Summary
Bu protokol, nötrofil ömrünü 5 günden fazla uzatmak için CLON-G'nin hazırlanmasını detaylandırır ve akış sitometrisi ve konfokal floresan mikroskobu ile nötrofil ölümünü değerlendirmek için güvenilir bir prosedür sağlar.
Abstract
Bir nötrofilin ortalama ömrü 24 saatten azdır, bu da nötrofiller hakkındaki temel araştırmaları ve nötrofil çalışmalarının uygulanmasını sınırlar. Önceki araştırmamız, çoklu yolakların nötrofillerin kendiliğinden ölümüne aracılık edebileceğini göstermiştir. Bu yolakları, kaspaz-lizozomal membran geçirgenliğini-oksidan-nekroptoz inhibisyonunu ve granülosit koloni uyarıcı faktörü (CLON-G) eş zamanlı olarak hedefleyerek, nötrofil fonksiyonunu önemli ölçüde tehlikeye atmadan nötrofil ömrünü 5 günden fazla uzatan bir kokteyl geliştirilmiştir. Aynı zamanda, nötrofil ölümünü değerlendirmek ve değerlendirmek için güvenilir ve istikrarlı bir protokol de geliştirilmiştir. Bu çalışmada CLON-G'nin nötrofil ömrünü in vitro olarak 5 günden fazla uzatabildiğini göstermiş, FACS ve konfokal floresan mikroskobu ile nötrofil ömrünün uzamasını sergilemiş bulunmaktayız. Bu rapor, CLON-G'nin hazırlanması için prosedürleri tanıtmakta ve nötrofillerin incelenmesi ve daha sonra nötrofil ölümünün sorgulanması için kullanılabilecek nötrofillerin in vitro spontan ölüm testini sergilemektedir, böylece nötrofil topluluğu için güvenilir bir kaynak sağlamaktadır.
Introduction
Nötrofillerin bol miktarda sitoplazmik granül, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz, antimikrobiyal enzimler ve istilacı mikroplara karşı savunma yapan çeşitli organellerden oluşan bir cephanelik içerdiği bilinmektedir; Ek olarak, oldukça hareketlidirler ve iltihaplanma bölgesine alınan ilk hücrelerdir, yani nötrofiller doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ilk savunma hattıdır 1,2. Bu nedenle granülosit transfüzyon tedavisi, nötropeniye bağlı enfeksiyonlar için nötrofil bağışıklığını geçici olarak artırmak için umut verici bir klinik tedavi haline gelmiştir 3,4,5. Son keşifler, nötrofillerin birçok fizyopatolojik senaryoda çok yüzlü efektörler olarak da işlev gördüğünü açıkça göstermiştir6. Bir nötrofilin ortalama ömrü 24 saatten azdır ve bu nedenle, nötrofiller üzerine temel araştırmalar ve nötrofil çalışmalarının uygulanması, kararlı genetik manipülasyon ve uzun süreli depolama ile ilgili sınırlamalar nedeniyle son derece zordur 7,8,9,10,11 . HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler12 gibi bazı nötrofil fonksiyonlarını kısmen sergileyebilen bazı hücre hatları vardır. Bu hücre hatları etkili gen düzenleme ve kriyoprezervasyon sağlayabilir; Bununla birlikte, birincil nötrofillerden hala oldukça farklıdırlar ve bu nedenle nötrofil fonksiyonlarını sadık bir şekilde özetleyemezler13. Bu nedenle, bu alandaki araştırmaların çoğu hala taze izole edilmiş birincil nötrofillere dayanmaktadır. Alan hala nötrofillerdeki spesifik gen fonksiyonlarını araştırmak için pahalı ve zaman alıcı koşullu nakavt fareleri üretmeye dayanıyor, ancak şu anda hiçbir insan modeli mevcut değil.
