कैंडिडाटस लिबिबैक्टर एशियाटिकस", क्लास, हुआंगलोंगबिंग, एचएलबी, साइट्रस ट्राइस्टेजा वायरस, सीटीवी, scientific video journal" />

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Bioengineering

इंस्ट्रूमेंट इंजीनियरिंग के माध्यम से डाउनस्ट्रीम रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए साइट्रस बडवुड प्रोसेसिंग को स्वचालित करना

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65159
Automatic Translation
*1,6, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5, *1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

हमने एक उपकरण को इंजीनियर, निर्मित और मान्य किया जो फ्लोएम समृद्ध छाल साइट्रस बडवुड ऊतकों को तेजी से संसाधित करता है। वर्तमान तरीकों की तुलना में, बडवुड ऊतक एक्सट्रैक्टर (बीटीई) ने नमूना थ्रूपुट में वृद्धि की है और आवश्यक श्रम और उपकरण लागत में कमी आई है।

Abstract

वायरस, वाइरोइड्स और बैक्टीरिया जैसे साइट्रस के ग्राफ्ट-पारगम्य, फ्लोएम-सीमित रोगजनक दुनिया भर में विनाशकारी महामारी और गंभीर आर्थिक नुकसान के लिए जिम्मेदार हैं। उदाहरण के लिए, साइट्रस ट्राइस्टेजा वायरस ने विश्व स्तर पर 100 मिलियन से अधिक साइट्रस पेड़ों को मार डाला, जबकि "कैंडिडाटस लिबिबैक्टर एशियाटिकस" ने फ्लोरिडा को $ 9 बिलियन खर्च किए हैं। पेड़ के प्रसार के लिए रोगज़नक़-परीक्षण किए गए साइट्रस बडवुड का उपयोग ऐसे रोगजनकों के प्रबंधन के लिए महत्वपूर्ण है। कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड में साइट्रस क्लोनल प्रोटेक्शन प्रोग्राम (सीसीपीपी) कैलिफोर्निया के साइट्रस की रक्षा और राष्ट्रीय स्वच्छ संयंत्र नेटवर्क को स्वच्छ प्रसार इकाइयां प्रदान करने के लिए हर साल साइट्रस बडवुड स्रोत पेड़ों से हजारों नमूनों का परीक्षण करने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) परख का उपयोग करता है। साइट्रस वायरस और वाइरोइड्स के उच्च-थ्रूपुट आणविक पहचान में एक गंभीर बाधा पौधे के ऊतक प्रसंस्करण चरण है।

पीसीआर परख में गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड और डाउनस्ट्रीम उपयोग के निष्कर्षण के लिए उचित ऊतक तैयारी महत्वपूर्ण है। न्यूक्लिक एसिड क्षरण से बचने के लिए कम तापमान पर पौधे के ऊतकों को काटना, तौलना, फ्रीज-सुखाने, पीसने और सेंट्रीफ्यूजेशन समय-गहन और श्रम-गहन है और इसके लिए महंगे और विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है। यह पेपर साइट्रस बडवुड से फ्लोएम युक्त छाल के ऊतकों को तेजी से संसाधित करने के लिए इंजीनियर किए गए एक विशेष उपकरण के सत्यापन को प्रस्तुत करता है, जिसे बडवुड ऊतक एक्सट्रैक्टर (बीटीई) नाम दिया गया है। बीटीई वर्तमान तरीकों की तुलना में नमूना थ्रूपुट को 100% तक बढ़ाता है। इसके अलावा, यह श्रम और उपकरणों की लागत को कम करता है। इस काम में, बीटीई नमूनों में एक डीएनए उपज (80.25 एनजी / μL) थी जो CCPP के हैंड-चॉपिंग प्रोटोकॉल (77.84 ng / μL) के साथ तुलनीय थी। यह उपकरण और तेजी से पौधे ऊतक प्रसंस्करण प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया में कई साइट्रस नैदानिक प्रयोगशालाओं और कार्यक्रमों को लाभान्वित कर सकता है और दुनिया भर में अन्य लकड़ी की बारहमासी फसलों के लिए ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक मॉडल प्रणाली बन सकता है।

Introduction

साइट्रस के ग्राफ्ट-पारगम्य फ्लोएम-सीमित रोगजनकों, जैसे वायरोइड्स, वायरस और बैक्टीरिया ने दुनिया के हर साइट्रस-उत्पादक क्षेत्र में विनाशकारी महामारी और गंभीर आर्थिक नुकसान का कारण बना है। साइट्रस वाइरोइड्स एक्सोकोर्टिस और कैशेक्सिया रोगों के कारण उत्पादन कारकों को सीमित कर रहे हैं जो वे आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण साइट्रस प्रकारों में पैदा करते हैं, जैसे ट्राइफोलिएट, ट्राइफोलिएट हाइब्रिड, मंदारिन, क्लेमेंटाइन और कीनू 1,2,3। कैलिफोर्निया में, ये वाइरॉइड-संवेदनशील साइट्रस प्रकार "आसान-छीलने वालों" के बढ़ते और लाभदायक बाजार का आधार हैं, जो फलों के लिए उपभोक्ताओं की प्राथमिकता में बदलाव की प्रवृत्ति के बाद हैं जो छीलने, खंडित और बीज रहित 4,5,6 हैं। इस प्रकार, साइट्रस वाइरोइड्स को कैलिफोर्निया खाद्य और कृषि विभाग (सीडीएफए) "साइट्रस नर्सरी स्टॉक कीट स्वच्छता कार्यक्रम-सीनेट बिल 140" के तहत विनियमित किया जाता है, और सीडीएफए की प्लांट पेस्ट डायग्नोस्टिक्स शाखा की प्रयोगशालाएं सालाना 7,8,9,10 हजारों साइट्रस वायरॉइड परीक्षण करती हैं।. साइट्रस ट्राइस्टेजा वायरस (सीटीवी) 1930के दशक में वैश्विक महामारी की शुरुआत के बाद से 100 मिलियन से अधिक खट्टे पेड़ों की मौत के लिए जिम्मेदार रहा है। कैलिफोर्निया में, वायरस के स्टेम थूक और ट्राइफोलिएट ब्रेकिंग प्रतिरोध आइसोलेट्स 3.6 बिलियन डॉलर के कैलिफोर्निया साइट्रस उद्योग12,13,14 के लिए एक गंभीर खतरा पैदा करते हैं। नतीजतन, सीडीएफए सीटीवी को एक विनियमित वर्ग-ए संयंत्र कीट के रूप में वर्गीकृत करता है, और सेंट्रल कैलिफोर्निया ट्रिस्टेजा उन्मूलन एजेंसी (सीसीटीईए) की प्रयोगशाला हर साल15,16 व्यापक क्षेत्र सर्वेक्षण और हजारों वायरस परीक्षण करती है। जीवाणु "कैंडिडाटस लिबिबैक्टर एशियाटिकस" (सीएलएएस) और हुआंगलोंगबिंग (एचएलबी) रोग ने साइट्रस एकड़ में 40% की कमी, साइट्रस संचालन में 57% की कमी और लगभग 8,000नौकरियों के नुकसान के परिणामस्वरूप फ्लोरिडा को लगभग 9 बिलियन डॉलर का आर्थिक नुकसान होने का अनुमान है। कैलिफोर्निया में, एचएलबी के कारण साइट्रस एकड़ में काल्पनिक 20% की कमी के परिणामस्वरूप 8,200 से अधिक नौकरियों के नुकसान और राज्य के सकल घरेलू उत्पाद में आधा बिलियन डॉलर से अधिक की कमी की भविष्यवाणी की गई थी। इसलिए, साइट्रस कीट और रोग रोकथाम कार्यक्रम कैलिफोर्निया 14,17,19,20 से सीएलए के परीक्षण, पता लगाने और उन्मूलन के लिए सर्वेक्षण ों पर सालाना $ 40 मिलियन से अधिक खर्च करता है।

