el paso, prepare platos recubiertos con matriz de membrana basal y medio de mantenimiento iPSC sin alimentador.
5. Aspirar el medio a partir de cultivos de hiPSC y enjuagar las células 2x con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 mM en 1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) sin Ca 2+ y Mg²⁺ (DPS [-/-], ver Tabla de materiales).
6. Retire el sobrenadante y agregue 2 ml de EDTA de 0,5 mM en 1x DPBS (-/-) a las placas de Petri de 6 cm. Incubar las células a 37 °C durante 3 min en la incubadora.
7. Aspirar 1,5 ml de la solución de EDTA y continuar la incubación durante 3-5 min.
8. Golpee suavemente los platos para facilitar el desprendimiento de células.
   NOTA: Verifique el desprendimiento mediante evaluación visual. Las colonias de hiPSC deben comenzar a desprenderse después de 5 minutos, pero puede ser necesario un tiempo de incubación más largo con cultivos de hiPSC de mayor confluentidad. Si las colonias no se desprenden, aumente el tiempo de incubación hasta 10 minutos, pero no exceda este marco de tiempo.
9. Añadir 5 ml de medio de mantenimiento iPSC sin alimentador a las placas de Petri de 6 cm y resuspender suavemente las colonias 2x con una pipeta serológica de 10 ml o utilizando puntas de pipeta de gran calibre. Transfiera las células a un tubo de 15 ml.
   NOTA: las hiPSC son altamente sensibles al estrés mecánico; Por lo tanto, se debe evitar la resuspensión múltiple. La suspensión celular final debe consistir en pequeños fragmentos de colonia (50-200 μm).
10. Aspirar el sobrenadante de las placas de cultivo recubiertas y preparar 4 ml de medio de mantenimiento iPSC sin alimentador por plato de 6 cm.
11. Transfiera pequeños fragmentos de colonia a los platos de cultivo recién preparados en proporciones divididas de 1:10 a 1:40, y cultive a 37 °C y 5% de_CO2 con cambios diarios de medios.
    NOTA: Las colonias pequeñas deben adherirse dentro de 1 o 2 h después del paso.

Figura 1: Morfología de cultivos de células madre pluripotentes inducidos por humanos . (A,B) Cultivos de hiPSC de buena calidad de diferentes confluencias que muestran colonias compactas de hiPSC con una morfología homogénea y aristas definidas. (C) cultivo de hiPSC con grupos emergentes de células diferenciadas alrededor de los bordes de la colonia (línea blanca discontinua). Barra de escala = 200 μm. Abreviatura: hiPSC = célula madre pluripotente inducida por humanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Precultivo de hiPSCs en el sistema de biorreactor de sobremesa (día-2)

NOTA: Comience el precultivo cuando los cultivos hiPSC alcancen una confluencia entre 60% y 80%. Verifique las colonias de hiPSC para ver las áreas diferenciadas. Durante esta fase de precultivo, las hiPSC se mantienen en un medio de mantenimiento iPSC sin alimentador durante 2 días.

1. Preparar el medio de cultivo, que consiste en medio de mantenimiento iPSC sin alimentador e inhibidor ROCK de 10 μM (Y-27632).
2. Aspire el medio completamente de las hiPSC y enjuague suavemente las celdas con 1x DPBS (-/-) dos veces.
3. Añadir 2,0 ml de solución de tripsina-EDTA precalentada a las placas de Petri de 6 cm e incubar las células durante 3 min a 37 °C en la incubadora.
4. Golpee suavemente los platos para facilitar el desprendimiento de células, o incube durante 1-2 minutos más.
5. Resuspender las células en 5 ml de medio de mantenimiento iPSC sin alimentador + inhibidor ROCK por placa. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml o 50 ml y mezcle suavemente pipeteando para garantizar la singularización celular.
6. Determine el número de células en 100 μL de suspensión celular utilizando un contador de células automatizado como se describió anteriormente²⁰. Transfiera el volumen correspondiente para 15 × 10⁶ células por tubo de biorreactor a un tubo de 50 ml.
7. Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min.
8. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 2 ml de medio de mantenimiento iPSC libre de alimentador + inhibidor de ROCK.
9. Llene cada tubo de 50 ml con 18 ml de medio (densidad de siembra celular de 0,75 × 10⁶ células/ml). Dispensar la suspensión celular en los tubos del biorreactor (20 ml por tubo).
10. Coloque los tubos en el sistema del biorreactor. Establezca los siguientes parámetros de cultivo: período de rotación de 2 s, velocidad de rotación de 60 rpm, sin pausa de agitación, 37 °C y 5% de_CO2 para una duración ilimitada²⁰.
11. Inicie el programa de cultivo a través de la pantalla del biorreactor.
12. Cambie los medios al día siguiente. Deje que los agregados se asienten en los tubos del biorreactor durante ~ 5 min. Aspire cuidadosamente el sobrenadante.
    NOTA: No permita que los agregados se asienten durante más de 10 minutos, ya que podrían adherirse entre sí y crear una suspensión de agregados heterogéneos. Se recomienda dejar ~5 mL de medio de cultivo en el tubo del biorreactor.
13. Añadir 15 ml de medio de mantenimiento iPSC fresco sin alimentador sin inhibidor de ROCK por tubo, y continuar el cultivo en el biorreactor de sobremesa durante 24 h.