Nötrofil ölümünde yer alan heterojen süreçleri ve bu süreçleri düzenleyen çoklu yolları keşfetmeye yönelik çabalarımızı ortaya koyduktan sonra,14,15, CLON-G (kaspazlar-lizozomal membran geçirgenliği-oksidan-nekroptoz inhibisyonu artı granülosit koloni uyarıcı faktör) olarak adlandırılan yeni bir tedavi yakın zamanda bildirilmiştir 16. KLON-G, Q-VD-oph (kinolil-valil-O-metilaspartyl-[-2,6-diflorofenoksi]-metil keton), Hsp70 (ısı şoku proteini 70), DFO (deferoksamin), NAC (N-asetilsistein), Nec-1'ler (nekrostatin-1'ler) ve G-CSF'den (granülosit koloni uyarıcı faktör) oluşur. Nötrofil spontan ölümüne, apoptoz, nekroptoz ve piroptoz dahil olmak üzere birçok yol aracılık eder. Q-VD-oph, kaspaz 1, kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 917'yi hedef alarak nötrofillerin pan-kaspaz inhibitörü olarak apoptozunu inhibe eder. Nötrofil nekroptozu, reseptörle etkileşime giren protein kinaz-1 (RIPK1) ve karışık soy kinaz etki alanı benzeri proteini (MLKL)18 içeren bir sinyal yoluna bağlıdır. Bir RIPK1 inhibitörü olarak, Nec-1'ler nötrofillerin nekrotozunu inhibe eder. Hsp70 ve DFO, nötrofil apoptozu19 ve piroptoz20'yi indükleyebilen lizozomal membran geçirgenliğini (LMP) inhibe edebilir. Reaktif oksijen türleri (ROS), LMP19 ve apoptoz21'e aracılık ederek ve sağkalım sinyallerini22'yi inhibe ederek nötrofil ölümünde hayati rol oynamaktadır. ROS birikimini azaltabilen bir antioksidan olarak NAC, nötrofil ölümünü geciktirir. Bir büyüme faktörü olarak, G-CSF nötrofil sağkalım sinyallerini aktive eder ve calpain kaynaklı apoptozu inhibe eder23,24. Aynı anda birden fazla nötrofil spontan ölüm yolunu hedefleyerek, nötrofil ömrü, işlevlerinden ödün vermeden etkili bir şekilde 5 günden fazla uzatılabilir. CLON-G tedavisi, nötrofil topluluğundaki araştırmaları hızlandırabilecek nötrofil koruma, taşıma ve gen manipülasyonu olanaklarını genişletir. Bu arada, nötrofil ölümü bilgisine dayanarak, hücre ölümü testleri için şu anda onaylanmış protokoller nötrofillerde beklenmedik hasara neden olabilir14, bu nedenle bu protokoller nötrofil çalışmaları için daha uygun olacak şekilde rafine edilmiştir. Bu rapor, CLON-G ile nötrofil kültürlemesi için ayrıntılı protokoller ve akış sitometrisi ve floresan görüntüleme kullanılarak fare nötrofillerinin in vitro hücre ölüm testini sunmaktadır. CLON-G hem fare hem de insan nötrofilleri üzerinde etkilidir; ancak, bu protokolü basitleştirmek için fare örnekleri burada gösterilmiştir. NAC konsantrasyonu, fare nötrofilleri için 1 mM ve insan nötrofilleri için 10 μM'dir. Hsp70 türe özgüdür ve bu nedenle nötrofilin kaynağına göre kullanılmalıdır. Bu protokol için, nötrofillerin periferik kandan mı yoksa kemik iliğinden mi izole edildiği ve nasıl izole edildiği önemli değildir.
Bu çalışma için, deneyler için yeterli nötrofil elde etmek için fare kemik iliğinden nötrofiller izole edilmiştir, çünkü kemik iliğinden yaklaşık 1 x 10 7-1.5 x 107 nötrofil elde edilebilirken, tek bir 8-12 haftalık C57BL / 6 faresinin (her iki cinsiyetten) periferik kanından sadece 1 x 106 nötrofil izole edilebilir. Gradyan santrifüjlemesi, FACS ayıklama veya MACS sıralamanın mekanik uyarımından kaynaklanan olası hasarı ve aktivasyonu önlemek için gerçekleştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Boston Çocuk Hastanesi ve Deneysel Hematoloji Eyalet Anahtar Laboratuvarı (SKLEH) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tüm prosedürleri onayladı ve izledi. Şekil 1 , CLON-G ve in vitro ölüm testi ile nötrofil kültürlenmesinin bir akış şemasını göstermektedir.