साइट्रस वाइरोइड्स, वायरस और बैक्टीरिया के प्रबंधन का एक प्रमुख तत्व पेड़ के उत्पादन के लिए रोगज़नक़-परीक्षण प्रचार सामग्री (यानी, बडवुड) का उपयोग है। रोगज़नक़-परीक्षण किए गए साइट्रस बडवुड का उत्पादन और रखरखाव व्यापक संगरोध कार्यक्रमों के भीतर किया जाता है जो उन्नत रोगज़नक़ उन्मूलन और पहचान तकनीक10,21 को नियोजित करते हैं। कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड में साइट्रस क्लोनल प्रोटेक्शन प्रोग्राम (सीसीपीपी) हर साल राज्य और संयुक्त राज्य अमेरिका में आयातित खट्टे किस्मों के साथ-साथ साइट्रस बडवुड स्रोत पेड़ों से हजारों बडवुड नमूनों का परीक्षण करता है, ताकि कैलिफोर्निया के साइट्रस की रक्षा की जा सके और साइट्रस10,17,22 के लिए राष्ट्रीय स्वच्छ संयंत्र नेटवर्क के कार्यों का समर्थन किया जा सके।. साइट्रस परीक्षण की बड़ी मात्रा को संभालने के लिए, उच्च-थ्रूपुट, विश्वसनीय और लागत प्रभावी रोगज़नक़ का पता लगाने वाले परख सीसीपीपी 7,10,22 जैसे कार्यक्रमों की सफलता के लिए एक मौलिक घटक हैं।

जबकि पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) जैसे आणविक-आधारित रोगज़नक़ का पता लगाने वाले परीक्षणों ने प्लांट डायग्नोस्टिक प्रयोगशालाओं में थ्रूपुट में महत्वपूर्ण वृद्धि की अनुमति दी है, हमारे अनुभव में, उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन में सबसे महत्वपूर्ण बाधाओं में से एक पौधे के ऊतक नमूना प्रसंस्करण चरण है। यह साइट्रस के लिए विशेष रूप से सच है क्योंकि फ्लोएम युक्त ऊतकों जैसे पत्ती पेटियोल्स और बडवुड छाल के प्रसंस्करण के लिए वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल श्रम-गहन, समय लेने वाले हैं, और महंगे और विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है। इन प्रोटोकॉल को न्यूक्लिक एसिड क्षरण 8,23,24 से बचने के लिए कम तापमान पर हाथ से काटने, तौलने, फ्रीज-सुखाने, पीसने और सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, सीसीपीपी नैदानिक प्रयोगशाला में, नमूना प्रसंस्करण में (i) हाथ काटने (6-9 नमूने / h / ऑपरेटर), (ii) फ्रीज-सुखाने (16-24 घंटे), (iii) फुफ्फुसीकरण (30-60 s), और (iv) सेंट्रीफ्यूजेशन (1-2 घंटे) शामिल हैं। इस प्रक्रिया के लिए विशेष आपूर्ति (जैसे, भारी-शुल्क सुरक्षित-लॉक ट्यूब, स्टेनलेस स्टील पीसने वाली गेंद, एडेप्टर, ब्लेड, दस्ताने) और महंगे प्रयोगशाला उपकरण (जैसे, अल्ट्रा-लो फ्रीजर, फ्रीज-ड्रायर, ऊतक पुल्वराइज़र, तरल नाइट्रोजन क्रायोस्टेशन, प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज) के कई टुकड़ों की भी आवश्यकता होती है।

किसी भी उद्योग की तरह, उपकरण इंजीनियरिंग और प्रक्रियाओं का स्वचालन लागत को कम करने, थ्रूपुट बढ़ाने और उच्च गुणवत्ता वाले, समान उत्पाद और सेवाएं प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। साइट्रस उद्योग को कम लागत वाले ऊतक-प्रसंस्करण उपकरणों की आवश्यकता होती है जिन्हें संचालित करने के लिए न्यूनतम कौशल की आवश्यकता होती है और इस तरह, तेजी से डाउनस्ट्रीम रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए उच्च नमूना-प्रसंस्करण क्षमता की अनुमति देने के लिए नैदानिक प्रयोगशालाओं और क्षेत्र संचालन में स्थानांतरित करना आसान होता है। प्रौद्योगिकी विकसित समाधान (टीईएस) और सीसीपीपी ने फ्लोएम-समृद्ध साइट्रस ऊतकों (यानी, बडवुड) के तेजी से प्रसंस्करण के लिए एक कम लागत वाला (यानी, विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता को समाप्त) उपकरण विकसित किया (यानी, डिजाइन और गढ़) और मान्य (यानी, साइट्रस नमूनों के साथ परीक्षण किया और मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं की तुलना में) उपकरण विकसित किया, जिसका नाम बडवुड टिशू एक्सट्रैक्टर (बीटीई) है। जैसा कि चित्रा 1 में देखा गया है, बीटीई में बिजली और नियंत्रण के लिए एक आधार घटक शामिल है, साथ ही साइट्रस बडवुड के प्रसंस्करण के लिए एक हटाने योग्य कक्ष भी शामिल है। बीटीई कक्ष एक पीसने वाले पहिये से बना है जिसे विशेष रूप से साइट्रस बडवुड से फ्लोएम युक्त छाल के ऊतकों को स्ट्रिप करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कटा हुआ छाल ऊतक एक स्लाइड पोर्ट के माध्यम से निष्कर्षण बफर युक्त सिरिंज में तेजी से बाहर निकाला जाता है, फ़िल्टर किया जाता है, और बिना किसी अतिरिक्त हैंडलिंग या तैयारी के न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए तैयार किया जाता है (चित्रा 1)। बीटीई प्रणाली में एक पेपरलेस नमूना ट्रैकिंग एप्लिकेशन और एक एकीकृत वजन अनुप्रयोग भी शामिल है, जो वास्तविक समय में ऑनलाइन डेटाबेस में नमूना प्रसंस्करण जानकारी रिकॉर्ड करता है।

बीटीई प्रणाली ने सीसीपीपी की प्रयोगशाला नैदानिक क्षमता में 100% से अधिक की वृद्धि की है और लगातार उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड के शुद्धिकरण और पीसीआर परख का उपयोग करके साइट्रस के ग्राफ्ट-पारगम्य रोगजनकों का डाउनस्ट्रीम पता लगाने के लिए उपयुक्त साइट्रस ऊतक अर्क का उत्पादन किया है। अधिक विशेष रूप से, बीटीई ने ऊतक प्रसंस्करण के लिए समय को प्रति नमूना 24 घंटे से ~ 3 मिनट तक कम कर दिया है, $ 60,000 से अधिक की लागत वाले प्रयोगशाला उपकरणों को बदल दिया है (चित्रा 2, चरण 2-4), और बड़े नमूना आकारों के प्रसंस्करण के लिए अनुमति दी है।

यह पेपर स्रोत पेड़ों से साइट्रस बडवुड नमूनों के साथ बीटीई उच्च-थ्रूपुट साइट्रस छाल ऊतक प्रसंस्करण, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और रोगज़नक़ का पता लगाने के सत्यापन डेटा को प्रस्तुत करता है, जिसमें क्रमशः सीसीपीपी रुबिडौक्स संगरोध सुविधा और लिंडकोव फाउंडेशन सुविधा से सभी उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं। हम वर्तमान प्रयोगशाला प्रक्रिया (चित्रा 2) की तुलना में थ्रूपुट और प्रसंस्करण समय परिवर्तन भी प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, यह काम साइट्रस रोगज़नक़ परीक्षण प्रयोगशालाओं के लिए एक विस्तृत, चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है और दर्शाता है कि बीटीई रोगज़नक़-स्वच्छ नर्सरी स्टॉक, सर्वेक्षण और उन्मूलन कार्यक्रमों के कार्यों का समर्थन कैसे कर सकता है।

