Vascularización eficiente de organoides renales mediante trasplante intracelomico en embriones de pollo

Se ha demostrado que los organoides renales derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) tienen potencial para estudios de desarrollo 1,2,3,4, detección de toxicidad ^5,6 y modelado de enfermedades^{5,7,8,9,10,11,12,13}. Sin embargo, su aplicabilidad para estos y eventuales propósitos de trasplante clínico está limitada por la falta de una red vascular. Durante el desarrollo del riñón embrionario, los podocitos, las células mesangiales y las células endoteliales vasculares (CE) interactúan para formar la intrincada estructura del glomérulo. Sin esta interacción, la barrera de filtración glomerular, constituida por podocitos, la membrana basal glomerular (GBM) y las CE, no puede desarrollarse adecuadamente^14,15,16. Aunque los organoides renales in vitro contienen algunos CE, estos no logran formar una red vascular adecuada y disminuyen con el tiempo¹⁷. Por lo tanto, no es sorprendente que los organoides permanezcan inmaduros. El trasplante en ratones induce vascularización y maduración de los organoides renales 18,19,20,21. Desafortunadamente, este es un proceso laborioso que no es adecuado para el análisis de un gran número de organoides.

Los embriones de pollo se han utilizado para estudiar la vascularización y el desarrollo durante más de un siglo²². Son de fácil acceso, requieren poco mantenimiento, carecen de un sistema inmunológico completamente funcional y pueden desarrollarse normalmente después de abrir la cáscara del huevo^23,24,25,26. El trasplante de organoides en su membrana corioalantoidea (CAM) ha demostrado conducir a la vascularización²⁷. Sin embargo, la duración del trasplante en el CAM, así como el nivel de maduración del injerto, están limitados por la formación de CAM, que tarda hasta el día 7 embrionario en completarse. Por lo tanto, recientemente se desarrolló un método para vascularizar eficientemente y madurar organoides renales a través del trasplante intracelómico en embriones de pollo²⁸. La cavidad celómica de los embriones de pollo ha sido conocida desde la década de 1930 por ser un ambiente favorable para la diferenciación de tejidos embrionarios^29,30. Se puede acceder a él temprano en el desarrollo embrionario y permite una expansión relativamente ilimitada del injerto en todas las direcciones.

Este documento describe un protocolo para el trasplante de organoides renales derivados de hiPSC en la cavidad celómica de embriones de pollo del día 4. Este método induce la vascularización y la maduración mejorada de los organoides en 8 días. La inyección de aglutinina culinaris (LCA) de lente marcada con fluorescencia antes de sacrificar los embriones permite la visualización de los vasos sanguíneos perfundidos dentro de los organoides a través de microscopía confocal.

De acuerdo con la ley holandesa, no se requería la aprobación del comité de bienestar animal para esta investigación.

1. Preparación de organoides renales derivados de hiPSC para trasplante

1. Diferenciar las hiPSCs a los organoides renales utilizando el protocolo desarrollado por Takasato et al.4,18,31. Cultivar los organoides siguiendo este protocolo en insertos de cultivo celular de poliéster con poros de 0,4 μm (insertos de cultivo celular) hasta el día 7 + 12 de diferenciación. Cada inserto de cultivo celular contendrá tres organoides.
2. Retire los organoides del inserto de cultivo celular.
   1. Haga un orificio en el medio de la membrana del inserto de cultivo celular con un par de pinzas de disección. Usando tijeras de disección, haga tres cortes en la membrana desde el orificio en el medio hasta el borde del inserto de cultivo celular, cortando entre los organoides. Esto dará como resultado tres piezas de membrana, cada una con un organoide unido, que todavía están conectadas al inserto de cultivo celular en su borde exterior.
   2. Agarre una de las piezas de membrana cerca de su borde exterior con un par de pinzas y suéltela del inserto de cultivo celular. Coloque el trozo de membrana con el organoide adjunto en una placa de Petri. Agregue unas gotas de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco sin calcio y magnesio (DPBS-^/-) al organoide para evitar la deshidratación. Repita para los otros dos organoides.
3. Divide los organoides sosteniendo su membrana en su lugar con pinzas y cortándolos por la mitad con una cuchilla de afeitar de acero inoxidable de doble filo (un organoide entero es demasiado grande para que el celom lo acomode en esta etapa de desarrollo). Empuje suavemente las dos mitades organoides de la membrana con un disector dura. Deseche la membrana y deje los organoides en DPBS-^/- hasta el trasplante.
   NOTA: Prepare un máximo de tres organoides a la vez para el trasplante para evitar el estrés de los organoides antes del trasplante. Idealmente, una persona prepara los organoides mientras otra realiza el trasplante.

