Mediciones contráctiles de alto rendimiento de fibras musculares intactas de ratón incrustadas en hidrogel utilizando un sistema basado en óptica

Resumen

La función del músculo esquelético se puede evaluar cuantificando la contractilidad de las fibras musculares aisladas, tradicionalmente utilizando enfoques laboriosos y de bajo rendimiento. Aquí, describimos un método de alto rendimiento basado en la óptica para cuantificar la contractilidad de las fibras musculares incrustadas en hidrogel. Este enfoque tiene aplicaciones para la detección de fármacos y el desarrollo terapéutico.

Resumen

El cultivo celular in vitro es una herramienta poderosa para evaluar los procesos celulares y probar estrategias terapéuticas. Para el músculo esquelético, los enfoques más comunes implican diferenciar las células progenitoras miogénicas en miotubos inmaduros o el cultivo ex vivo a corto plazo de fibras musculares individuales aisladas. Un beneficio clave del cultivo ex vivo in vitro es la retención de la compleja arquitectura celular y las características contráctiles. Aquí, detallamos un protocolo experimental para el aislamiento de fibras musculares flexoras digitorum brevis intactas de ratones y su posterior cultivo ex vivo . En este protocolo, las fibras musculares están incrustadas en un hidrogel de matriz de membrana basal y a base de fibrina para inmovilizar las fibras y mantener su función contráctil. Luego describimos métodos para evaluar la función contráctil de la fibra muscular utilizando un sistema de contractilidad de alto rendimiento basado en óptica. Las fibras musculares incrustadas se estimulan eléctricamente para inducir contracciones, después de lo cual sus propiedades funcionales, como el acortamiento del sarcómero y la velocidad contráctil, se evalúan utilizando cuantificación basada en la óptica. El acoplamiento del cultivo de fibras musculares con este sistema permite realizar pruebas de alto rendimiento de los efectos de los agentes farmacológicos sobre la función contráctil y estudios ex vivo de trastornos musculares genéticos. Finalmente, este protocolo también se puede adaptar para estudiar procesos celulares dinámicos en fibras musculares utilizando microscopía de células vivas.

Introducción

Los avances en las técnicas de cultivo celular in vitro han abierto nuevas posibilidades para estudiar las capacidades regenerativas de los tejidos, los mecanismos celulares fisiopatológicos y las estrategias terapéuticas posteriores, todo ello utilizando tejidos de mamíferos en condiciones bien controladas ^1,2,3. El uso de sistemas de cultivo in vitro está bien establecido dentro del campo de la investigación muscular ^4,5. En general, se utilizan miotubos inmaduros diferenciados in vitro a partir de células progenitoras miogénicas 2,6,7,8. Aunque se ha avanzado en el protocolo de diferenciación para generar fibras musculares más maduras⁹, su inmadurez aún limita la traducción de los hallazgos a un ajuste in vivo ^1,10. Un tema central en el campo de la biología muscular es la incapacidad de los miotubos diferenciados in vitro para personificar completamente las complejas estructuras intracelulares, los procesos de señalización celular y las interacciones extracelulares observadas en el tejido muscular nativo y, lo que es más importante, recapitular las fuerzas contráctiles producidas por las fibras musculares 1,2,10,11,12 . Además, la contracción descoordinada de los miotubos durante el proceso de diferenciación a menudo resulta en un desprendimiento espontáneo de las placas de cultivo, lo que hace que la evaluación contráctil de los miotubos diferenciados in vitro sea desafiante y restringida a la evaluación cualitativa o semicuantitativa 8,11,12,13. Estas limitaciones a menudo requieren experimentos regulares in vivo con animales, particularmente si la contractilidad muscular es un resultado experimental primario¹.

Una alternativa al cultivo in vitro diferenciado es el cultivo ex vivo de fibras musculares maduras aisladas ^1,14. Durante el cultivo ex vivo, el tejido muscular maduro en desarrollo se extirpa del cuerpo, seguido de aislamiento unicelular para el cultivo en condiciones de laboratorio ^1,14. Las fibras musculares maduras aisladas mantienen sus complejas estructuras celulares observadas dentro del tejido nativo^14,15, y este método abre la posibilidad de intervenciones directas, como la manipulación genética y el tamizaje de drogas^, en un ambiente de cultivo bien definido y controlable. Uno de los primeros informes sobre el aislamiento de la fibra muscular esquelética y el cultivo ex vivo se remonta a la década de 1930; Sin embargo, el rendimiento de fibras viables de este protocolo fue bajo¹⁶. Con la optimización continua del procedimiento de aislamiento y las condiciones de cultivo, ahora es posible una mejora significativa en la cantidad de fibras musculares viables y funcionales 14,15,17,18,19. Una de esas mejoras en las condiciones de cultivo consiste en recubrir las placas de cultivo con proteínas de matriz extracelular para promover la adhesión de las fibras musculares aisladas en la placa de cultivo^15,18,20. Por lo general, se utiliza el recubrimiento de laminina, ya que la laminina es uno de los elementos más abundantes dentro de la matriz extracelular de los músculos^20,21. La optimización del procedimiento de aislamiento combinada con el recubrimiento de las placas de cultivo han permitido al campo de investigación muscular mantener fibras musculares viables aisladas con arquitectura celular intacta y funcionalidad contráctil en cultivo por cortos períodos de tiempo 1,15,18,22.