1. CLON-G ile nötrofil ömrünün uzatılması
NOT: Belirtilen tüm işlemler ve malzemeler steril olmalıdır. Tüm çözeltilerin iyi karıştırıldığından ve eşit olarak dağıtıldığından emin olun.
- CLON-G bileşenlerinin korunması
- 973.7 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek 50 mg Q-VD-oph'u ( Malzeme Tablosuna bakınız) 100 mM'lik nihai konsantrasyona çözün ve karışım berraklaşana kadar sıvıyı pipetin. Aliquot tüp başına 50 μL ve -20 °C'de muhafaza edin.
DİKKAT: DMSO zararlı bir kimyasal sıvıdır. Cilt teması, göz teması ve solumaktan kaçınmak için laboratuvar önlüğü, gözlük ve maske takın. - Hsp70'i 4 ° C'de çözün ( Malzeme Tablosuna bakın) ve şişedeki içeriği aşağı doğru döndürün. Aliquot buz üzerinde tüp başına 1 μL Hsp70 ve -80 ° C'de koruyun.
NOT: Hsp70 bir proteindir; Sabit tutmak için ultra soğuk depolama gereklidir. Donma-çözülme döngüsünden kaçının. - Tüp başına 200 μM. Aliquot 500 μL'lik bir stok elde etmek için 1 mg DFO'yu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 7.61 mL RPMI 1640 ile çözün ve -20 ° C'de koruyun.
- 0.1 g NAC'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 2.5 mL RPMI 1640 ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde çözün ve pH'ı NaOH ile 7-7.4'e ayarlayın. 200 mM NAC stoğu oluşturmak için RPMI 1640'ı 3,06 mL'lik son hacme ekleyin. 0,2 μm filtreleme ünitesi ile filtreleyin. Tüp başına 500 μL aliquot ve -20 ° C'de koruyun.
NOT: NAC'ın bu yüksek konsantrasyonda çözülmesi kolay değildir ve vorteksleme çözülmesine yardımcı olabilir. RPMI 1640'taki fenol kırmızısı, pH'ın mükemmel bir göstergesidir; NAC yeni çözündüğünde, renk sarımsıdır; pembemsi hale gelene kadar ayarlayın. NAC stok çözeltileri −20 °C'de 1 aya kadar kararlıdır. - 10 mg Nec-1'leri ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1.8 mL DMSO ile 20 mM'ye çözün ve berraklaşana kadar karışımı pipetin. Aliquot tüp başına 50 μL ve -20 °C'de muhafaza edin. Işıktan koruyun.
- 250 μg G-CSF'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1,25 mL RPMI 1640 ile 200 μg/mL'ye çözün. Aliquot tüp başına 50 μL ve 4 °C'de muhafaza edin.
- 973.7 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek 50 mg Q-VD-oph'u ( Malzeme Tablosuna bakınız) 100 mM'lik nihai konsantrasyona çözün ve karışım berraklaşana kadar sıvıyı pipetin. Aliquot tüp başına 50 μL ve -20 °C'de muhafaza edin.
- 2x CLON-G kültür ortamının hazırlanması
- Temel ortamı hazırlayın. RPMI 1640'ı temel bir ortam olarak% 20 FBS ve% 1 PS ile RPMI 1640 yapmak için 50 mL'lik bir tüpe 39.5 mL RPMI 1640, 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 0.5 mL kalem strep (antibiyotikler) ekleyin.
NOT: Bu yüksek FBS konsantrasyonu, 5 günden fazla olabilen uzun süreli nötrofil kültürünü sağlamak için kullanılır. Kültürleme süresi 1-2 gün ise %10-%15 FBS yeterlidir. - CLON-G bileşenlerinin tüm stok çözümlerini buz üzerinde çözün.
- Temel ortamdan 606 μL ekleyerek 1 μL Hsp70 ila 20 μM arasında seyreltin. Temel ortamdan 9 μL ekleyerek 200 μg/mL G-CSF'nin 1 μL'sini 20 μg/mL'ye seyreltin.