2. Preparación de embriones de pollo para trasplante

1. Incubar huevos fertilizados de cuerno blanco. Iniciar la incubación de los huevos en el día 7 + 8 de diferenciación organoide renal para asegurar el momento correcto del trasplante.
   1. Coloque los huevos fertilizados de cuerno blanco (Gallus domesticus) horizontalmente sobre un soporte (Figura 1A; Día 0), marcando el centro del lado orientado hacia arriba con un lápiz.
      NOTA: Se pueden usar soportes de plástico hechos a medida o cartones de huevos como soportes para incubar los huevos.
   2. Colocar el soporte con los huevos en una incubadora humidificada a 38 ± 1 ºC (Figura 1A; día 0).
   3. Incubar los huevos durante 3 días, manteniendo la cuenca de agua en la incubadora llena.
2. Crea una ventana en la cáscara del huevo el día 3 de incubación.
   1. En el día 3 de la incubación, coloque un trozo pequeño (~1 cm x 0.5 cm) de cinta transparente en la punta puntiaguda del huevo (extremo pequeño). Haga un pequeño agujero en la cáscara del huevo en el medio de la cinta transparente golpeándola con el extremo afilado de un par de tijeras de disección.
   2. Inserte una aguja de 19 G en una jeringa de 5 ml en el orificio en un ángulo de 45°, evitando dañar el saco vitelino, y aspire 2-3 ml de albúmina del huevo para bajar el embrión dentro del huevo. Selle el orificio con una segunda pieza (~1 cm x 0,5 cm) de cinta transparente.
   3. Coloque un trozo grande (~ 5 cm x 5 cm) de cinta transparente en el lado del huevo marcado con el lápiz y mirando hacia arriba. Haga un agujero en la cáscara del huevo en el centro de la cinta transparente golpeándola con el extremo afilado de un par de tijeras de disección (Figura 1A; Día 3).
   4. A partir de este agujero, corte una pequeña ventana circular en la cáscara del huevo con tijeras curvas de disección. Mire a través de esta ventana para localizar el embrión, luego amplíe la ventana para optimizar el acceso al embrión (Figura 1A; Día 3).
   5. Retire cualquier trozo grande de cáscara de huevo que pueda haber caído encima del embrión con fórceps. Retire los trozos más pequeños colocando unas gotas de DPBS con calcio y magnesio (DPBS+/+) sobre el embrión con una pipeta de transferencia de plástico, luego aspirando el DPBS^+/+ con la cáscara del huevo en la pipeta.
   6. Agregue tres gotas de DPBS +/+ suplementado con penicilina ^/ estreptomicina al 0,5% al huevo usando una pipeta de transferencia de plástico.
   7. Selle cuidadosamente la ventana con un trozo grande (~5 cm x 5 cm) de cinta transparente antes de volver a colocar el huevo en la incubadora hasta el día 4 de incubación, cuando el embrión esté en la etapa 23-24 de Hamburger-Hamilton (HH 23-24)³².
      NOTA: Sellar la ventana es muy importante para evitar la deshidratación y la muerte del embrión.
   8. Verifique la viabilidad diaria de los embriones mirándolos a través de la cinta (no retire la cinta para evitar la deshidratación). Durante estos primeros días de incubación, el color de la yema de huevo cambia de amarillo brillante a amarillo mate tras la muerte del embrión. Deseche los embriones fallecidos.
   9. Mantenga el recipiente de agua en la incubadora lleno.