3. Diferenciación de hiPSCs en neuronas tempranas (día 0)

1. Preparar medio neurobasal (NBM): 50% DMEM/F-12 con L-alanil-L-glutamina dipéptido estabilizado, 50% medio neurobasal, 0.5x suplemento sin suero (50x), 0.5x suplemento sin suero basado en la formulación N-1 de Bottenstein (100x), 0.5x dipéptido estabilizado L-alanil-L-glutamina, solución de aminoácidos no esenciales 0.5x MEM (100x), piruvato de sodio 500 nM (100 mM), 50 nM 2-mercaptoetanol (50 mM), solución de insulina humana al 0.025% y 5 U/ml penicilina-estreptomicina.
   NOTA: NBM debe almacenarse a 4 °C y puede utilizarse hasta 2 semanas.
2. Comience la diferenciación neuronal agregando doxiciclina (DOX) a los cultivos de hiPSC. Para esto, deje que los agregados se asienten en los tubos del biorreactor. Aspire cuidadosamente el sobrenadante de las células, dejando ~ 5 ml en el tubo, y agregue 35 ml de medio de inducción neural (NIM) que consiste en NBM y 2 μg / ml DOX.
   NOTA: Como DOX es sensible a la luz, se recomienda apagar la luz mientras trabaja.
3. Coloque los tubos de nuevo en el biorreactor de sobremesa y continúe el cultivo.
4. Realice cambios de medios todos los días durante 2 días, como se describe en el paso 3.2.
   NOTA: Después de 4 días en cultivo en suspensión, los agregados pueden disociarse y las neuronas tempranas pueden criopreservarse o replatearse directamente para la maduración terminal.

4. Criopreservación de neuronas tempranas (día 2)

NOTA: La criopreservación no es necesaria y no es crítica para el proceso de diferenciación, pero es muy recomendable ya que se pueden producir y almacenar grandes reservas de neuronas tempranas para su posterior maduración y análisis.

1. Deje que los agregados se asienten en el tubo del biorreactor. Aspire el sobrenadante como se describió anteriormente.
2. Transfiera los agregados a un tubo estéril de 15 ml o 50 ml y enjuague suavemente los agregados 2x con 1x DPBS (-/-). Aspire cuidadosamente el sobrenadante tanto como sea posible sin alterar los agregados.
3. Añadir 2-5 ml de enzima de disociación celular precalentada, dependiendo del tamaño del pellet, e incubar las células durante aproximadamente 10 min a 37 °C en un baño maría. Resuspender suavemente los agregados sedimentados cada 2 min hasta que los agregados se disocien.
   NOTA: Se debe obtener una suspensión celular casi homogénea después de 7-10 minutos de incubación.
4. Agregue el triple volumen de medio NBM precalentado y resuspenda las células cuidadosamente para asegurar la singularización celular.
5. Determine el número de células y transfiera el volumen correspondiente para la criopreservación a un tubo de 15 ml o 50 ml.
   NOTA: Se recomienda una densidad celular de 5-10 × 10⁶ células/ml de medio de congelación.
6. Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min.
7. Aspire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular en el volumen correspondiente de medio de congelación que contenga 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
8. Alícuota la suspensión celular en viales adecuados para la criopreservación (1 mL/vial).
9. Transfiera los viales inmediatamente a un recipiente de congelación preenfriado de velocidad lenta lleno de 2-propanol y coloque el recipiente a -80 °C durante la noche. Colocar los viales a -150 °C al día siguiente para su almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: El líquido 2-Propanol es altamente inflamable y puede causar daño ocular al contacto. Manténgase alejado del calor y use guantes protectores, así como gafas.