El enfoque más convencional utilizado dentro del campo muscular para medir la fuerza y las capacidades contráctiles es montar fibras musculares individuales entre un motor conductor de longitud y un transductor de fuerza^23,24. En general, las fibras musculares utilizadas para estas configuraciones motoras se diseccionan a partir de tejido fresco o ultracongelado, seguido de permeabilización o "despellejamiento", lo que permite la activación externa del calcio, donde se utilizan concentraciones variables de calcio para inducir la contracción de la fibra muscular²⁴. Si bien este método es el estándar de oro para las mediciones contráctiles de fibras musculares, solo se puede medir una fibra muscular a la vez, lo que hace que esta técnica sea un procedimiento laborioso y lento²⁵. Además, el procedimiento de aislamiento y desollamiento de las fibras musculares interrumpe las diversas estructuras involucradas en el acoplamiento excitación-contracción (es decir, la liberación de calcio y la posterior recaptación en el retículo sarcoplásmico), lo que no permite el estudio de la cinética de relajación y cualquier enfermedad que pueda afectar este proceso^26,27. Una alternativa a la preparación de fibras peladas es el uso de disección mecánica para aislar fibras musculares intactas, donde las fuerzas contráctiles pueden ser medidas en respuesta a la activación eléctrica²⁸; Sin embargo, este enfoque es técnicamente desafiante y requiere mucho tiempo, lo que resulta en mediciones de bajo rendimiento. Por último, tanto en preparaciones peladas como intactas, las células musculares son completamente eliminadas del ambiente extracelular durante las mediciones contráctiles 24, haciendo imposible la investigación del efecto de la composición/rigidez de la matriz extracelular sobre la contracción de la fibra muscular²⁴. Como resultado, se necesita el desarrollo de métodos alternativos para permitir mediciones de contractilidad de fibras musculares intactas aisladas de una manera de alto rendimiento mientras se recrea la conexión entre las fibras musculares y la matriz extracelular.

Recientemente, se desarrolló un nuevo enfoque basado en la óptica para mediciones de contractilidad de fibras musculares de alto rendimiento²⁹. Este sistema basado en óptica mide la periodicidad de los sarcómeros para evaluar la longitud del sarcómero durante la contracción utilizando imágenes de alta velocidad. Dentro de este sistema, las células permanecen en su lugar en la placa de cultivo mientras se mueve la óptica, minimizando así el tiempo necesario entre las mediciones de múltiples células²⁹. Una ventaja importante de utilizar este enfoque de alto rendimiento basado en la óptica es que permite desarrollar condiciones de cultivo similares a las del tejido nativo. Un enfoque utilizado para imitar las condiciones nativas in vivo es incrustar células en hidrogeles³⁰. Típicamente, un hidrogel es un material viscoelástico capaz de mantener su volumen y forma, y los hidrogeles tienen las propiedades de los materiales sólidos y líquidos³¹. La parte sólida consiste en cadenas de polímero entrelazadas entre sí, creando una estructura que se parece a un^30,31 neto. Las propiedades materiales de los hidrogeles se pueden ajustar para imitar la deposición de la matriz de los músculos^30,31. Por lo tanto, la combinación de un sistema de alto rendimiento basado en la óptica con células incrustadas en hidrogeles abre nuevas posibilidades para evaluar los efectos de la composición de la matriz extracelular y las propiedades mecánicas en la funcionalidad de la fibra muscular.

El objetivo general de este trabajo es 1) describir la metodología para el aislamiento enzimático y el cultivo ex vivo de fibras musculares en condiciones que imitan el entorno tisular nativo y 2) evaluar la contractilidad de la fibra muscular utilizando un enfoque de alto rendimiento. Describimos una metodología detallada para aislar fácilmente un gran número de fibras musculares individuales del músculo flexor digitorum brevis (FDB) utilizando la digestión enzimática. Además, describimos una técnica para incrustar las fibras musculares aisladas en un hidrogel a base de fibrina con el fin de imitar el entorno nativo de los músculos y mejorar la viabilidad y contractilidad de la fibra muscular. Luego describimos un método de alto rendimiento para medir las contracciones de fibras musculares vivas in vitro utilizando este sistema recientemente desarrollado. Una ventaja adicional de este procedimiento de incrustación es la inmovilización de fibras durante la contracción, lo que puede mejorar la relación señal-ruido de estas mediciones. Este método de incrustación en gel es aplicable tanto para procedimientos de encapsulación de polímero único como de gel compuesto, lo que facilita la evaluación de los efectos de la composición de la matriz extracelular en la contractilidad de la fibra muscular.

Protocolo

Para los estudios de contracción ex vivo , se obtuvo tejido post mortem de animales sacrificados para otros proyectos de investigación aprobados y / o excedentes de cría de la Universidad VU de acuerdo con la Directiva del Consejo Europeo (2010/63 / UE) con permiso de la Ley de Investigación Animal de los Países Bajos.