3. Trasplante intracelomico el día 4 de la incubación

1. Obtener acceso a la cavidad celómica
   1. Corte la cinta de la ventana con tijeras curvas de disección.
   2. Coloque el huevo bajo un microscopio de disección en un soporte de goma o cartón de huevo.
   3. El embrión de pollo está ahora en HH 23-24 y acostado sobre su lado izquierdo, con su lado derecho mirando hacia el espectador (Figura 1A; Día 4). Localice el ala derecha y el brote de la pierna del embrión, ya que se accederá al celom entre estos dos brotes de las extremidades. En el área entre el ala derecha y el brote de la pierna, cree una abertura consecutiva en la membrana vitelina, el corion y el amnios, sosteniéndolos con dos pares de pinzas de disección y tirando suavemente de ellos en direcciones opuestas.
      NOTA: La membrana vitelina es la primera membrana que se encuentra después de abrir el huevo, y en algunos casos, ya está dañada después de hacer la ventana en el día 3. Si el embrión está girado, acostado sobre su lado derecho con su lado izquierdo mirando hacia el espectador (Figura 1A; Día 4), es necesario darle la vuelta para permitir el trasplante. Para hacer esto, haga una abertura grande en la vitelina y la membrana del corion, luego gire cuidadosamente el embrión con fórceps.
   4. Compruebe si hay acceso sin obstrucciones a la cavidad celómica: agarre suavemente el borde de la pared del cuerpo entre el ala y el brote de la extremidad con un par de pinzas de disección y tire ligeramente hacia el espectador. La cavidad celómica debe ser claramente visible. Inserte cuidadosamente un instrumento romo pero delgado (por ejemplo, un alambre romo de tungsteno en un soporte de microbisturí) en la cavidad celómica.
      NOTA: Si la inserción del instrumento romo en la cavidad celómica no es posible, significa que una o más de las membranas no se han abierto correctamente.
2. Trasplante
   1. Coloque la mitad de un organoide dentro del huevo encima de la alantois usando un disector de duramadre.
   2. Usando pinzas de disección, agarre con cuidado el borde de la pared del cuerpo y tire de él ligeramente hacia el espectador para hacer visible la abertura del celom.
      NOTA: Evite dañar los vasos sanguíneos en la pared del cuerpo.
   3. Mueva suavemente el organoide hacia y a través de la abertura en la pared del cuerpo hacia el celom con un alambre romo de tungsteno en un soporte de microbisturí. Empuje el organoide ligeramente cranealmente para alojarlo dentro del celom. Ahora es visible justo detrás del brote del ala (Figura 1A; Día 4).
   4. Agregue tres gotas de DPBS^+/+ al huevo con una pipeta de transferencia de plástico.
   5. Selle cuidadosamente la ventana con un trozo grande (~5 cm x 5 cm) de cinta transparente antes de volver a colocar el huevo en la incubadora hasta el día 12 de incubación (8 días después del trasplante).
   6. Siga revisando la viabilidad diaria de los embriones mirándolos a través de la cinta (no retire la cinta para evitar la deshidratación). Deseche los embriones fallecidos.
      NOTA: A medida que los embriones y sus membranas corioalantoideas crecen, se vuelven más claramente visibles a través de la cinta. La falta de movimiento del embrión y los vasos sanguíneos colapsados o dispersos son un signo de muerte embrionaria.
   7. Revise el recipiente de agua en la incubadora diariamente y manténgalo lleno.