5. Maduración de neuronas derivadas de hiPSC en cultivos monocapa

1. Preparar placas de cultivo recubiertas de poli-L-ornitina/laminina para el cultivo a largo plazo de neuronas derivadas de hiPSC.
   1. Diluir la solución madre de poli-L-ornitina al 0,001% en 1x DPBS (-/-) y cubrir los platos durante la noche a 4 °C, o durante 4 h a 37 °C. Aspire la solución de poli-L-ornitina y lave las placas una vez con 1x DPBS (-/-).
   2. Diluir la solución de laminina en 1x DPBS (-/-) hasta una concentración final de 10 μg/ml e incubar los platos durante la noche a 4 °C, o durante 4 h a 37 °C.
      NOTA: Se recomienda un volumen de 0.1-0.15 ml por cm 2 para los procedimientos de recubrimiento y 0.2 ml por cm² para todos los pasos de lavado respectivos. Se pueden utilizar sustratos de recubrimiento alternativos, pero se deben evaluar los efectos potenciales sobre la unión celular y la maduración.
2. Descongelar las células criopreservadas. Para ello, coloque el criovial en un baño maría (ajustado a 37 °C) y gírelo durante aproximadamente 1 min, hasta que quede un pequeño grupo de suspensión de células congeladas.
3. Transfiera cuidadosamente la suspensión celular gota a gota a un tubo de 15 ml preparado con 10 ml de NBM precalentado. Enjuague el criovial con 1 ml de NBM y transfiera la suspensión celular al tubo idéntico de 15 ml.
4. Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min.
5. Aspirar el sobrenadante y añadir 1-2 ml de NIM suplementado con 10 μM inhibidor de ROCK.
6. Resuspenda el pellet celular con cuidado y determine el número de células.
7. Aspirar la solución de laminina restante de las placas de cultivo celular recubiertas y sembrar las células a una densidad de siembra de 1 × 10⁵ células/^cm2 en NIM suplementado con un inhibidor ROCK de 10 μM.
8. Cambie el medio después de 24 h a NIM sin inhibidor de ROCK.
9. Realizar cambios medios diarios durante 4 días.
10. Después de esta fase inicial de inducción de NGN2, omitir el DOX y cultivar las células en NBM, con cambios de medio 2x a la semana hasta alcanzar la etapa de maduración deseada.
    NOTA: Se recomienda el cocultivo de neuronas iNGN2 con astrocitos para aumentar la supervivencia celular, la unión, la madurez y la actividad eléctrica^13,22.

6. Caracterización de neuronas derivadas de hiPSC

NOTA: La diferenciación en derivados neuronales puede evaluarse mediante las siguientes técnicas.