- 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 976 μL bazik ortam ekleyin. 1 μL 2x CLON-G ortamı yapmak için 1 μL Q-VD-oph (100 mM), 10 μL DFO (200 μM), 1 μL Hsp70 (20 μM), 10 μL NAC (200 mM), 1 μL Nec-1s (20 mM) ve 1 μL G-CSF (20 μg / mL) ekleyin.
NOT: 2x CLON-G ortamı hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır. 2x CLON-G geçici olarak 4 °C'de saklanabilir. Artık 20 μM Hsp70 atılmalıdır.
- Temel ortamı hazırlayın. RPMI 1640'ı temel bir ortam olarak% 20 FBS ve% 1 PS ile RPMI 1640 yapmak için 50 mL'lik bir tüpe 39.5 mL RPMI 1640, 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 0.5 mL kalem strep (antibiyotikler) ekleyin.
- Nötrofil kültürü
- Fare nötrofillerini, önceki bir rapor25'i takiben gradyan santrifüjleme ile izole edin. İzole edilmiş fare nötrofillerini temel ortamda (1 milyon hücre/100 μL) yeniden askıya alın.
NOT: Nötrofilleri nazikçe kullanarak aktive etmekten kaçının. Tüm süreç boyunca köpüklenmeyi önleyin. - 24 kuyucuklu doku kültürlü olmayan kültür plakalarına 500 μL 2x CLON-G ortamı, 400 μL bazik ortam ve 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin (bkz.
NOT: 2x CLON-G ortamındaki bileşenlerin yüksek konsantrasyonları nötrofillere zarar verebilir; Temel ortam olmadan bunları bir araya getirmekten kaçının. Doku kültürü olmayan kültür plağı, nötrofil yapışmasını önlemek için gereklidir. - Kültür plakasını 37 °C ve %5 CO2 inkübatöre sorunsuz bir şekilde yerleştirin.
NOT: Hücre ortamını 7 gün içinde değiştirmek gereksizdir. CLON-G bileşiminin nihai konsantrasyonları 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s ve 10 ng / mL G-CSF'dir. - Kültürlenmiş nötrofilleri Wright Giemsa bileşik boyası ile lekeleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ışık mikroskobu ile analiz edin (Şekil 2A-D). Alternatif olarak, APC-CD11b ve PE-Cy7-Ly6G antikorları ile boyayın ve daha önce açıklandığı gibi akış sitometrisi (Şekil 2E-I) ile analiz edin26.
- Fare nötrofillerini, önceki bir rapor25'i takiben gradyan santrifüjleme ile izole edin. İzole edilmiş fare nötrofillerini temel ortamda (1 milyon hücre/100 μL) yeniden askıya alın.
2. Nötrofillerin in vitro spontan ölüm testi
- Akış sitometrisi analizi
- Kültür, nötrofilleri bazik ortamda 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 1 milyon hücre / mL yoğunluğunda izole etti. 24 kuyucuklu kültür plağı doku kültürü dışıdır. Kuyucuk başına 1 mL hücre ortamı ekleyin.
- 200 mM CaCl2 yapmak için 1 g CaCl2'yi 45 mL salin ile çözün. 0,2 μm filtreleme ünitesi ile filtreleyin. 4 °C'de muhafaza edin.
- Boyama karışımını hazırlayın. 1,5 mL'lik bir tüpe numune başına 7 μL salin ekleyin ve numune başına her biri 1 μL'de 0,4 mg/mL FITC-Annexin-V, 0,5 mg/mL propidyum iyodür (PI) ve 200 mM CaCl2 çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın. Çözeltiyi hazırlandıktan hemen sonra kullanın.
- İyice karıştırmak için hücre ortamını yavaşça beş ila yedi kez pipetin, ardından istenen zaman noktalarında bir akış sitometri tüpüne 100 μL aktarın.
NOT: Tüm süreç boyunca köpüklenmeyi önleyin. - Vorteks sayma boncukları (bakınız Malzeme Tablosu) iyice karıştırmak için. İyi karıştırılmış sayma boncuklarının 10 μL'sini adım 2.1.4'teki gibi aynı akış sitometri tüpüne pipetleyin.