4. Inyección de lectina marcada con fluorescencia

1. Preparación para la inyección
   1. Haga agujas de microinyección de vidrio tirando de microcapilares de vidrio en un extractor de micropipetas con los siguientes ajustes: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Mientras mira a través del microscopio de disección, rompa cuidadosamente las puntas de las agujas de microinyección usando pinzas de disección para crear una abertura.
      NOTA: Los ajustes necesarios para el extractor de micropipetas pueden variar en función de la máquina.
   2. Montar el sistema de inyección. Tome dos piezas de tubo de silicona de 38 cm y conéctelas entre sí colocando un filtro de 0,2 μm entre ellas. Inserte una boquilla en el extremo del tubo que está conectado con la salida del filtro (tubo de silicona 1) y un conector en el extremo del tubo que está conectado con la entrada del filtro (tubo de silicona 2). Finalmente, inserte la aguja de microinyección en el conector (Figura 1B).
   3. Diluir la aglutinina culinaris (LCA) de la lente marcada con fluorescencia con DPBS-/- a una concentración de 2,5 mg ^mL-1 en un tubo de 0,5 ml y girar hacia abajo durante ~30 s en una microcentrífuga para mover los agregados al fondo del tubo.
   4. Pipetear 20 μL de ACV sobre un trozo de parafilm.
   5. Aspirar los 20 μL de LCA del parafilm en la aguja microcapilar del sistema de inyección ensamblado.
2. Inyección
   1. Corte la cinta de la ventana con tijeras curvas de disección. Coloque el huevo bajo un microscopio de disección en un soporte de goma.
   2. Evalúe la vasculatura y localice las venas, que se pueden distinguir de las arterias por su color rojo ligeramente más brillante (Figura 1A; Día 12). Para mejorar el acceso a la vasculatura, amplíe cuidadosamente la ventana cortando con tijeras de disección curvas. Seleccione una vena para inyección según la accesibilidad y el tamaño.
   3. Inserte la punta de la aguja microcapilar en la vena seleccionada en un ángulo de 0°-20º. Asegúrese de que la aguja esté en la vena moviendo suavemente la punta de lado a lado. Sople suave y constantemente en el sistema de inyección para inyectar el LCA (Figura 1A; Día 12).
      NOTA: Si la aguja en la vena está en la posición correcta, debe permanecer dentro de los límites de la vena.
   4. Coloque el huevo de nuevo en la incubadora durante 10 minutos para permitir que circule el ACV.
      NOTA: No es necesario sellar el huevo con cinta adhesiva durante este tiempo.

5. Recolección de organoides trasplantados el día 12 de incubación

1. Sacrificando el embrión de pollo
   1. Coloque el huevo en un soporte de goma en el banco. Corte la cinta de la ventana con tijeras curvas de disección. Luego, corte a través de las membranas que rodean el embrión con tijeras de disección curvas.
      NOTA: No se requiere un microscopio de disección para este paso.
   2. Recoge el embrión del huevo con una cuchara perforada e inmediatamente decapita el embrión con unas tijeras. Coloque el cuerpo del embrión en una placa de Petri bajo el microscopio de disección.
2. Localización y recolección de organoides
   1. Coloque el embrión boca arriba en la placa de Petri y extienda sus extremidades.
   2. Abra cuidadosamente la pared abdominal del embrión a lo largo del eje longitudinal con fórceps.
   3. Localiza el organoide dentro del embrión. El organoide se adhiere con mayor frecuencia al lóbulo hepático derecho, ya sea en la punta caudal o cranealmente justo debajo de la caja torácica (Figura 1A; Día 12). Por lo tanto, se recomienda comenzar buscando en estos lugares.
   4. Una vez localizado el organoide, retíralo del embrión cortándolo alrededor con micro tijeras. Coloque el organoide y el tejido de pollo que inevitablemente está unido a él en una placa de Petri bajo el microscopio de disección. Retire la mayor cantidad posible de tejido de pollo con una cuchilla de afeitar de acero inoxidable de doble filo.
   5. Procesa el organoide dependiendo del análisis deseado.

6. Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo

1. Colocar un organoide trasplantado en una placa de 24 pocillos y fijar 500 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) a 4 °C durante 24 h. Lavar 3x con DPBS-^/-.
2. Permeabilizar y bloquear el organoide en 300 μL de solución bloqueante (0,3% Triton-X en DPBS^-/- que contiene 10% de suero de burro) durante 2 h a temperatura ambiente.
3. Preparar la mezcla primaria de anticuerpos: para un organoide, anticuerpos primarios diluidos NPHS1 (ovejas-α-humanos, dilución de 1:100), CD31 (ratón-α-humano, dilución de 1:100) y LTL (biotina-conjugada, dilución de 1:300) en 300 μL de solución de bloqueo. Añadir la mezcla de anticuerpos al organoide e incubar durante 72 h a 4 °C.
4. Lavar 3x con TritonX al 0,3% en DPBS-^/-.
5. Preparar la mezcla secundaria de anticuerpos: para un organoide, anticuerpos secundarios diluidos burro-α-oveja Alexa Fluor 647 (dilución de 1:500), burro-α-ratón Alexa Fluor 488 (dilución de 1:500) y estreptavidina Alexa Fluor 405 (dilución de 1:200) en 300 μL de solución de bloqueo. Añadir la mezcla de anticuerpos secundarios al organoide e incubar durante 2-4 h a temperatura ambiente. Cubra con papel de aluminio para evitar la exposición de los anticuerpos secundarios a la luz.
6. Lavar 3x con DPBS-^/-.
7. Incruste el organoide en ~30 μL de medio de montaje en un plato con fondo de vidrio de 35 mm y deje secar durante la noche a temperatura ambiente, cubierto con papel de aluminio. Conservar a 4 °C.
8. Imagen con un microscopio confocal.

El método y la línea de tiempo para la diferenciación de hiPSCs a organoides renales, la incubación de huevos de gallina fertilizados, el trasplante de organoides renales, la inyección de LCA y la recolección de los organoides se resumen en la Figura 1A. Es importante coordinar el momento de la diferenciación de organoides y la incubación del huevo de gallina, comenzando la diferenciación 15 días antes de la incubación. Las acciones en los días 0, 3, 4 y 12 de incubación se ilustran con fotografías debajo de la línea de tiempo. Los organoides se trasplantan en el día 7 + 12 de diferenciación en embriones de pollo del día 4 (HH 23-24). La LCA se inyecta en el sistema venoso del embrión 8 días después del trasplante para teñir la vasculatura perfundida, antes de sacrificar el embrión y recuperar el organoide. El sistema de inyección ensamblado se muestra en la Figura 1B.

Los embriones de pollo se sacrifican en el día 12 de incubación (Figura 1A). Tras una disección cuidadosa del embrión, el organoide trasplantado generalmente se puede encontrar unido al hígado. Mirando a través de un microscopio de disección, aparece vascularizado (Figura 1A; día 12; paso 5.2.3). La imagen confocal de organoides trasplantados inyectados con LCA y teñidos para estructuras de nefronas y CE humanas confirma la vascularización por vasos sanguíneos perfundidos (Figura 2A), que también invaden estructuras glomerulares (Figura 2B). La vasculatura es quimérica: se pueden distinguir CE humanas perfundidas (CD31+, LCA+), CE humanas no perfundidas (CD31+, LCA-) y CE derivadas de pollos perfundidas (CD31-, LCA+) (Figura 2A, paneles III, IV, V).