Figure 1
चित्र 1: बडवुड ऊतक निकालने वाला। बीटीई में बिजली और नियंत्रण के लिए एक आधार घटक शामिल है, साथ ही साइट्रस बडवुड के प्रसंस्करण के लिए एक हटाने योग्य कक्ष भी शामिल है। बीटीई कक्ष एक पीसने वाले पहिये से बना है जिसे विशेष रूप से साइट्रस बडवुड से फ्लोएम युक्त छाल के ऊतकों को स्ट्रिप करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कटा हुआ छाल ऊतक एक स्लाइड पोर्ट के माध्यम से एक सिरिंज में तेजी से बाहर निकाला जाता है, फ़िल्टर किया जाता है, और बिना किसी अतिरिक्त हैंडलिंग या तैयारी के न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए तैयार किया जाता है। संक्षिप्त नाम: बीटीई = बडवुड ऊतक एक्सट्रैक्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पारंपरिक हाथ काटने वाली प्रयोगशाला प्रक्रिया और बीटीई प्रसंस्करण के बीच चरण-दर-चरण तुलना। बीटीई प्रसंस्करण में उच्च-थ्रूपुट साइट्रस छाल ऊतक प्रसंस्करण, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और रोगज़नक़ का पता लगाना शामिल है। प्रत्येक चरण के लिए समय को कोष्ठक में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

1. जहाज करने के लिए साइट्रस बडवुड नमूने एकत्र करना

  1. प्रौद्योगिकी विकसित समाधान भेजें ताकि वे अपने वेब सर्वर में लोड करने के लिए पेड़ की जानकारी की एक स्प्रेडशीट भेज सकें (आखिरकार, उपयोगकर्ता नए पेड़ बनाएगा)।
  2. एक पेड़ का चयन करने के लिए फोन ऐप टीईएस ट्रैकर का उपयोग करें, और टैग पर पेड़ की जानकारी लोड करने के लिए फोन पर एक निकट-क्षेत्र संचार (एनएफसी) कॉलर टैग रखें।
  3. बीटीई-संगत प्लास्टिक बैग वाहक में तीन से चार साइट्रस बडवुड नमूने डालें, और ढक्कन के साथ बंद करें।
    1. सुनिश्चित करें कि बडवुड की लंबाई 8 इंच से अधिक नहीं है और 5 इंच से कम नहीं है।
      1. यदि लंबाई 8 इंच से अधिक है, तो इसे छोटा करने के लिए 10% ब्लीच समाधान (1% सोडियम हाइपोक्लोराइट) से दूषित बाँझ डिस्पोजेबल रेजर ब्लेड या छंटाई कतरनी का उपयोग करें।
      2. यदि लंबाई 5 इंच से कम है, तो बैग में डालने के लिए एक अलग बडवुड नमूना एकत्र करें।
    2. सुनिश्चित करें कि किसी भी एक्सिलरी वृद्धि या बड़े कांटों को हाथ से या 10% ब्लीच-सैनिटाइज्ड कटिंग टूल (1% सोडियम हाइपोक्लोराइट) का उपयोग करके हटा दिया जाता है।
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है ताकि कक्ष के उद्घाटन में बडवुड को पैंतरेबाज़ी करना आसान हो।
    3. सुनिश्चित करें कि कोई बडवुड नमूने नहीं हैं जिनमें घुमावदार विशेषताएं हैं। यदि वे ऐसा करते हैं, तो उन्हें 10% ब्लीच-सैनिटाइज्ड कटिंग टूल (1% सोडियम हाइपोक्लोराइट) का उपयोग करके हटा दें, और बीटीई बैग में केवल नमूने के सीधे हिस्से रखें।
      नोट: घुमावदार बडवुड को उपकरण में पैंतरेबाज़ी करना बहुत मुश्किल है, जिसके परिणामस्वरूप असमान छाल स्ट्रिपिंग होती है।
  4. पेड़ के एनएफसी कॉलर टैग को स्कैन करने के लिए फोन ऐप टीईएस ट्रैकर का उपयोग करें और इसे नमूना बैग पर एनएफसी क्लिप टैग के साथ लिंक करें।
  5. बडवुड की मोटाई पर ध्यान दें क्योंकि यह निर्धारित करता है कि ऑपरेटर बीटीई कक्ष के अंदर फ्लोएम युक्त बडवुड छाल को कैसे छीन लेगा।
    1. यदि बडवुड की मोटाई 0.20 इंच से कम है, तो बडवुड को अलग करते समय सावधान रहें क्योंकि कक्ष में उच्च वेग वाले कताई धागे पूरे बडवुड को छाल की परत से परे और लकड़ी और पिथ के गैर-फ्लोएम-समृद्ध ऊतकों में बदल देंगे।
    2. मोटी बडवुड का चयन करें क्योंकि गैर-फ्लोएम युक्त बडवुड ऊतकों से बचते हुए छाल के ऊतकों को स्ट्रिप करना आसान है।
  6. नमूने को कुछ आइस पैक के साथ एक इंसुलेटेड शिपिंग कंटेनर में रखें।

2. फ्यूम हुड में सेटअप

नोट: बीटीई को फ्यूम हुड के अंदर संचालित करना पसंद किया जाता है। यह पौधे के ऊतकों के क्रॉस-संदूषण और प्रयोगशाला संदूषण के जोखिम को कम करेगा।

  1. 10% (1% सोडियम हाइपोक्लोराइट) स्प्रे बोतल का उपयोग करके कीटाणुरहित करें।
    1. हुड की सतह को स्प्रे करें, और ब्लीच को पेपर टॉवल से पोंछने से पहले लगभग 1 मिनट तक बैठने दें।
    2. ब्लीच घोल के साथ एक पेपर तौलिया स्प्रे करें। टीई बेस, वजन स्केल घटकों (स्केल, एयर शील्ड और टॉवर), और एक मार्कर पेन को पोंछें।
  2. संसाधित किए जाने वाले नमूनों की संख्या के लिए एक सिरिंज सेट को अनरैप करें, और उन्हें एक कवर कार्डबोर्ड बॉक्स के अंदर रखें।
  3. जरूरत पड़ने पर हुड के बाहर स्वैब का एक पैक उपलब्ध है।
  4. वजन का पैमाना तैयार करें।
    1. स्केल से वजन टॉवर को हटा दें, और इसे चालू करने के लिए पावर बटन दबाए रखें। स्केल 0 प्रदर्शित होने के बाद टॉवर को स्केल के केंद्र में रखें।
    2. स्केल के सामने वेट स्केल एयर शील्ड को स्लाइड करें।
  5. पीठ पर स्विच को फ्लिप करके ऊतक निकालने वाला आधार तैयार करें। सुनिश्चित करें कि बॉक्स के बाईं ओर स्विच शीर्ष पर नीचे दबाया गया है। एक ब्लिंकिंग ग्रीन एलईडी की प्रतीक्षा करें, जो इंगित करता है कि कक्ष तैयार है।

3. सफाई स्टेशनों की स्थापना करें (पूरक चित्रा एस 1)।

  1. अल्ट्रासोनिक क्लीनर में 1 लीटर पानी रखें।
  2. अल्ट्रासोनिक क्लीनर के शीर्ष पर दो कचरा बैग लपेटें।
  3. अल्ट्रासोनिक क्लीनर में ~ 5 लीटर 10% ब्लीच (1% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान) डालें।
  4. एक कक्ष को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त पानी के साथ पानी के टब को भरें।
  5. एयर कंप्रेसर चालू करें और वाल्व खोलें।
  6. कक्ष सूखने के दौरान तरल को पकड़ने के लिए एक पृष्ठभूमि सेट करें।