- Hazırlanan boyama karışımını (adım 2.1.3) akış sitometri tüpüne 10 μL ekleyin. Oda sıcaklığında ışıktan 5 dakika uzakta inkübe edin.
- Tüpe 100 μL salin ekleyin ve sayma boncuklarının ve hücrelerinin eşit dağılımını sağlamak için iyice karıştırın.
- Hücre ortamının akış sitometri analizini yapın. Hücreleri ~ 400 olay / s ile düşük bir hızda toplayın. APC-PE-Cy7- hücrelerini FSC-A ve SSC-A'ya ve orta FSC-A ve SSC-A konumlarına sahip sağlam hücreleri FITC-Annexin-V ve PE-PI'ye geçirin; Ek-V-PI− popülasyonu sağlıklı hücreler olarak sınıflandırılır.
NOT: Aşağıdaki denklemler, numune başına toplam sağlıklı hücre sayısını ve nötrofillerin yaşayabilirliğini belirler:
Numune başına toplam sağlıklı hücre sayısı27 = (1.000/sayma boncuk sayısı) × Ek-V−PI− popülasyon sayısı × 10
Nötrofillerin yaşayabilirliği = belirtilen zamanda toplam sağlıklı hücre sayısı/sıfır zamanındaki toplam sağlıklı hücre sayısı
- Floresan görüntü testi
- Kültür, bazik ortamda 37 ° C'de 1 milyon hücre / mL yoğunluğunda nötrofilleri ve plaka başına 2 mL hücre ortamı olan konfokal bir plakada% 5 CO2'yi izole etti.
NOT: Bir konfokal floresan mikroskobu en iyi görüntü kalitesine sahiptir, ancak 488/561/DIC kanallarına sahip herhangi bir floresan mikroskobu bu deneyi desteklemek için yeterlidir. - Plakayı belirtilen zaman noktasında yavaşça çıkarın. Plakaya eşit olarak 0.4 mg / mL FITC-Annexin-V, 0.5 mg / mL PI ve 200 mM CaCl2'nin her biri 10 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca lekeleyin.
NOT: Tüm süreç boyunca titremekten kaçının. Boyama maddelerini eşit ve nazikçe ekleyin. - 20x objektif lensli konfokal floresan mikroskobu kullanarak 488 (ek-V)/561 (PI)/DIC kanallarında floresan görüntüler yakalayın (bkz. 488 kanalın pozlama süresini 500 ms, 561 kanalın pozlama süresini 200 ms ve DIC kanalının 100 ms olarak ayarlayın. Her plaka için 5-10 rastgele alan seçin. Hücre tipleri daha önce yayınlanan rapor14'te tanımlanmıştır.
- Kültür, bazik ortamda 37 ° C'de 1 milyon hücre / mL yoğunluğunda nötrofilleri ve plaka başına 2 mL hücre ortamı olan konfokal bir plakada% 5 CO2'yi izole etti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CLON-G ile tedavi edilen nötrofillerin Wright-Giemsa boyalı morfolojisi (Şekil 2A-D) ve FACS fenotipleri (Şekil 2E-J) etkilenmedi. CLON-G ile tedavi edilen nötrofillerin 24 saatte yaşayabilirliği, akış sitometri analizine (Şekil 3) ve floresan görüntü analizlerine (Şekil 4) dayanarak yaklaşık% 90 + idi. Daha düşük canlılık, yanlış depolama, CLON-G bileşenlerinin yanlış konsantrasyonları veya başlangıçtaki izole nötrofillerin düşük kalitesinden kaynaklanabilir. 24 saat boyunca bazik ortam ile kültürlenen tedavi edilmemiş nötrofillerin akış sitometri analizi, bu nötrofillerin Ek-V-pozitif bir popülasyona sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 3B). Bu popülasyonun kaybı, hücre ortamındaki etilen diamin tetraasetik asitten (EDTA) kaynaklanabilir. 24 saat boyunca bazik ortam ile kültürlenen nötrofillerin floresan görüntüleri şişirilmiş hücreler içermelidir (Şekil 4A'daki beyaz ok). Şişirilmiş hücrelerin kaybı, konfokal plakanın sallanmasından veya pipetlenmesinden kaynaklanabilir.