1. Preparación del material

1. Prepare pipetas para trituración (almacene etanol al 70% en un gabinete de flujo hasta su uso). Corte los extremos de dos puntas P1,000 para crear diferentes tamaños de agujeros; Asegúrese de que el orificio sea lo suficientemente grande como para que el músculo pase sin bloquear la pipeta. Pase los extremos cortados a través de una llama para que se vuelvan suaves.
2. Prepare platos Sylgard como se describe en otra parte³², y esterilice con etanol al 70% por adelantado para usarlo en la sujeción de la pata y el músculo durante el aislamiento.
   NOTA: Los platos Sylgard se pueden reutilizar después de una limpieza a fondo con agua desionizada y etanol al 70%.
3. Prepare las siguientes soluciones antes del procedimiento de aislamiento: medio de disección, medio de cultivo de fibrina y medio de digestión muscular (ver Tabla 1).
   NOTA: El medio de digestión muscular debe ser esterilizado por filtro utilizando un filtro de 0,22 μm. Todas las soluciones preparadas deben equilibrarse en una incubadora de cultivo celular estándar a 37 °C y 5% de CO2 durante al menos 30 minutos antes de su uso.
4. Después de la digestión muscular, prepare las siguientes soluciones para fundir el hidrogel: mezcla celular y mezcla de matriz (ver Tabla 2). Combine la mezcla celular y la mezcla de matriz en una proporción de 1: 1 para una concentración final de fibrina de 2.5 mg / ml.
   NOTA: Prepare la matriz en hielo y utilice puntas de pipeta preenfriadas para evitar la polimerización prematura de la matriz de la membrana basal. La relación trombina:fibrinógeno de 1:10 (unidades por mg de fibrinógeno) utilizada aquí se ha optimizado para un tiempo de polimerización de 30 min. Si el gel polimeriza dentro de los 30 minutos, se debe usar una concentración de trombina más baja. Consulte la discusión para obtener más información.

2. Disección muscular FDB

1. Eutanasia al ratón por luxación cervical. Desinfecte la extremidad posterior con alcohol al 70%.
2. Corte la pata trasera inferior por encima del tobillo. Corte la piel abierta en el lado dorsal del pie hacia los dedos de los pies.
   NOTA: Corte la parte inferior de la pierna trasera en la articulación del tobillo para evitar daños a los músculos de las extremidades inferiores y la tibia si son necesarios más adelante.
3. Pelar cuidadosamente la piel hacia los dedos de los pies. Tenga cuidado de no dañar el músculo. La FDB es el músculo más superficial en el lado ventral del pie.
4. Colocar el pie disecado en una placa Sylgard con 10 ml de medio de disección precalentado a 37 °C. Fije el pie a través de la piel que todavía está unida a los dedos de los pies y fije la parte inferior de la pierna más allá del tobillo.
5. Retire con cuidado el tejido conectivo en la parte superior del músculo. Corte el tendón en el talón y levante el músculo por su tendón.
6. Corte junto y debajo del músculo a través del tejido conectivo. Siga cortando hasta que los tendones del dedo del pie estén expuestos.
7. Cuando la mitad de la longitud de los tres tendones estén expuestos, corte los tendones y libere el músculo del pie. OPCIONAL: Recorte el cuarto tendón lateral y sus fibras musculares.
8. Limpie el tejido conectivo del músculo y transfiéralo a un tubo que contenga medio de disección precalentado.

3. Digestión muscular FDB

1. Preparar el medio de digestión muscular de acuerdo con la Tabla 1.
2. Transfiera los músculos FDB al medio de digestión muscular utilizando una pipeta serológica. Incubar en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y 5% de_CO2 durante 80 min.
   NOTA: Este tiempo debe optimizarse para cada lote de colagenasa. La digestión se completa cuando el músculo comienza a deshilacharse y se ve agrandado. Vea la discusión para la optimización del tiempo de digestión.
3. Después de la digestión, transfiera el músculo a un tubo de 15 ml que contenga 3 ml de medio de disección e incube durante 30 minutos antes de la trituración.

4. Trituración muscular FDB y sedimentación por gravedad

1. Triturar el músculo utilizando las puntas de trituración previamente preparadas (paso 1.1) pipeteando el músculo, pasando del tamaño más grande al más pequeño. Si este paso dura más de 5 minutos, coloque el músculo en la incubadora durante 5 minutos para permitir que descanse.
2. Triture hasta que las fibras musculares se hayan desprendido en su mayoría del tendón y el tendón pueda pasar a través de una punta P200. Retire los tendones.
3. Agregue las fibras FDB disociadas a un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de medio de disección y permita que las fibras se asienten en la incubadora durante 20 minutos. Observe el pellet formado.
4. Opcional: Retire 10 ml de medio de la parte superior y repita el paso 4.3. Este paso facilita la eliminación del exceso de residuos y las células mononucleadas asociadas.

5. Incrustación de fibra FDB

1. Retire con cuidado todo el medio de la parte superior del pellet de fibra. Resuspender las células en 875 μL de mezcla celular por músculo FDB (en hielo).
   NOTA: Un músculo FDB produce suficientes fibras para siete pocillos de una placa de 24 pocillos. Esta densidad se puede ajustar de acuerdo con las necesidades del experimento. El siguiente volumen de gel (250 μL) está optimizado para un formato de 24 pocillos, pero se puede escalar en consecuencia para otros formatos.
2. Alícuota 125 μL de la mezcla celular en tubos de microcentrífuga individuales.
3. Un pocillo a la vez, añadir 125 μL de mezcla de matriz a una alícuota de suspensión celular, y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo con cuidado, evitando la formación de burbujas.
4. Transfiera inmediatamente la mezcla final a un pozo.
   NOTA: Asegúrese de pipetear la mezcla en el centro del pozo. Repita los pasos 5.3 y 5.4 para cada pocillo.
5. Solidificar los geles en una incubadora durante 30-45 min. Después de la solidificación, agregue cuidadosamente el medio de cultivo a los pocillos.
   NOTA: El pipeteo rápido puede separar el hidrogel del pozo. A partir de este momento, las fibras pueden ser estimuladas y medidas. Sin embargo, en nuestra experiencia, dejar que las fibras se ajusten a las condiciones de cultivo durante 24 h puede mejorar la contractilidad de la fibra.
6. Para un cultivo más largo, reponga el medio de cultivo con medio cambio cada 2 días. Para hacer esto, retire la mitad del medio de cultivo y reemplácelo con una cantidad igual de medio fresco.