4. साइट्रस बडवुड छाल स्ट्रिपिंग के लिए बीटीई के लिए सामग्री को संसाधित करना।

  1. कक्ष को बीटीई बेस पर लोड करें।
    1. बीटीई चैंबर तैयार करें।
      1. कक्ष के पीछे एक खाली नमूना बैग संलग्न करें। खाली बैग को बीटीई कक्ष के बैक नोजल में सुरक्षित करने के लिए दो ओ-रिंग का उपयोग करें।
      2. टूटने या क्षति के संकेतों के लिए ब्लेड का निरीक्षण करें, जैसे कि ब्लेड पर बनने वाले कट जहां यह प्लास्टिक में जारी रहता है या नोक पर कट बनता है। सुनिश्चित करें कि ब्लेड पर तीर एकल लॉक प्रतीक के साथ पंक्तिबद्ध है।
      3. सुनिश्चित करें कि कक्ष के तल पर हवा की रिहाई ओ प्रतीक की ओर मुड़ ी हुई है। कक्ष खोलने के ऊपर स्पष्ट ढक्कन रखें, और कक्ष के दाईं ओर ट्रैक का उपयोग करके स्पष्ट बीटीई स्लाइड को कक्ष पर स्लाइड करें। लॉक को चैंबर के निचले हिस्से में जहां तक यह स्लाइड में जा सकता है, धक्का दें। सुनिश्चित करें कि प्लंजर कैप स्लाइड के शीर्ष पर लगाया गया है।
    2. बीटीई बेस पर कक्ष को बीटीई आधार पर रखें, जिसमें बीटीई बेस का नोजल कक्ष के पीछे फैला हुआ है। नीले एलईडी के पलक झपकने की प्रतीक्षा करें, यह दर्शाता है कि प्लेसमेंट सफल है।
  2. एनएफसी क्लिप टैग पर सफेद स्टिकर को बॉक्स के दाईं ओर जेड में ले जाकर बीटीई बेस पर नमूना लोड करें। टैग को जेड पर धीमी गोलाकार गति में तब तक ले जाएं जब तक कि पीली रोशनी झपकना शुरू न हो जाए। नमूने को बीटीई बेस में संलग्न करें, और सुनिश्चित करें कि नमूना बैग में कोई छेद नहीं है; यदि कोई छेद है, तो इसे टेप के साथ पैच करें। बीटीई नोजल के सामने सुरक्षित करने के लिए नमूना बैग पर ओ-रिंग रखें।
  3. अप्रयुक्त सिरिंज सेट लोड करें।
    1. सिरिंज सेट को टार करें। अप्रयुक्त सिरिंज सेट को वजन स्केल टॉवर पर रखें। जब लाल बत्ती चमकने लगे या स्केल 0 प्रदर्शित होने लगे तो सिरिंज सेट को हटा दें।
    2. फिल्टर के साथ सिरिंज से प्लंजर निकालें। सुनिश्चित करें कि तरल पदार्थ नीचे (गैर-फ़िल्टर) सिरिंज में है। प्लंजर को एक पेपर टॉवल पर या टॉवर पर रखें जहां ब्लैक प्लंजर किसी भी सतह को छू नहीं रहा है।
    3. सिरिंज में निकास पोर्ट दबाकर और 90 ° मोड़कर सिरिंज को स्लाइड एग्जिट पोर्ट से संलग्न करें।
  4. बडवुड नमूने की प्रक्रिया करें।
    चेतावनी: बीटीई में उच्च वेग वाले चलती भाग होते हैं। सभी ऑपरेशन एक फ्यूम हुड के अंदर होने की जरूरत है। सभी उपयोगकर्ताओं को सुरक्षात्मक चश्मा, एरमुफ (ईयरप्लग), और अन्य सभी व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई), जैसे दस्ताने और लैब कोट का उपयोग करना चाहिए।
    1. मशीन को शुरू करने के लिए शीर्ष काला बटन दबाएं। प्रसंस्करण के दौरान किसी भी समय मोटर को रोकने के लिए दूसरी बार दबाएं।
      नोट: बॉक्स में गति और तापमान संवेदन है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह ठीक से काम करता है।
    2. बैग के माध्यम से एक बडवुड स्टिक पकड़ें, और इसे बीटीई नोजल के शीर्ष के माध्यम से रखें।
    3. दूसरे हाथ से कक्ष के दूसरी ओर बडवुड स्टिक को पकड़ें, और धीरे-धीरे ब्लेड में नीचे की ओर जाएं। एक कोमल गूंजने वाली ध्वनि के लिए सुनें जो यह दर्शाता है कि बडवुड को इसकी छाल से हटाया जा रहा है। धीरे-धीरे बडवुड को घुमाते हुए आगे और पीछे ले जाएं।
      1. यदि एक तेज, आक्रामक चॉपिंग ध्वनि सुनाई देती है, तो जल्दी से शाखा को शीर्ष पर ले जाएं और / या मोटर को रोकने के लिए शीर्ष बटन दबाएं। मोटर को रोकने के लिए, प्रसंस्करण समाप्त करने के लिए दाईं ओर स्विच का उपयोग करें (चरण 4.4.3.2 देखें)।
      2. यदि काटने पर निकास से कोई सामग्री नहीं निकल रही है, तो कक्ष में एक क्लॉग है। मोटर बंद करें, स्लाइड प्लंजर कैप को हटा दें, और मशीन के निकास को बाहर धकेलने के लिए स्वैब के प्लास्टिक का उपयोग करें। प्रसंस्करण समाप्त करने के लिए दाईं ओर स्विच का उपयोग करें: अप = फॉरवर्ड कटिंग; मध्य = मोटर बंद; नीचे = रिवर्स कटिंग।
    4. शेष शाखाओं के लिए चरण 4.4.2 और चरण 4.4.3 दोहराएँ।
      नोट: एक सामान्य संकेतक है कि पर्याप्त बडवुड छाल छीन ली गई है जब सिरिंज का 25% पौधे के ऊतकों से भर गया है। साइट्रस के ग्राफ्ट-पारगम्य रोगजनकों को पेड़ में असमान रूप से वितरित किया जा सकता है। इसलिए, साइट्रस ट्री कैनोपी के आसपास से तीन से चार बडवुड के नमूने एकत्र किए जाते हैं। बीटीई वाहक बैग में प्रत्येक बडवुड नमूने के लिए यह महत्वपूर्ण है कि अंतिम ग्राउंड ऊतक नमूने में योगदान करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि रोगजनकों के लिए एक पूर्ण पेड़ प्रतिनिधि नमूना का परीक्षण किया जाएगा।
    5. प्रसंस्करण को रोकने के लिए शीर्ष काला बटन दबाएं। प्रकाश को फिर से पीला चमकना शुरू करने की प्रतीक्षा करें।
  5. नमूना वजन की जाँच करें।
    1. सिरिंज को 90 ° घुमाएं, और इसे अलग करने के लिए नीचे खींचें। प्लंजर को वापस सिरिंज पर रखें, और सिरिंज को टॉवर पर रखें।
    2. नमूने का स्वत: पता लगाने के लिए पैमाने की प्रतीक्षा करें, और निर्धारित करें कि क्या यह उचित वजन सीमा (0.25 ± 0.05 ग्राम) के भीतर है। यदि नमूना वजन बहुत कम है (<0.20 ग्राम), तो चरण 4.4 दोहराएं; लाल एलईडी पलक झपकना शुरू कर देगा। यदि नमूना वजन बहुत अधिक है (>0.30 ग्राम), तो कुछ नमूना सामग्री को हटा दें; पीला एलईडी अधिक धीरे-धीरे झपकना शुरू कर देगा। यदि नमूना सीमा के भीतर है, तो हरे रंग की एलईडी पलक झपकना शुरू कर देगी।
  6. बडवुड नमूने को समरूपबनाना।
    1. नमूने के साथ सिरिंज से प्लंजर निकालें, तरल पदार्थ को नमूने के साथ सिरिंज में धक्का दें, और प्लंजर को फिर से जोड़ें। प्लंजर बफर और पौधे के रस को जाल फिल्टर के माध्यम से (किसी भी बड़े छाल ऊतक के टुकड़ों को रोककर) और रबर टयूबिंग के माध्यम से खाली सिरिंज में धकेलता है।
    2. बफर और पौधे के रस को एक सिरिंज से दूसरे सिरिंज में आगे और पीछे धकेलकर नमूने को मिलाएं। ~ 3x-4x दोहराएं और जब तक नमूना एक सजातीय हरे रंग का तरल मिश्रण न बन जाए।
    3. एक बार अच्छी तरह से होमोजिनाइज़ होने के बाद, पौधे के सैप के नमूने को जाल फिल्टर के बिना सिरिंज में धक्का दें, और नमूने के साथ सिरिंज से फ़िल्टर के साथ रबर ट्यूबिंग और सिरिंज को अलग करें।
    4. सिरिंज से पौधे के रस के नमूने को 2 एमएल बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निष्कासित करें, और आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बैग नंबर के साथ नमूना लेबल करने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें।
      नोट: चरण 4.6.5 से पौधे के नमूने के सैप को अब किसी भी उपलब्ध न्यूक्लिक एसिड, आरएनए या डीएनए, फिनोल-क्लोरोफॉर्म, सिलिका कॉलम, या चुंबकीय मोतियों 9,25,26,27 पर आधारित निष्कर्षण विधियों के साथ न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए संसाधित किया जा सकता है (चरण 7 देखें) और साइट्रस के ग्राफ्ट-पारगम्य रोगजनकों का डाउनस्ट्रीम पता लगाना (चरण 8 देखें)।