Şekil 1: CLON-G ile nötrofil kültürleme akış şeması ve in vitro ölüm testi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CLON-G ile muamele edilmiş fare nötrofillerinin morfolojisi ve hücre yüzey belirteci fenotipleri. Hücreler kültürlendikten sonra Wright-Giemsa bileşik boyası ile boyandı ve 40x objektif lens kullanılarak mikroskopi ile değerlendirildi veya (E-I) APC-CD11b ve PE-Cy7-Ly6G antikorları ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. (J) CD11b+ ve Ly6G+ hücrelerinin belirtilen zaman noktalarındaki oranları istatistiksel olarak analiz edildi. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Veriler, üç deneyin SD'± araçları olarak sunulmuştur. ns = karşılık gelen gruba kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir fark yok. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CLON-G ile tedavi edilen fare kemik iliği nötrofillerinin akış sitometrisi analizi . (A) Geçit stratejisi, (B) temsili sonuçlar ve (C) 24 saat boyunca kültürlendikten sonra nötrofillerin yaşayabilirliği. Veriler, üç deneyin SD'± araçları olarak sunulmuştur. **P < karşılık gelen gruba kıyasla 0,001'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Floresan görüntü testine dayanan nötrofil ölümü için temsili sonuçlar. (A) 24 saat boyunca bazik ortam veya (B) 24 saat, (C) 3 gün veya (D) 5 gün boyunca CLON-G ile kültürlendikten sonra nötrofil ölümü. Kültürlemeden sonra, hücreler FITC-Annexin-V (Yeşil) ve PI (Kırmızı) ile boyandı ve konfokal floresan mikroskobu ile değerlendirildi. Ölçek çubuğu 40 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nötrofiller doğuştan gelen ve adaptif bağışıklıkta hayati roller oynar ve homeostazları sıkı bir şekilde düzenlenir. Nötrofiller, insan periferik kanındaki en bol lökositlerdir ve sağlam ve hızlı bir ciroya sahiptirler. Sağlıklı bir yetişkin, kemik iliğinden günde 1 x 109 nötrofil / kg salgılayabilir28. Nötrofillerin ölümü bu nedenle bu alanın şaşırtıcı gizemlerinden biri haline geldi ve onları daha iyi anlamak için çok çaba sarf edildi. Kaspaz 29,30,31,32, LMP 33, ROS21,22,33, nekroz 34,35,36,37 ve nekropotoz 18,38'in bu heterojen süreçlerde rol oynadığı kanıtlanmıştır. GM-CSF 24 ve G-CSF23, bastırılmış fonksiyonlarla nötrofil ömrünü yaklaşık24saate kadar uzatabilir. CLON-G, bilinen tüm nötrofil spontan ölüm mekanizmalarını hedef alır. Bildiğimiz kadarıyla, CLON-G şu anda fonksiyondan ödün vermeden in vitro nötrofil ömrünün en uzun uzamasını sağlamaktadır.
CLON-G ile nötrofil kültürlemesinden en iyi sonuçları elde etmek için birkaç uyarı dikkate alınmalıdır. Önceki farmakolojik taramamız16 sayesinde, CLON-G bileşenlerinin doğru konsantrasyonlarının başarının anahtarı olduğu ve bu nedenle hazırlık sırasında herhangi bir hata yapmaktan kaçınmaya ve bunları uygun şekilde korumaya çalışılması gerektiği vurgulanmıştır. Nötrofil manipülasyonu ve saflaştırılması ile ilgili olarak, nötrofilleri aktive etmek ve öldürmek kolaydır; Bu nedenle, tüm süreç boyunca nazikçe tedavi edilmeli ve izole edildikten sonra kültürlenmelidirler. Hücre konsantrasyonuna, kültür plakasının durumuna, sıcaklığa ve pH'a duyarlıdırlar; Bu protokolü değiştirirken dikkatli olunmalıdır. İn vitro ölüm testi ile ilgili olarak, önceki sonuçlar, kendiliğinden ölü nötrofillerin, mekanik kuvvete tahammül edilemeyen şişirilmiş hücrelere şiştiğini göstermiştir; eğirme, pipetleme ve yıkama nötrofil sayısını azaltır ve standart bağlama tamponunun bir CaCl2 çözeltisi ile değiştirilmesi bu işlemi basitleştirebilir ve nötrofillerin doğru bir şekilde tasvir edilmesini sağlayabilir14. Aynı deneydeki teknik kopyalar arasındaki tutarsızlıklar, operasyon sırasında köpüklenmeden kaynaklanabilir. Bağımsız deneyler arasındaki farklılıklar, nötrofillerin saflığı ve tazeliğindeki değişikliklerden kaynaklanıyor olabilir39.