6. Mediciones contráctiles basadas en óptica

1. Encienda el sistema de medición contráctil basado en óptica (consulte la Tabla de materiales), la lámpara de fluorescencia, el marcapasos de celda eléctrica y la computadora. Ajuste el estimulador eléctrico a 1.0 Hz, 10.0 V y una duración de pulso de 5.00 ms para estimular las fibras musculares aisladas.
2. Inserte la placa en el sistema de medición. Conecte el marcapasos al inserto de ritmo e insértelo en la placa de cultivo.
3. Abra el programa IonWizard, y abra un nuevo archivo haciendo clic en Archivo (parte superior izquierda de la pantalla) | Nuevo.
4. Compruebe si el programa está en el experimento correcto, Skeletal Sarcomere, haciendo clic en Nuevo | Recopilar experimento. Para cambiar el experimento, haga clic en el experimento deseado y presione agregar. Para el experimento del sarcómero esquelético , aplique los siguientes ajustes: Sarc 20x, líneas promedio, FFT simple, frecuencia de muestreo de 250 Hz y un tiempo de adquisición de 10 s.
   NOTA: Los ajustes experimentales deben prepararse antes del experimento. La configuración se puede ajustar a las necesidades del experimento.
5. Ajuste la temperatura del sistema de medición a 25 °C. Haga clic en abrir el buscador de celdas debajo de la barra de herramientas y espere a que aparezca una nueva pantalla. En la parte superior derecha de esta pantalla, seleccione el tipo de placa y los pozos activos.
   NOTA: Las mediciones se realizan a 25 °C para reducir la velocidad de contracción de las fibras musculares FDB de contracción rápida, evitando así el submuestreo del evento contráctil.
6. Enfoca las fibras ajustando la barra deslizante de enfoque. Como alternativa, utilice la tecla W y la tecla S para esta función de enfoque.
7. Habilite el ritmo para iniciar la estimulación eléctrica. Observe que las fibras ahora comienzan a temblar.
   NOTA: Si no hay fibras temblando, asegúrese de que todos los cables estén conectados y que el marcapasos esté completamente sumergido. Si después de esto todavía no hay movimiento, las fibras pueden no estar respondiendo debido a la digestión excesiva o daño excesivo durante la trituración.
8. Enfoque el área de medición en el extremo de una fibra de tal manera que los sarcómeros corran verticalmente. Asegúrese de que los sarcómeros estén enfocados. Si los sarcómeros están enfocados, un solo pico es visible en la barra de herramientas. Durante la contracción, este pico se moverá hacia la derecha a medida que el sarcómero se acorta.
   NOTA: El área de medición púrpura se puede ajustar antes de comenzar el experimento. Para garantizar una medición adecuada, incluya ~ 20 sarcómeros. Si este pico cambia de forma durante la contracción, esto puede indicar que el sarcómero está oscurecido o desenfocado durante la contracción, lo que introduce ruido.
9. Inicie el experimento haciendo clic en iniciar en la barra de herramientas. Presione la tecla Q para iniciar una medición y espere a que el programa mida 10 transitorios de contracción. Si más de cuatro transitorios parecen libres de ruido, acepte la medición presionando la tecla Z . Si los transitorios tienen demasiado ruido, rechace la medición pulsando la tecla X .
10. Mida entre 10 fibras y 20 fibras por condición. Se conservan las ubicaciones de las fibras medidas previamente.
11. Opcional: Agregue compuestos, después de lo cual las fibras se pueden volver a medir en este punto.
12. Cuando finalice el experimento, presione el botón de parada en la barra de herramientas inferior para cerrar la ventana del buscador de celdas. Guarde el archivo e inicie uno nuevo.
13. Para analizar los datos, abra el programa "Cytosolver desktop". Haga clic en importar y seleccione los archivos que desea analizar.
14. Una vez que el programa haya terminado el análisis, busque picos azules, rojos y grises. Los picos azules son transitorios que son aceptados por el programa. Los picos rojos son transitorios que son rechazados por el programa, y los picos grises son transitorios rechazados por el usuario.
    NOTA: Los criterios de rechazo se pueden ajustar en el software de análisis. En general, los valores se rechazan si exceden un límite máximo de derivados, y los transitorios se rechazan en función de los valores de ajuste de curva R² de <0,95.
15. Haga clic en exportar. Marque las siguientes casillas: Promediar datos transitorios y exportar a Excel.
16. Cuando termine, apague todas las máquinas. Saque la placa de cultivo y deséchela. Limpie los electrodos marcapasos con agua desionizada y etanol al 70%.