5. बीटीई हटाने योग्य कक्ष को साफ करना

सावधानी: यदि सिरिंज सेट से बफर कक्ष या स्लाइड पर जाता है, तो सफाई से पहले प्रयोगशाला के सभी सुरक्षा नियमों का पालन करें। सिरिंज सेट में गुआनिडाइन थायोसाइनेट होता है। यदि सिरिंज सेट से बफर ब्लीच के संपर्क में आता है, तो यह साइनाइड गैस बनाएगा।

  1. कक्ष में 10 वें नमूने को संसाधित करने के बाद निम्नलिखित चरणों का पालन करें। ध्यान दें कि हरे रंग की एलईडी नीली पलक झपकने के बजाय पलक झपकना जारी रखेगी।
  2. सभी संभावित दूषित पदार्थों को साफ करने के लिए बीटीई कक्ष को अलग करें; स्पष्ट प्लास्टिक कवर को हटा दें, कक्ष स्लाइड को साफ़ करें, और कक्ष स्लाइड पर क्लॉग पोर्ट को साफ़ करें।
  3. कक्ष के निचले भाग पर हवा रिलीज वाल्व को खुली स्थिति (खुले पैडलॉक मार्क) में घुमाएं। चैंबर घटकों को सेट-अप अल्ट्रासोनिक क्लीनर में रखें (चरण 3.1 देखें)। इसे तैरने से रोकने के लिए चैंबर के नीचे ढक्कन रखें। 15 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक क्लीनर चलाएं।
    नोट: अल्ट्रासोनिक सफाई स्नान (5 एल) दो कक्षों तक पकड़ सकता है।
  4. कम से कम 30 सेकंड के लिए पानी के स्नान (चरण 3.4) में कक्ष घटकों को कुल्ला करें। कक्ष घटकों को सुखाने स्टेशन पर ले जाएं।
    चेतावनी: सुखाने से कक्ष के भीतर तेजी से चलने वाले भागों, जोर से शोर (~ 85 डेसिबल [डीबी]), और संभावित छींटे होंगे। सभी उपयोगकर्ताओं को सुरक्षात्मक चश्मा, एरमुफ (ईयरप्लग), लैब कोट और अन्य सभी पीपीई का उपयोग करना चाहिए जैसा कि ऑपरेटिंग प्रयोगशाला के सुरक्षा नियमों द्वारा आवश्यक है।
  5. बीटीई कक्ष को सुखाएं।
    1. एयर गन को कक्ष के ऊपरी उद्घाटन के खांचे के अनुरूप रखें (जहां स्लाइड आमतौर पर होगी)। ~ 30 सेकंड के लिए हवा देने के लिए बंदूक का ट्रिगर दबाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि उद्घाटन पृष्ठभूमि की ओर उपयोगकर्ता से दूर है। इसके नीचे फंसे तरल को हटाने के लिए ब्लेड सेट को स्पिन करना चाहिए।
    2. एयर गन को कक्ष के शीर्ष नलिका की ओर रखें। एयर गन के ट्रिगर को दबाएं, और धीरे-धीरे प्रत्येक नोजल प्रवेश द्वार के तीन पूर्ण सर्कल का पता लगाएं।
    3. एयर गन को बीटीई के केंद्र में रखें। सबसे भीतरी बिंदु से शुरू करते हुए, ट्रिगर को नीचे रखें, और तब तक आगे बढ़ें जब तक कि एयर गन उस ओर इशारा न करे जहां स्लाइड होगी।
    4. सतह के पानी को बाहर से निकालने के लिए, पूरे कक्ष पर हवा चलाएं, सामने और पीछे।
  6. बीटीई स्लाइड को सुखाएं।
    1. एयर गन को स्लाइड के प्लंजर स्लॉट में रखें, और स्लाइड निकास से पानी निकालने के लिए ट्रिगर दबाएं।
    2. इसे सुखाने के लिए स्लाइड की आंतरिक सतह के साथ एक एयर गन चलाएं।
    3. पानी को बाहर धकेलने के लिए स्लाइड ग्रूव के साथ एक एयर गन चलाएं।
    4. सतह के पानी को बाहर निकालने के लिए पूरे बाहरी हिस्से पर जल्दी से हवा चलाएं।
  7. घटकों को सुखाएं।
    1. हाथ में स्लाइड प्लंजर कैप और ओ-रिंग्स पकड़ें, और ट्रिगर दबाएं।
    2. ढक्कन की आंतरिक सतह पर एक एयर गन चलाएं।
    3. घटकों को कक्ष में रखें और उन्हें सूखने या फिर से इकट्ठा करने के लिए स्लाइड करें।
      नोट: कई कार्यात्मक बीटीई के साथ एक उच्च ऊतक-प्रसंस्करण वातावरण के लिए, एक बैच सैनिटाइजिंग सिस्टम प्रदान किया जा सकता है जो एक साथ 10 कक्षों को दूषित करने में सक्षम है।

6. निपटान और स्वच्छता

  1. निर्दिष्ट गुआनिडाइन अपशिष्ट कंटेनर में सिरिंज और रबर टयूबिंग का निपटान करें।
  2. जैव खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में किसी भी पौधे सामग्री का निपटान करें।
  3. बीटीई बेस से बीटीई कक्ष को हटा दें।
  4. बीटीई कक्ष को अलग करें और चरण 5 में वर्णित के रूप में उनके परिशोधन के लिए आगे बढ़ें।

7. ऊतक प्रसंस्करण और बीटीई साइट्रस बडवुड अर्क से शुद्ध आरएनए की गुणवत्ता का आकलन

नोट: इस प्रोटोकॉल में, हमने साइट्रस बडवुड ऊतक प्रसंस्करण के लिए आवश्यक समय और बीटीई (चित्रा 2, दाईं ओर, चरण 1, चरण 5, और चरण 6) द्वारा तैयार छाल ऊतक अर्क से शुद्ध आरएनए की गुणवत्ता की तुलना करने के लिए 255 साइट्रस बडवुड के नमूनों का उपयोग किया। छाल के ऊतकों के फ्रीज-सुखाने, फुफ्फुसीकरण और सेंट्रीफ्यूजेशन, जैसा कि डैंग एट अल .23 (चित्रा 2, बाईं ओर, चरण 1-6) द्वारा वर्णित है।