Figura 1: Método de trasplante intracémico . (A) Cronología de la diferenciación de hiPSCs a organoides renales, incubación de huevos de gallina fertilizados y trasplante intracelómico de organoides renales. La diferenciación de hiPSCs a organoides renales se inicia 15 días antes de que se inicie la incubación de los huevos de gallina (diferenciación día 0 = día de incubación -15) para permitir el trasplante de los organoides renales en el día 7 + 12 de diferenciación en embriones de pollo en el día 4 de incubación. Días de incubación: Día 0: Los huevos de gallina fertilizados se colocan horizontalmente sobre soportes (paso 2.1.1), que se colocan en una incubadora a 38 ºC ± 1 °C (paso de protocolo 2.1.2). Día 3: Se crea una ventana en cada huevo haciendo un pequeño agujero en el lado orientado hacia arriba del huevo con el extremo afilado de un par de tijeras curvas de disección (paso 2.2.3) y cortando una ventana circular a partir de este agujero (paso 2.2.4). La ventana se sella con cinta transparente antes de volver a colocar el huevo en la incubadora. Día 4: Se realiza el trasplante intracelómico de organoides renales en el día 7 + 12 de diferenciación. El embrión está en HH 23-24 y acostado sobre su lado izquierdo, con su lado derecho mirando hacia el espectador (paso 3.1.3). Entre el ala y el brote de la pata, se hace una abertura en la membrana vitelina, el corion y el amnios para obtener acceso a la cavidad celómica, y el organoide se inserta a través de estas aberturas en el celom. Después del trasplante, el organoide es visible como una estructura blanca ubicada justo detrás del brote del ala. Los bordes de las membranas vitelina y amnios abiertas son visibles (pasos 3.2.3 y 3.2.3-Zoom). En algunos casos, los embriones se rotan, acostados sobre su lado derecho en lugar de izquierdo (3.1.3 NOTA), y deben darse la vuelta antes del trasplante. Día 12: La lectina marcada con fluorescencia se inyecta por vía intravenosa. Las venas se distinguen de las arterias por su color; la sangre en las venas es rica en oxígeno, proveniente de la CAM, por lo que son de un rojo ligeramente más brillante que las arterias que provienen del embrión (pasos 4.2.2., 4.2.2-Zoom y 4.2.3.). El embrión es sacrificado y el organoide recuperado. El organoide (en círculo) se ha adherido al hígado de pollo y parece vascularizado (paso 5.2.3). Barra de escala = 1 mm. La imagen esquemática que representa la imagen de trasplante intracelomico en el panel superior fue reimpresa con permiso de Koning et al.28. (B) Imagen del sistema de inyección ensamblado, que consiste en una boquilla, dos piezas de tubo de silicona de 38 cm, un filtro de 0,2 μm, un conector y una aguja de microinyección de vidrio que se generó tirando de microcapilares de vidrio en un extractor de micropipetas. Abreviaturas: A = alantois; Am = amnios; C = celom; CC = corte de la membrana del corión; CHIR = CHIR99021; FGF9 = factor de crecimiento de fibroblastos 9; hiPSCs = células madre pluripotentes inducidas humanas; IM = mesodermo intermedio; Lb = brote de la pierna; O = organoide; PS = racha primitiva; U = anillo umbilical; V = membrana vitelina; Wb = brote de ala; Y = tallo de yema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Organoides renales trasplantados vascularizados . (A) Imágenes inmunofluorescentes de (I) un organoide renal no trasplantado y (II) un organoide renal trasplantado. En ambas condiciones, las estructuras glomerulares (NPHS1+, cian) y tubulares (LTL+, amarillo) son visibles. En los organoides no trasplantados, algunos CE humanos (CD31+, verde) están presentes. En el organoide trasplantado, una red vascular perfundida (CD31+, verde; LCA+ marcada con rodamina inyectada, blanco) es visible en todo el organoide. En los paneles III, IV y V, se muestran los aumentos de las áreas en caja en el panel II, para demostrar los tres tipos de CE que se pueden distinguir en los organoides trasplantados. El Panel III contiene CE humanas perfundidas (CD31+, LCA+), marcadas con puntas de flecha. El Panel IV contiene CE humanas no perfundidas (CD31+, LCA-), marcadas con puntas de flecha. El Panel V contiene CE derivadas de pollo perfundidas (CD31-, LCA+), marcadas con puntas de flecha. Barra de escala = 200 μm. (B) En los organoides no trasplantados (I), las CE (CD31+, verde) rodean las estructuras glomerulares (NPHS1+, cian) pero no las invaden. En los organoides trasplantados (II), las estructuras glomerulares (NPHS1+, azul) son vascularizadas por capilares perfundidos (LCA+, blanco; CD31+, verde). Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.