Resultados

Usando este protocolo, las fibras musculares FDB individuales se aislaron e incrustaron en hidrogel. Una descripción general del procedimiento de disección muscular se muestra en la Figura 1. El músculo FDB está expuesto con tendones intactos y se desprende de la fascia. El mantenimiento de los tendones de los músculos como puntos de fijación minimiza el daño potencial a las fibras musculares durante el procedimiento de aislamiento. El exceso de tejido conectivo se puede recortar para reducir los desechos y el crecimiento de tipos de células secundarias. Una vez que el músculo ha sido extirpado y limpiado lo suficiente, el músculo se digiere enzimáticamente usando colagenasa, y las fibras musculares individuales se liberan por trituración antes de incrustar las células aisladas en hidrogeles. El aislamiento de las fibras musculares FDB proporciona fibras musculares relativamente cortas, que tienen la ventaja de ser fácilmente manipulables. Debido a su tamaño, las fibras musculares FDB se pueden pipetear de forma segura sin daño inducido por enredos y se incrustan fácilmente dentro de un hidrogel. Como las fibras musculares individuales no se adhieren muy bien a las placas de cultivo, incrustar las fibras en hidrogel asegura que las fibras permanezcan en su lugar durante el cultivo celular y las mediciones contráctiles. Además, la adición de una matriz de membrana basal al gel de fibrina permite interacciones entre las fibras musculares y la matriz, imitando el entorno nativo in vivo . Las fibras musculares individuales aisladas pueden manipularse y mantenerse en cultivo durante varios días después del aislamiento. En la Figura 2, se muestra un ejemplo de fibras FDB aisladas incrustadas en una matriz de hidrogel. Las fibras sanas tienen sarcómeros visibles y se estiran rectas (flecha azul), mientras que las fibras curvas suelen estar dañadas o inviables (flecha amarilla) y deben excluirse de las mediciones. Las fibras hipercontraídas aparecen como objetos oscuros en la matriz (flecha roja). Si el procedimiento de aislamiento fue exitoso, la proporción de fibras saludables debe ser ~ 75%. Una mayor proporción de fibras hipercontraídas generalmente indica daño durante el procedimiento de aislamiento. La membrana de las fibras musculares puede dañarse ya sea por la digestión excesiva del músculo o daño a las fibras durante la trituración. El daño por trituración ocurre principalmente si el músculo está subdigerido y, por lo tanto, no se separa fácilmente.

La funcionalidad y viabilidad de la fibra se evaluaron a través de mediciones contráctiles de las fibras musculares utilizando un sistema de medición contráctil de alto rendimiento basado en óptica. El sistema genera varios parámetros, como la longitud del sarcómero, el porcentaje de acortamiento del sarcómero, la velocidad contráctil y la velocidad de relajación. Usando el sistema de medición contráctil, la contracción del sarcómero se puede medir por fibra muscular. La Figura 3 muestra ejemplos de contracciones de fibras musculares medidas utilizando el sistema de medición. A partir de una sola contracción transitoria, se obtienen los siguientes parámetros: longitud del sarcómero al inicio del estudio, duración de la contracción, longitud del sarcómero a la contracción máxima y duración de la relajación (Figura 3A). Estos parámetros se utilizan para calcular el porcentaje de velocidades de acortamiento, contracción y relajación del sarcómero. Los valores de velocidad promedio también se pueden calcular a partir de los valores de duración y acortamiento absoluto, si es necesario. Una medición válida de contracción presenta una línea de base recta, seguida de una caída al pico y un retorno a la línea de base (Figura 3A). El ruido, los sarcómeros desenfocados o el movimiento aberrante de la fibra pueden influir en el transitorio de medición (Figura 3B, C), y estas mediciones pueden descartarse manualmente o serán rechazadas por el programa de análisis. En este enfoque, la visualización clara de los sarcómeros es importante para medir las contracciones; Por lo tanto, cualquier cosa que reduzca la visibilidad de los sarcómeros puede introducir ruido. Esto podría ocurrir si hay movimiento del sarcómero fuera del plano focal durante la contracción. Las mediciones en las que una serie de contracciones difieren en velocidad o profundidad también deben excluirse del conjunto de datos.

Los datos contráctiles de fibras musculares individuales obtenidas con este sistema se pueden utilizar para comparar diferentes condiciones de cultivo. La eficacia del sistema se ilustra en la Figura 4. Aquí, medimos las contracciones de las fibras musculares FDB en formatos de cultivo 2D (placas de cultivo recubiertas de laminina) y 3D (hidrogel de fibrina). Se logró un mayor porcentaje de mediciones utilizables en 3D, ya que incrustar las fibras en el gel evitó que el movimiento lateral y otros artefactos de movimiento influyeran en la medición (Figura 4A). La incrustación de las fibras no tuvo un efecto significativo ni en el acortamiento del sarcómero ni en los valores de velocidad máxima de contracción en comparación con las fibras cultivadas en 2D (Figura 4B). Para ilustrar cómo diferentes matrices influyen en la contracción de las fibras musculares FDB, también comparamos este hidrogel de fibrina con una matriz de membrana basal pura (4 mg / ml) (Figura 4C). La contractilidad reducida observada en la matriz de membrana basal pura probablemente se debió a la rigidez del gel o al aumento de las interacciones célula-matriz. También se han probado concentraciones de fibrina de hasta 7 mg/ml, sin efectos significativos sobre la velocidad contráctil y el acortamiento (datos no publicados). El uso de este hidrogel a base de fibrina garantiza una interferencia mínima con los parámetros contráctiles.