CLON-G, spontan nötrofil ölümünü önlemek için bilinen yolları ve karşılık gelen inhibitör kimyasalları birleştirir. Bununla birlikte, bu alanın temel sorusu, nötrofil ölümüne aracılık eden karmaşık yollarla ilgili olmaya devam etmektedir, çünkü bunlar hala tam olarak anlaşılmamıştır. CLON-G ile tedavi edilen nötrofillerin ölümü kaçınılmazdır. Bu nedenle, CLON-G'nin hala iyileştirme alanı vardır. CLON-G'nin bileşenlerine gelince, en iyi seçenekler, CLON-G ile tedavi edilen nötrofillerin klinik uygulama olasılığını genişletmek için klinik olarak uygulanan ilaçlardır; Bununla birlikte, Q-VD-oph ve Rec-1'ler yalnızca araştırma amaçlıdır ve bunlara odaklanan klinik çalışmalar şu anda mevcut değildir. Bu nedenle, klinik uygulama için alternatif bileşikler gereklidir.
CLON-G, nötrofil ömrünü, işlevleri bozulmadan 5 günden fazla uzatarak, nötrofil araştırması için sonsuz olasılıkların kilidini açabilir. Bu genişletilmiş pencere ile gözlem, gen manipülasyonu, uzun süreli depolama, taşıma ve kriyoprezervasyon, CLON-G'ye dayalı olarak geliştirilebilir. İşçilik, zaman ve para maliyetleri önemli ölçüde azaltılacak ve bu da yeni araştırmacılar için giriş engellerini azaltacaktır. CLON-G ayrıca granülosit transfüzyon tedavisi gibi nötrofil klinik uygulamalarını da teşvik edebilir. Kemoterapi sonrası nötropenik enfeksiyon, kanser ve hematopoetik malignitelerden muzdarip hastalar için önemli bir ölüm nedenidir 40,41,42,43,44. Bu hastalara yardımcı olmak için alternatif bir tedavi olarak büyük potansiyele sahip olan granülosit transfüzyon tedavisi, nötrofillerin kısa ömrü ile ciddi şekilde sınırlıdır45. Granülosit transfüzyonu için mevcut proses akışı, bir nötrofilin ömründen daha uzun sürer ve transfüze edilen nötrofillerin birinci basamak bağışıklık hücresi olarak etkinliklerini kaybetmelerine neden olur. CLON-G tedavisi, nötropenik enfekte hastaların sayısız hayatını kurtarma potansiyeline sahip granülosit transfüzyonlarının hazırlanması ve antibiyotiklerin aşırı kullanımının azaltılmasına yardımcı olmak için yeterli zaman sağlar. Aynı zamanda, nötrofil ölüm testi için mevcut protokol, nötrofillerin durumunu doğru bir şekilde gösterebilir ve deneysel sonuçların tekrarlanabilirliğini artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, araştırmanın herhangi bir çıkar çatışması olmadan yapıldığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu proje, Haihe Hücre Ekosistemi İnovasyon Fonu Laboratuvarı (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Çin Tıp Bilimleri Akademisi (CAMS) Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Merkez Üniversiteler Özel Araştırma Fonu, Pekin Birliği Tıp Koleji (3332022062) ve Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Destek Programı (NO. 2021YJ0480) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
References
- Segal, A. W.
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
- Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
- Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
- Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
- Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
- McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H.
- Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
- Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U.
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
- Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
- van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
- Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
- Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Porter, A. G., Jänicke, R. U.
- Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
- Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
- Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
- Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
- Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
- Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
- Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).