  1. वर्तमान प्रयोगशाला प्रक्रिया: नियामक रूप से अनुमोदित विधि23 के अनुसार ऊतक प्रसंस्करण के लिए बडवुड नमूने तैयार करें।
    1. छाल के ऊतकों को हाथ से छीलने और काटने, फ्रीज-सुखाने, फुफ्फुसीकरण, सेंट्रीफ्यूजेशन और पौधे के रस को आरएनए निष्कर्षण ट्यूब में स्थानांतरित करना, जैसा कि डैंग एट अल 23 (चित्रा 2, बाईं ओर, चरण 1-6) द्वारा वर्णित है।
    2. प्रत्येक परीक्षण किए गए पेड़ से तीन से चार बडवुड नमूनों को हाथ से छीलने के बाद, सभी बडवुड को बीटीई-संगत प्लास्टिक बैग वाहक के अंदर रखें, और बीटीई प्रसंस्करण (चरण 7.2) तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. बीटीई प्रक्रिया: बीटीई साइट्रस बडवुड ऊतक प्रसंस्करण शुरू करें (खंड 4, चरण 4.1-4.6; चित्र 2, दाईं ओर, चरण 1, चरण 5, और चरण 6)।
    1. चरण 7.1.2 से बीटीई वाहक बैग के अंदर संग्रहीत बडवुड नमूने का उपयोग करें।
  3. नियामक रूप से अनुमोदित अर्ध-स्वचालित चुंबकीय मोती-आधारित विधि 8,23,28 का उपयोग करके वर्तमान प्रयोगशाला प्रक्रिया (चरण 7.1.1) और बीटीई प्रक्रिया (चरण 7.2.2) से प्राप्त पौधे के रस से आरएनए को निकालें और शुद्ध करें।
  4. इसकी एकाग्रता, शुद्धता और अखंडता 8,23,24,29,3 3,31 को मापकर आरएनए गुणवत्ता का आकलन करें।
    1. एकाग्रता की गणना करने के लिए, 260 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री और ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) का उपयोग करें।
    2. शुद्धता का आकलन करने के लिए, 260/280 के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ओडी अनुपात का उपयोग करें।
    3. अखंडता की जांच करने के लिए, एनएडीएच डिहाइड्रोजनेज साइट्रस जीन24,32 के एमआरएनए को लक्षित करने वाली रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) प्रतिक्रिया का उपयोग करें।

8. बीटीई साइट्रस बडवुड अर्क से शुद्ध आरएनए का उपयोग करके साइट्रस वायरस और वाइरोइड के क्रॉस-संदूषण और पता लगाने का आकलन

नोट: इस प्रोटोकॉल में, हमने बीटीई द्वारा संसाधित किए जाने पर नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण की क्षमता का आकलन करने के लिए 72 गैर-संक्रमित साइट्रस पेड़ों और वायरस और वाइरोइड्स से संक्रमित एक पेड़ मिश्रण से बडवुड नमूनों का उपयोग किया और बीटीई द्वारा तैयार छाल ऊतक अर्क से शुद्ध आरएनए की उपयुक्तता का आकलन किया ताकि साइट्रस वायरस और वाइरोइड्स के आरटी-क्यूपीसीआर का पता लगाने के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सके।

  1. पहला बीटीई नमूना प्रसंस्करण: 72 गैर-संक्रमित नमूनों के साथ एक आधारभूत प्रयोग करें।
    1. तीन (ए-सी) बीटीई कक्ष (चरण 4.1.1) तैयार करें।
    2. बीटीई वाहक बैग में सभी गैर-संक्रमित साइट्रस बडवुड नमूने (1-72) तैयार करें, और प्रत्येक नमूने के लिए एक सिरिंज प्रणाली (चरण 2.4) के साथ दो-सिरिंज बीटीई नमूना संग्रह प्रणाली में एक समान संख्या (72) तैयार करें।
    3. नमूना वाहक बैग और नमूना संग्रह सिरिंज को 12 नमूनों के छह बैचों (I-VI) में अलग करें।
    4. नीचे दिए गए अनुक्रम (चरण 8.1.4.1-8.1.4.6) का पालन करते हुए बीटीई साइट्रस बडवुड ऊतक प्रसंस्करण (चरण 4) शुरू करें ( तालिका 1, पहला बीटीई नमूना प्रसंस्करण देखें)।
      1. नमूने 1-12 के लिए, कक्ष ए का उपयोग करके 12 नमूने संसाधित करें। नमूना 12 (चरण 5) के बाद कक्ष ए को साफ करें।
      2. नमूने 13-24 बैच के लिए, कक्ष बी का उपयोग करके 12 नमूने संसाधित करें। नमूना 24 (चरण 5) के बाद कक्ष बी को साफ करें।
      3. नमूने 25-36 बैच III के लिए, कक्ष C का उपयोग करके 12 नमूने संसाधित करें। नमूना 36 (चरण 5) के बाद कक्ष C को साफ करें।
      4. नमूने 37-48 बैच के लिए, सैनिटाइज्ड चैंबर ए (चरण 8.1.4.1) का उपयोग करके 12 नमूनों को संसाधित करें।
      5. नमूने 49-60 के लिए, सैनिटाइज्ड चैंबर बी (चरण 8.1.4.2) का उपयोग करके 12 नमूने संसाधित करें।
      6. नमूने 60-72 बैच VI के लिए, सैनिटाइज्ड चैंबर सी (चरण 8.1.4.3) का उपयोग करके 12 नमूने संसाधित करें।
    5. चरण 8.2 पर उपयोग होने तक सभी नमूनों के साथ बीटीई वाहक बैग को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. नियामक रूप से अनुमोदित अर्ध-स्वचालित चुंबकीय मोती-आधारित विधि 8,23,28 का उपयोग करके चरण 8.1.4.1-8.1.4.6 में उत्पन्न 72 पौधों के सैप नमूनों से आरएनए को निकालें और शुद्ध करें।
    7. साइट्रस वायरस और वाइरोइड ्स का पता लगाने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर करें, जैसा कि पहले वर्णित 8,33 है।
  2. दूसरे बीटीई नमूना प्रसंस्करण के लिए, 70 गैर-संक्रमित नमूनों और दो मिश्रित संक्रमित नमूनों के साथ एक क्रॉस-संदूषण प्रयोग करें।
    1. तीन (ए-सी) बीटीई कक्ष (चरण 4.1.1) तैयार करें।
    2. दो संक्रमित नमूनों की कुल संख्या के लिए दो बीटीई वाहक बैग (चरण 1.3) में मिश्रण-संक्रमित साइट्रस बडवुड नमूना (73) तैयार करें।
    3. कुल 70 गैर-संक्रमित नमूनों के लिए नमूना 3-बैच I और नमूना 51-बैच V (चरण 8.2.4 में नमूना प्रतिस्थापन देखें) को छोड़कर, चरण 8.1.5 से गैर-संक्रमित साइट्रस बडवुड नमूनों के साथ बीटीई वाहक बैग इकट्ठा करें।
    4. बैच I में नमूना 3 के स्थान पर मिश्रित-संक्रमित नमूने 73 के साथ पहला बीटीई वाहक बैग और बैच V में नमूना 51 के स्थान पर दूसरा 72 नमूनों के लिए शामिल करें।
    5. प्रत्येक नमूने (चरण 2.4) के लिए एक डबल-सिरिंज प्रणाली के साथ, दो-सिरिंज बीटीई नमूना संग्रह प्रणाली में एक समान संख्या (72) तैयार करें।
    6. 72 नमूना वाहक बैग और नमूना संग्रह सिरिंज को 12 नमूनों के छह बैचों (I-VI) में अलग करें।
    7. बीटीई साइट्रस बडवुड ऊतक प्रसंस्करण (चरण 4) शुरू करें, चरण 8.1.4.1-8.1.4.6 के समान अनुक्रम का पालन करें।
      नोट: एकमात्र अंतर बैच I में नमूना 3 और बैच V में नमूना 51 का प्रतिस्थापन संक्रमित नमूना 73 (चरण 8.2.4) (तालिका 1, दूसरा बीटीई नमूना प्रसंस्करण) के साथ है।
    8. चरण 8.1.6 के रूप में चरण 8.2.7 में उत्पन्न 72 पौधों के सैप नमूनों से आरएनए को निकालें और शुद्ध करें।
    9. चरण 8.1.7 के रूप में साइट्रस वायरस और वाइरोइड का पता लगाने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर करें।