Figura 1: Una visión general del procedimiento de disección muscular FDB. (A) La extremidad posterior se corta por encima del tobillo (línea discontinua roja), y (B) la piel se elimina cortando a lo largo de la parte superior del pie a lo largo de la línea discontinua azul. (C) El pie está sujeto a través del tobillo y la piel en los dedos de los pies. (D) Vista microscópica del músculo expuesto y su tejido conectivo circundante. La fascia es visible como una capa blanca opaca a través de la cual corre la vasculatura. (E) La fascia se elimina del músculo, y el tendón se corta a lo largo de la línea discontinua roja. (F) El músculo FDB se separa del tejido subyacente levantando y cortando debajo y junto al músculo. (G) Cuando los tendones de los dedos de los pies son claramente visibles, el FDB se suelta a lo largo de la línea discontinua roja. (H) La FDB está asegurada por los tendones, y el cuarto tendón lateral y sus fibras se pueden eliminar cortando a lo largo de la línea discontinua roja. El exceso de fascia ahora se puede recortar. (I) Después de la limpieza, el músculo FDB se transfiere a la solución de colagenasa. Barras de escala = (D-I) 2 mm. Abreviatura: FDB = flexor digitorum brevis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imagen microscópica de fibras musculares FDB incrustadas en hidrogel después de 24 h de cultivo. Flecha azul: Ejemplo de una fibra muscular FDB viable. Flecha amarilla: Ejemplo de una fibra muscular FDB retorcida. Las fibras musculares retorcidas pueden tener una viabilidad reducida y contracciones deterioradas y, por lo tanto, deben excluirse de las mediciones. Flecha roja: Ejemplo de una fibra muscular FDB hipercontraída. La hipercontracción excesiva ocurre cuando la trituración se realiza demasiado vigorosamente o puede ser causada por la sobredigestión de la colagenasa o el uso de medios de cultivo no equilibrados. Barra de escala = 100 μm. Abreviatura: FDB = flexor digitorum brevis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ejemplo de transitorios de contracción de fibra medidos utilizando el sistema contráctil de alto rendimiento basado en óptica. (A) Ejemplo de una contracción transitoria normal. Este transitorio se obtiene de los sarcómeros encerrados por el cuadrado púrpura que se muestra en la barra de herramientas inferior. El transitorio consta de los siguientes componentes: longitud del sarcómero al inicio (verde), duración de la contracción (azul), longitud del sarcómero en la contracción máxima (púrpura) y duración de la relajación (rojo). Parámetros como la velocidad y el porcentaje de contracción se calculan a partir de estos valores. (B) Ejemplo de una contracción transitoria inadecuada. Estas mediciones ocurren cuando la señal del sarcómero no se capta debido al ruido (ver flechas rojas). (C) Ejemplo de una contracción transitoria que tiene un artefacto de movimiento (ver flechas verdes). Los artefactos de movimiento ocurren cuando la fibra muscular se mueve fuera del foco durante la contracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Datos representativos obtenidos utilizando el sistema contráctil de alto rendimiento basado en óptica al comparar condiciones 2D versus 3D y diferentes hidrogeles . (A) Porcentaje de mediciones de contracción aceptadas y rechazadas encontradas por el programa de análisis de datos en cultivo 2D y en cultivo 3D basado en 30 mediciones. (B) Comparación de la velocidad máxima de contracción en fibras musculares cultivadas en 2D y 3D aisladas de tres ratones después de 24 h de cultivo. (C) Comparación del acortamiento del sarcómero en fibras musculares cultivadas en 2D y 3D aisladas de tres ratones después de 24 h de cultivo. (D) Comparación de la velocidad máxima de contracción de fibras musculares incrustadas en matriz de membrana basal pura (Matrigel) e incrustadas en hidrogel de fibrina aisladas de tres ratones después de 24 h de cultivo. (E) Comparación del acortamiento del sarcómero de fibras musculares incrustadas en la matriz de membrana basal pura (Matrigel) e incrustadas en hidrogel de fibrina aisladas de tres ratones después de 24 h de cultivo. Los datos fueron analizados mediante una prueba t de Student y se muestran como media ± DE. Cada punto de datos es una fibra muscular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición del medio de disección utilizado para diseccionar el músculo, el medio de cultivo de fibrina utilizado para cultivar las fibras musculares aisladas y el medio de digestión muscular utilizado para digerir enzimáticamente los músculos aislados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Composición de la mezcla celular utilizada para fundir los hidrogeles y la mezcla de matriz utilizada para fundir los hidrogeles. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Aquí, detallamos un protocolo para realizar el aislamiento enzimático y el cultivo de fibras musculares FDB en un formato de cultivo 3D, seguido de mediciones contráctiles utilizando un sistema de medición contráctil basado en óptica. Este protocolo tiene una serie de ventajas, incluyendo el 1) aislamiento directo y oportuno de muchas fibras musculares intactas de un solo músculo; 2) la incrustación de las fibras musculares en una matriz de hidrogel sintonizable; 3) la realización de mediciones de contractilidad de alto rendimiento utilizando el sistema basado en óptica; y 4) la capacidad de realizar mediciones repetidas de las mismas fibras musculares después de una intervención. El aislamiento de fibras musculares vivas individuales proporciona células musculares maduras que conservan su función contráctil. Como las fibras musculares obtenidas de la FDB de ratón son relativamente pequeñas, se manipulan fácilmente durante el aislamiento y mantienen su forma recta, lo que permite mediciones contráctiles aguas abajo. Aunque el sistema fue desarrollado principalmente para estudiar la contracción de los cardiomiocitos, las fibras musculares esqueléticas contienen la misma maquinaria contráctil con patrones de sarcómero fácilmente distinguibles y, por lo tanto, también pueden medirse utilizando este sistema²⁹. El acoplamiento de mediciones contráctiles unicelulares con cultivo de fibra muscular ex vivo vivo es una herramienta poderosa para evaluar la salud y la función de la fibra muscular madura en respuesta a la activación eléctrica.