1. Inmunocitoquímica e imágenes
   1. Aspirar el medio de las neuronas derivadas de hiPSC y lavar las células una vez con 1x DPBS con Ca 2+ y Mg²⁺ (+/+).
      NOTA: Pipetear cuidadosamente, preferentemente en los bordes del pozo, ya que las células pueden desprenderse muy fácilmente de la superficie. Se recomienda un volumen de 0,2 ml por cm² para todos los pasos de lavado para garantizar una cobertura completa de las celdas con 1x DPBS (+/+).
   2. Fijar las células neuronales utilizando una solución de fijación que contenga paraformaldehído al 4% en DPBS (+/+) durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Se recomienda un volumen de 0,1 mL por^cm2 .
      NOTA: El paraformaldehído (4%) en DPBS es una solución peligrosa e irritante de la piel con toxicidad aguda y carcinogenicidad potencial. Manténgase alejado del calor, use guantes y anteojos protectores, evite la inhalación y use la solución solo en un ambiente ventilado.
   3. Enjuague suavemente las celdas 2 veces en 1x DPBS (+/+) y proceda con la tinción.
      NOTA: Las celdas fijas se pueden almacenar en DPBS (+/+) a 4 °C durante un máximo de 1 mes hasta su posterior procesamiento.
   4. Aspirar el DPBS (+/+) a partir de muestras. Permeabilizar las células y bloquear sitios de unión no específicos con 1x DPBS (+/+) que contiene 1% BSA y 0,2% Triton-X-100 durante 60 min en RT.
      NOTA: Se recomienda un volumen de 0,2 mL por^cm2 .
   5. Retirar el sobrenadante e incubar las células durante la noche a 4 °C, con los respectivos anticuerpos primarios diluidos en tampón de tinción (1x DPBS [+/+] que contiene 1% de BSA) (ver Tabla de materiales). Asegúrese de que las células estén completamente cubiertas por la solución.
      NOTA: Se recomienda un volumen de 0.1-0.15 mL por cm² .
   6. Aspire el tampón de tinción y enjuague las células 3 veces en 1x DPBS (+/+).
   7. Diluir los anticuerpos secundarios correspondientes (ver Tabla de materiales) en tampón de tinción a una concentración final de 1:1.000.
   8. Incubar las células en solución de anticuerpos diluidos durante 1 h a RT en la oscuridad. Asegúrese de que las células estén completamente cubiertas por la solución.
      NOTA: Se recomienda un volumen de 0.1-0.15 mL por cm² .
   9. Aspirar la solución de anticuerpos secundarios y enjuagar las células 2x en 1x DPBS (+/+).
   10. Contrarrestar la tinción de los núcleos con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), diluido en DPBS (+/+) durante 5 min a RT.
       NOTA: Se recomienda un volumen de trabajo de 0.1-0.15 mL por cm² .
   11. Enjuague las celdas 2 veces en 1x DPBS (+/+).
   12. Almacene las células en DPBS (+/+) a 4 °C hasta obtener imágenes.
       NOTA: Las imágenes de campo claro son adecuadas para rastrear los cambios morfológicos y el crecimiento de neuritas. Además, la expresión de marcadores estereotipados puede evaluarse mediante microscopía de fluorescencia. Mientras que las hiPSC indiferenciadas expresan OCT 3/4 y NANOG, la beta-III-tubulina (TUBB3) y la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2) pueden servir como marcadores neuronales para visualizar neuritas y axones. La red neurítica se puede evaluar aún más determinando la longitud de la neurita en imágenes de campo claro o fluorescentes.
2. Análisis de expresión génica mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)
   1. Aspire el medio y enjuague las células una vez en 1x DPBS (-/-).
      NOTA: Se recomienda un volumen de 0,2 mL por^cm2 .
   2. Agregue tampón de lisis de ARN frío y coseche las células rascando.
   3. Aísle el ARN utilizando un kit adecuado basado en columnas y determine las concentraciones de ARN mediante fotoespectrometría UV.
   4. Generar ADNc utilizando 250 ng de ARN total y un kit adecuado para la transcripción inversa.
   5. Preparar reacciones de qPCR de baliza molecular que contengan 2,5 ng de ADNc por duplicado. Utilice una mezcla maestra apropiada y los ensayos de imprimación correspondientes²⁰ (consulte la Tabla de materiales).
   6. Ejecutar la qPCR aplicando 45 ciclos con recocido de imprimación a 60 °C durante 20 s.
   7. Normalizar los niveles relativos de expresión génica a la media de los genes de mantenimiento GAPDH, HPRT1 y GUSB. Aplicar el método ΔΔCt²³, utilizando hiPSCs indiferenciadas como calibrador.

Durante los pasos iniciales, los cultivos adherentes de hiPSCs se separan, singularizan y transfieren a suspensión (Figura 2). Los agregados se forman en 24 h y crecen continuamente en tamaño. Después de 2 días de inducción transgénica, las neuronas tempranas pueden ser criopreservadas para experimentos posteriores.

La proliferación persistente durante los primeros días en suspensión produce un aumento en el número de células, alcanzando su pico después de 2 días de inducción (Figura 3A, B). Junto con la proliferación, los agregados comienzan a crecer. En comparación con el día 0, el diámetro muestra un aumento del 50% en el día 2, y casi se duplica en el día 5 (Figura 3D). Aunque un diámetro creciente limita el suministro de nutrientes dentro de los agregados, la viabilidad de las células no se ve afectada en el día 2 o en el día 5 de diferenciación (Figura 3C). Sin embargo, un cultivo prolongado durante más de 4 días en suspensión no mejora aún más el rendimiento celular, ya que los agregados se vuelven cada vez más resistentes a la singularización enzimática (Figura 3B).