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Representative Results

बीटीई-संसाधित बडवुड साइट्रस ऊतक का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण, शुद्धिकरण और गुणवत्ता और ऊतक प्रसंस्करण के लिए समय का आकलन
हमने बीटीई बनाम मानक प्रक्रिया से आरएनए गुणवत्ता की तुलना करने के लिए इस परीक्षण के लिए 255 प्रतिनिधि साइट्रस पेड़ों से बडवुड के नमूनों का उपयोग किया। नमूने बडवुड ऊतक एक्सट्रैक्टर (बीटीई) (प्रोटोकॉल चरण 4.1-4.6 और चित्रा 2, दाईं ओर, चरण 1, चरण 5, और चरण 6) द्वारा संसाधित किए गए थे या नियामक रूप से अनुमोदित साइट्रस बडवुड ऊतक प्रसंस्करण विधि का पालन करके तैयार किए गए थे, जो हाथ छीलने और काटने, फ्रीज-सुखाने, फुफ्फुस, और छाल ऊतक के सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करता है, जैसा कि डैंग एट अल 23 (चित्रा 2) द्वारा वर्णित है। बाईं ओर, चरण 1-6)।

साइट्रस ऊतक प्रसंस्करण के लिए पारंपरिक हाथ-चॉपिंग और प्रयोगशाला उपकरण प्रोटोकॉल के साथ बीटीई की साइड-बाय-साइड तुलना से पता चला कि निकाले गए न्यूक्लिक एसिड की गुणवत्ता (यानी, एकाग्रता, शुद्धता और अखंडता) और साइट्रस रोगजनकों (डेटा नहीं दिखाया गया) के पीसीआर का पता लगाने के लिए डाउनस्ट्रीम उपयोग के लिए उपयुक्तता तुलनीय थी। उसी समय, टीई / बीटीई प्रणाली का उपयोग करके नमूने प्रसंस्करण में बिताए गए समय को काफी कम कर दिया गया था। बीटीई ने सीसीपीपी प्रयोगशाला के नमूना थ्रूपुट को दोगुना से अधिक कर दिया, श्रम और प्रयोगशाला उपकरण की लागत को कम करके हजारों डॉलर के उपकरणों की आवश्यकता को समाप्त कर दिया, जैसे कि बीड्स बीटर, सेंट्रीफ्यूज और क्रायोस्टेशन।

बीटीई के साथ निकाले गए न्यूक्लिक एसिड की औसत सांद्रता 76.96 एनजी/μएल ± 26.23 एनजी/μएल (एन = 181) थी और कम प्रोटीन संदूषण (A260/A280 2.27 ± 0.17, n = 181) (चित्रा 3B, C) के साथ उच्च शुद्धता के थे। ये मान CCPP के मानक मैनुअल प्रोटोकॉल (एकाग्रता: 82.25 ng/μL ± 33.95 ng/μL, n = 181 और A260/A280 2.22 ± 0.10, n = 181) द्वारा उत्पादित न्यूक्लिक एसिड के बराबर थे (चित्रा 3B, C)। न्यूक्लिक एसिड अखंडता (साइट्रस जीन एनएडी 5 के लिए आरटी-क्यूपीसीआर) बीटीई (सीक्यू 20.97 ± 2.26, एन = 181) और मानक मैनुअल सीसीपीपी प्रोटोकॉल (सीक्यू 19.25 ± 1.53, एन = 181) (चित्रा 3 ए) के लिए बहुत समान थी। परिणामों ने यह भी प्रदर्शित किया कि बीटीई उपकरण पारंपरिक विधि की तुलना में एक ही समय सीमा में उच्च नमूना मात्रा को संसाधित कर सकता है। पारंपरिक प्रयोगशाला प्रक्रिया में प्रति नमूना हाथ काटने के लिए ~ 7-10 मिनट और ऊतक प्रसंस्करण (फ्रीज-सुखाने, पीसने और सेंट्रीफ्यूज) के लिए कुल 12 मिनट की आवश्यकता होती है, जबकि बीटीई प्रति नमूना ~ 3 मिनट में न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए साइट्रस ऊतक को संसाधित कर सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: 181 प्रतिनिधि साइट्रस बडवुड नमूनों के न्यूक्लिक एसिड अर्क की गुणवत्ता, जैसा कि एकाग्रता, शुद्धता और अखंडता द्वारा परिभाषित किया गया है। नमूने बीटीई और पारंपरिक हाथ काटने और प्रयोगशाला उपकरण प्रोटोकॉल द्वारा संसाधित किए गए थे। (ए) न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता 260 एनएम पर अवशोषण का उपयोग करके निर्धारित की गई थी; (बी) शुद्धता 260 एनएम और 280 एनएम (ए 260/280) पर अवशोषण के अनुपात के रूप में निर्धारित की गई थी। (सी) एनएडीएच डिहाइड्रोजनेज (एनएडी 5) साइट्रस जीन के एमआरएनए को लक्षित करते हुए आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा न्यूक्लिक एसिड अखंडता का विश्लेषण किया गया था। इष्टतम मानों की श्रेणियों को लाल डैश्ड सर्कल के बीच इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

साइट्रस के ग्राफ्ट-पारगम्य रोगजनकों का पता लगाना, क्रॉस-संदूषण का आकलन, और बीटीई साइट्रस बडवुड अर्क से शुद्ध आरएनए का उपयोग करके साइट्रस वायरस और वाइरोइड का पता लगाना
ऊतक प्रसंस्करण विधि की वैधता का मूल्यांकन सभी स्वस्थ नमूनों के साथ-साथ 72 स्वस्थ साइट्रस बडवुड नमूनों को संसाधित करके और वायरस और वाइरोइड्स (तालिका 1 और चित्रा 4 ए, बी) से संक्रमित पेड़ मिश्रण से दो नमूनों की शुरूआत के साथ किया गया था। दोनों बैचों से निकाले गए न्यूक्लिक एसिड को पारंपरिक प्रयोगशाला-आधारित क्यू-पीसीआर के अधीन किया गया था जैसा कि पहले 8,33 वर्णित था। पहले बीटीई नमूना प्रसंस्करण से 72 स्वस्थ नमूनों में से किसी ने भी परीक्षण किए गए साइट्रस रोगजनकों (यानी, झूठे सकारात्मक) के लिए प्रवर्धन वक्र नहीं दिए (चित्रा 4 ए)। परिणाम बताते हैं कि बीटीई हाथ से काटने के तरीकों के साथ मानक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल की तुलना में साइट्रस ऊतक को समान रूप से अच्छी तरह से संसाधित कर सकता है। दूसरे बीटीई नमूना प्रसंस्करण में, हमने बीटीई प्रमुखों के बीच और एक ही बीटीई हेड (चरण 1-6) के साथ संसाधित नमूनों के भीतर क्रॉस-संदूषण की क्षमता और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए न्यूक्लिक एसिड की उपयुक्तता का आकलन किया (यानी, साइट्रस वायरस और वाइरोइड्स के आरटी-क्यूपीसीआर का पता लगाने के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग के लिए)। दो पेश किए गए मिश्रण-संक्रमित नमूनों के साथ दूसरे बीटीई नमूना प्रसंस्करण में, बीटीई प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित न्यूक्लिक एसिड का उपयोग विभिन्न साइट्रस वायरस और वाइरोइड्स (जैसे, ट्रिपलएक्स वायरस, साइट्रस लीफ ब्लॉच वायरस [सीएलबीवी], साइट्रस प्रोरोसिस वायरस [सीपीवी], साइट्रस ट्रिस्टेजा वायरस [सीटीवी]), एपस्केविरॉइड्स (साइट्रस बेंट लीफ वाइरॉइड [सीबीएलवीडी], साइट्रस ड्वार्फिंग वाइरॉइड [सीडीवीडी], साइट्रस वायरॉइड [सीवीडी-वी] का पता लगाने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था। बैच 1 और बैच 5 में साइट्रस वाइरॉइड VI [CVD-VI], और साइट्रस वाइरॉइड VII [CVD-VII]), नॉन-एप्सकैविरॉइड्स हॉप स्टंट वाइरॉइड (HSVD; hostuviroid), साइट्रस बार्क क्रैकिंग वाइरॉइड (CBCVD; cocadviroid), और साइट्रस एक्सोकोर्टिस वाइरॉइड (CEVD; pospiviroid) बैच 1 और बैच 5 में। बैच 1 और बैच 5 के भीतर, संक्रमित के बाद के नमूने उपरोक्त पौधों की बीमारियों के लिए सकारात्मक थे, लेकिन सीक्यू मान बढ़ रहे थे। हालांकि, सिर के बीच कोई क्रॉस-संदूषण का पता नहीं चला था और न ही कोई गलत सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम (चित्रा 4 बी)।