Una limitación del uso de fibras musculares disociadas es la falta de fuerzas externas (es decir, estiramiento pasivo) aplicadas a las fibras, lo que resulta en longitudes de sarcómero en reposo más bajas en comparación con las que se encuentran in vivo. Aunque una longitud de sarcómero de 2.4-2.5 μm asegura una producción de fuerza óptima, la longitud del sarcómero en reposo puede variar mucho³³. Si bien aún no se ha descrito la longitud del sarcómero en reposo in vivo del FDB, nuestros propios datos no publicados sugieren una longitud promedio de 2,2 μm. Los resultados actuales muestran una longitud promedio de sarcómero en reposo de ~ 1.95 μm en fibras FDB descargadas después de 24 h en cultivo (Figura 3). Aunque esta menor longitud de sarcómero en reposo resultaría en una menor producción de fuerza, una longitud de ~ 1.95 μm aún debería producir >90% de la fuerza máxima³⁴. Como tal, estas longitudes de sarcómero deberían ser suficientes para determinar las diferencias en la función de la fibra entre diferentes modelos genéticos o después de tratamientos farmacológicos. Además, la incrustación de fibras en un hidrogel proporciona muchos puntos adicionales para la adhesión en comparación con las fibras cultivadas 2D que flotan libremente, lo que limitaría aún más el acortamiento del sarcómero con el tiempo.

Una ventaja de este protocolo de aislamiento de fibras musculares es el uso de un músculo de contracción rápida fácilmente diseccionable que consiste en fibras musculares relativamente pequeñas en comparación con otros músculos, como el extensor largo de los dedos (EDL). Su tamaño más pequeño hace que el aislamiento muscular sea más adecuado para la separación basada en la trituración, reduciendo así la posibilidad de daño inducido por pipetas o enredos a las fibras musculares. La matriz extracelular de los músculos FDB se puede digerir fácilmente enzimáticamente con colagenasa, lo que permite el aislamiento de cientos de fibras musculares en un corto período de tiempo. Sin embargo, la digestión excesiva puede provocar daños en las fibras musculares. La sobredigestión de las fibras musculares se puede reconocer cuando el músculo se deshace casi instantáneamente al triturar el músculo o cuando una gran proporción del volumen celular se hipercontrae durante el procedimiento de siembra celular. Para evitar la sobredigestión del músculo, el tiempo de digestión debe optimizarse para cada lote de colagenasa. Para probar esto, dos músculos FDB deben ser digeridos en paralelo con un tiempo de digestión escalonada de 5 minutos entre ellos. Se debe elegir el tiempo de digestión con el mayor rendimiento de fibras musculares viables. Esta optimización debe realizarse una segunda vez, nuevamente con 5 minutos de separación en el tiempo de digestión. El tiempo de digestión que produce las fibras musculares viables más altas debe usarse como el tiempo de digestión óptimo para el lote actual de colagenasa. Otra forma de limitar la variabilidad de lote a lote de la colagenasa sería calcular directamente las unidades de actividad por mililitro de solución madre y luego reconstituir los lotes posteriores de colagenasa a la misma cantidad. Por último, los tiempos de digestión pueden necesitar ser optimizados en diferentes cepas de ratón, por ejemplo, si se estudian animales ancianos o enfermos que exhiben una mayor deposición de matriz extracelular^35,36.

La posibilidad de pipetear fibras musculares aisladas viables abre posibilidades para cultivar fibras musculares FDB en diversas condiciones de cultivo. Una de estas opciones es el cultivo de estas fibras en hidrogeles para imitar el entorno de cultivo de tejidos nativos. Este protocolo de incrustación garantiza que las fibras permanezcan en su lugar durante las mediciones contráctiles y se ha optimizado para permitir que las fibras se depositen en el fondo de la placa antes de que el gel se fije. Sin embargo, puede ser necesario ajustar este protocolo para acomodar las diferencias en las reservas de trombina y fibrinógeno. Si la actividad de la trombina es demasiado alta, el gel se fijará prematuramente y las fibras pueden permanecer suspendidas en lugares más altos fuera del plano focal del microscopio. Si esto sucede, la relación trombina:fibrinógeno debe ajustarse. Esto se puede probar chapando fibras en concentraciones de trombina cada vez más bajas y tomando nota de cuánto tiempo lleva la polimerización. Por lo general, esto no debe suceder más rápido que 30 minutos. Sin embargo, tener una concentración de trombina demasiado baja también puede perjudicar el proceso de polimerización. Otro método para asegurarse de que las fibras estén en el plano focal correcto es sembrarlas primero utilizando un protocolo 2D y luego agregar una capa de hidrogel sobre las fibras después de que se hayan adherido a la placa de cultivo. Sin embargo, uno debe ser consciente de que la eliminación del medio de las fibras puede inducir hipercontracción, ya que son sensibles a la desecación. Tampoco está claro si el hidrogel se adherirá completamente a la placa de cultivo, y podría soltarse más fácilmente. Por lo tanto, este procedimiento de incrustación es preferible para mantener las fibras viables y en su lugar para las mediciones de contracción.