Tras la criopreservación, las células del día 2 se descongelan y se colocan en platos recubiertos de poli-L-ornitina (PLO) laminina para su maduración terminal. En general, las células se adhieren muy bien después de la descongelación y comienzan a extender las neuritas desde el principio. El perfil de expresión génica temporal, así como la tinción inmunocitoquímica para los marcadores neuronales TUBB3 y MAP2, confirma la identidad celular neuronal (Figura 4A,B). Además del aumento de los niveles de TUBB3 y MAP2, los cultivos neuronales están enriquecidos en transcripciones de proteínas tau asociadas a microtúbulos (MAPT), que codifican una proteína neuronal implicada en la estabilización del axón, y muestran una disminución concomitante en la expresión del factor de transcripción regulador de la pluripotencia POU5F1. Además, se forma una densa red neurítica dentro de la primera semana después de la descongelación (Figura 4C). Estos cambios morfológicos, junto con el perfil transcripcional, sugieren una maduración creciente de los cultivos neuronales.

Figura 2: Generación de neuronas iNGN2 derivadas de hiPSC utilizando un biorreactor de sobremesa. (A) Visión general esquemática del paradigma de diferenciación, destacando los pasos clave del cultivo celular. (B-F) Las imágenes de campo claro visualizan (B) hiPSCs y (C,D) la formación de agregados en el biorreactor de sobremesa. (E,F) Las neuronas iNGN2 extienden las neuritas y sufren cambios morfológicos durante la diferenciación. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: BMM = matriz de membrana basal; iPSC-MM = medio de mantenimiento iPSC; PLO = poli-L-ornitina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Rendimiento celular y viabilidad durante la formación y el crecimiento agregado. (A) Las imágenes de campo claro muestran la formación de agregados dentro de los 2 días posteriores al cultivo en el biorreactor de sobremesa, así como el aumento en el tamaño del agregado con el tiempo. Barra de escala = 500 μm. (B) Cuantificación del rendimiento celular y (C) viabilidad sobre el curso de diferenciación. Los gráficos de barras representan la media + SD de cuatro experimentos independientes. (D) El diámetro, indicativo del tamaño de los agregados, se determinó semiautomáticamente utilizando el software de código abierto ImageJ (versión 1.53). Primero, las imágenes de campo claro se convirtieron en imágenes binarias y luego se evaluaron más a fondo utilizando la herramienta analizar partículas, aplicando los siguientes parámetros: tamaño > 2.500 μm2, circularidad 0.45-1, excluir bordes e incluir agujeros. Las líneas horizontales indican la media ± DE de cinco diferenciaciones independientes. Los puntos individuales representan la media de los experimentos de diferenciación individuales con al menos 20 agregados por punto de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Caracterización de neuronas iNGN2 derivadas de hiPSC. Perfil de expresión génica temporal para los genes neuronales TUBB3, MAP2 y MAPT, así como el gen pluripotente asociado a células madre POU5F1. Los niveles de expresión relativos se normalizaron a los genes de referencia GAPDH, HPRT1 y GUSB. Se eligieron hiPSC indiferenciadas (día-2) como calibrador. Los símbolos geométricos indican la media ± SD de cuatro diferenciaciones independientes. (B) Imágenes representativas de neuronas iNGN2 en el día 7 después de la descongelación (día-2 + 7), teñidas para beta-III-tubulina (TUBB3, magenta) y proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2, cian). Los núcleos celulares fueron teñidos con DAPI. Barras de escala = 100 μm. (C) Evaluación de la red neurítica en imágenes de campo claro de cultivos neuronales después de la descongelación. La longitud total de las neuritas se determinó en un área de 930,82 × 698,11μm2 utilizando ImageJ (versión 1.53). Después de ajustar el brillo y el contraste, las imágenes se convirtieron en imágenes de 8 bits y los colores se invirtieron. Las neuritas fueron posteriormente esqueletizadas y luego analizadas usando los plugins de ImageJ 'Skeletonize' y 'Analyze Skeleton', respectivamente. La longitud total de las neuritas se dividió por el número de somas en la región de interés para obtener la longitud / célula promedio de neurita. Los gráficos de barras representan la media + SD de tres experimentos independientes. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.