El uso de este protocolo permite el estudio de la dinámica contráctil de las fibras musculares maduras ex vivo y se puede aplicar tanto a ratones sanos como a aquellos portadores de mutaciones genéticas para enfermedades musculares. Del mismo modo, permite probar cómo las condiciones de cultivo o la adición de compuestos afectan la función de la fibra muscular. Los datos contráctiles obtenidos utilizando el sistema basado en óptica dan una indicación de la capacidad contráctil de las fibras musculares individuales vivas, y los cambios en esta capacidad pueden correlacionarse con la salud de la fibra. Sin embargo, estos datos por sí solos no son suficientes para determinar si estos cambios ocurren en las etapas de puente cruzado de actina-miosina o liberación de calcio de la contracción muscular. Aunque no describimos métodos para medir la señalización de calcio en este protocolo, esta configuración también es capaz de medir transitorios de calcio basados en Fura en células musculares en contracción²⁹. Un inconveniente de este sistema es que el músculo FDB contiene solo fibras musculares de contracción rápida tipo IIa/IIx, y los músculos que contienen fibras de contracción lenta tipo I de este tamaño aún no han sido descritos³⁷. Esto elimina la capacidad de estudiar el funcionamiento específico del tipo de fibra utilizando este método. El protocolo que proponemos aquí podría adaptarse potencialmente para otros músculos como el EDL o el sóleo para estudiar las diferencias de tipo de fibra. Debido a su mayor tamaño, este protocolo tendría que ser optimizado aún más para estos músculos. Las fibras más largas tienden a enredarse durante la etapa de sedimentación por gravedad y se romperán si se manipulan mediante pipeteo, lo que conduciría a un menor rendimiento. Debido a su incompatibilidad con el pipeteo, las fibras más largas son, por lo tanto, también menos compatibles con la técnica de incrustación de gel. Las mediciones de estas fibras todavía se pueden hacer en un formato de cultivo 2D, pero las fibras pueden moverse más durante la contracción debido a su tamaño, lo que afecta la relación señal-ruido. Otra limitación de este sistema es la incapacidad de realizar mediciones de fuerza junto con las mediciones contráctiles, como las mediciones de fuerza que se pueden obtener utilizando otras preparaciones de fibras musculares intactas²⁸. Sin embargo, esta limitación se puede eludir estimando la fuerza generada por la fibra muscular. La fuerza generada de las fibras musculares se puede estimar si se conoce la forma de la fibra muscular durante los estados contraídos y relajados, así como el módulo de Young de la matriz²⁵. No obstante, este sistema basado en la óptica proporciona un enfoque fácil de usar y de alto rendimiento para estudiar la función contráctil muscular y abre una gama de nuevas posibilidades para estudiar enfermedades musculares genéticas e intervenciones terapéuticas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
La aprotinina, de Bovine Lung	Thermo Scientific	AAJ63039MC	solución madre de 100 mM en PBS se puede almacenar a -20 °C.  Esterilice la solución madre con un 0.22 µ Filtro M.
La solución madre de colagenasa tipo 2	Worthington	77336	al 10% (p/v) se puede almacenar a -20 °C. El pesaje de la colagenasa debe realizarse en un gabinete de seguridad, ya que la inhalación es peligrosa.
Suero fetal bovino	Thermo Fisher	10500064
Fibrinógeno de Plasma Bovino	Sigma Aldrich	50-176-5054	La solución madre de 20 mg/mL en PBS se puede almacenar a -80 °C. Esterilice la solución madre utilizando un 0,22 µ Filtro M.
de Thermo Fisher A1413201 Geltrex sin LDEV			prepara en MEM y se almacena a -20 °C.
Gibco MEM Alta glucosa + piruvato	Thermo Fisher	11095080
Suero de caballo	Thermo Fisher	H1270
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning	CB-40230	La solución madre de 4 mg/mL se prepara en MEM y se almacena a -20 °C.
Penicilina/estreptomicina	Sigma Aldrich	P4333
Suero de reemplazo 2 (50x)	Sigma Aldrich	S9388
Trombina, Plasma Bovino	Thermo Scientific	AAJ63383EXP	125 U/mL de stock en PBS se puede almacenar a -20 °C. Esterilice la solución madre utilizando un 0.22 µ Filtro M.
ácido tranexámico	Thermo Scientific	AC228042500	80 mM en PBS se puede almacenar a -20 °C. Esterilice la solución madre con un 0.22 µ Filtro M.
Equipment
estimulador eléctrico de 24 pocillos	IonOptix	N/A
Pinzas Dumont #55	Fine Science Tools	11295-51
Tijeras Bonn Extra Finas	Fine Science Tools	14084-08
Citocipher MultiCell	IonOptix	N/A
MyoCam-S3	IonOptix	N/a
MyoPacer	IonOptix	N/a
SYLGARD 184 elastómero de silicona, Base & Agente de curado	Dow Corning	N/a
Tijera de resorte Vannas - 25 mm Cuchilla Edge Science	Tools	15002-08
Software
CytoSolver	IonOptix	N/a