जत्था नमूना BTE पहला बीटीई दूसरा बीटीई
कक्ष नमूना प्रसंस्करण नमूना प्रसंस्करण
मैं 12-जनवरी एक 1-12 गैर-संक्रमित 1-2 और 4-12 गैर-संक्रमित
नमूना # 3 को मिश्रित संक्रमित के साथ बदल दिया जाता है।
द्वितीय 13-24 B 13-24 13-24
गैर-संक्रमित गैर-संक्रमित
III 25-36 C 25-36 25-36
गैर-संक्रमित गैर-संक्रमित
IV 37-48 ए-सैनिटाइज्ड 37-48 37-48
गैर-संक्रमित गैर-संक्रमित
V 49-60 बी-सैनिटाइज किया गया 49-60 49-50 और 52-60 गैर-संक्रमित
गैर-संक्रमित
नमूना # 51 को मिश्रित संक्रमित के साथ बदल दिया गया है।
VI 61-72 सी-सैनिटाइज किया गया 61-72 गैर-संक्रमित 61-72 गैर-संक्रमित

तालिका 1: 72 साइट्रस बडवुड नमूनों का उपयोग करके बीटीई ऊतक प्रसंस्करण विधि के सत्यापन के लिए प्रक्रिया का पालन किया गया। प्रत्येक प्रसंस्करण को दो बार दोहराया गया था। प्रत्येक में 12 नमूनों के साथ 6 बैच थे। पहले नमूना प्रसंस्करण में, सभी 72 साइट्रस बडवुड नमूने स्वस्थ थे। दूसरे बीटीई नमूना प्रसंस्करण में, नमूना 3 और नमूना 51 को बैच 1 और बैच 5 में वायरस और वाइरोइड से संक्रमित पेड़ मिश्रण से दो नमूनों के साथ बदल दिया गया था।

Figure 4
चित्रा 4: 72 साइट्रस बडवुड नमूनों का उपयोग करके बीटीई ऊतक प्रसंस्करण विधि का सत्यापन। प्रत्येक प्रसंस्करण को दो बार दोहराया गया था। प्रत्येक में 12 नमूनों के साथ 6 बैच थे। (ए) सभी 72 साइट्रस बडवुड नमूने स्वस्थ थे। (बी) बैच 1 (नमूना 3) और बैच 5 (नमूना 51) में वायरस और वाइरोइड्स से संक्रमित पेड़ मिश्रण से दो नमूनों की शुरूआत के साथ वही 72 साइट्रस बडवुड नमूने। एनटीसी और जल नियंत्रण सभी में अनिर्धारित सीक्यू मान थे (यानी, नमूने में डीएनए लक्ष्य मौजूद नहीं है)। ट्रिपलएक्स (सीएलबीवी, सीपीवी, सीटीवी) के लिए सकारात्मक नियंत्रण में क्रमशः 23.9, 25.2 और 22.4 के सीक्यू मान थे। एपस्कैविरॉइड्स (सीबीएलवीडी, सीडीवीडी, और सीबीसीवीडी) के लिए सकारात्मक नियंत्रण में क्रमशः 23.39, 21.27 और 25.17 के सीक्यू मान थे। गैर-एप्सकैविरॉइड्स (सीईवीडी, एचएसवीडी, IV) के लिए सकारात्मक नियंत्रण में क्रमशः 26.9, 27.0 और 26.5 के सीक्यू मान थे। संक्षेप: बीटीई = बडवुड ऊतक एक्सट्रैक्टर; NTC = कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: सफाई स्टेशन सेटअप। चैंबर में 10 वें नमूने को संसाधित करने के बाद, चैंबर को साफ करने के लिए सफाई स्टेशन तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल चरण 3.1-3.6 का पालन किया जाना है। प्रोटोकॉल चरण 3.1 के रूप में, अल्ट्रासोनिक क्लीनर में 1 एल पानी रखा जाता है। अल्ट्रासोनिक क्लीनर (प्रोटोकॉल चरण 3.2) के शीर्ष पर दो कचरा बैग लपेटे जाते हैं, और ~ 5 एल 10% ब्लीच (1% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान) को अल्ट्रासोनिक क्लीनर (प्रोटोकॉल चरण 3.3) में डाला जाता है। पानी का टब एक कक्ष (प्रोटोकॉल चरण 3.4) को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त पानी से भरा होता है, एयर कंप्रेसर बंद हो जाता है, और वाल्व खोला जाता है (प्रोटोकॉल चरण 3.5)। कक्ष के सूखने के दौरान तरल को पकड़ने के लिए एक पृष्ठभूमि स्थापित की जाती है (प्रोटोकॉल चरण 3.6)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एचएलबी साइट्रस रोग के आगमन के साथ, नुकसान को कम करने के लिए, साइट्रस उद्योग, नियामक एजेंसियों और नैदानिक प्रयोगशालाओं से आग्रह किया गया है कि वे रोगप्रबंधन प्रथाओं के साथ संयोजन में व्यक्तिगत पेड़ों के परीक्षण के लिए कम-थ्रूपुट मैनुअल नमूना प्रसंस्करण और रोगज़नक़ पहचान परख जैसे क्यूपीसीआर34 के साथ संयुक्त उच्च-थ्रूपुट न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण विधियों पर भरोसा करें।. कैलिफोर्निया की एचएलबी पॉजिटिविटी रेट 2012 में 0.01% से बढ़कर 2020 में 1.2% हो गई है। भले ही क्यूपीसीआर एक शक्तिशाली और विश्वसनीय रोगज़नक़ का पता लगाने वाला उपकरण है, वर्तमान में उपलब्ध प्रौद्योगिकियां पौधे के ऊतकों की पर्याप्त मात्रा को नमूना और संसाधित करने की अनुमति नहीं देती हैं, जिसके परिणामस्वरूप कैलिफोर्निया में साइट्रस पेड़ों में सीएलए के लिए स्पष्ट अंडरसैंपलिंग और अंडरटेस्टिंग होती है। परीक्षण किए गए पेड़ों की संख्या और संसाधित किए जा रहे प्रति पेड़ पौधे सामग्री की मात्रा (यानी, पत्तियों की संख्या) दोनों के संबंध में अंडरसैंपलिंग और अंडरटेस्टिंग होती है, और पेड़ की छतरी के भीतर संक्रमित पत्तियों के छिटपुट वितरण के कारण, प्रारंभिक या हल्के संक्रमण के गायब होने की उच्च संभावना होती है। नमूनाकरण और सीएलएएस परीक्षण के लिए वर्तमान तरीके लागत (जैसे, श्रम और उपकरण) के कारण बढ़ी हुई मांग के साथ स्केल नहीं कर सकते हैं। वर्तमान में, कैलिफोर्निया में अधिकांश साइट्रस नैदानिक प्रयोगशालाओं द्वारा साइट्रस रोगज़नक़ परीक्षण के लिए उपयुक्त न्यूक्लिक एसिड प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली नमूना प्रसंस्करण विधि को मैन्युअल नमूना हैंडलिंग और $ 100,000 से अधिक की लागत वाले विशेष आपूर्ति और उपकरणों के लिए 17 घंटे से अधिक की आवश्यकता होती है।

यहां, हम साइट्रस बडवुड छाल के ऊतकों को तेजी से संसाधित करने के लिए इंजीनियर किए गए एक विशेष उपकरण का सत्यापन प्रस्तुत करते हैं, जिसे बडवुड ऊतक एक्सट्रैक्टर (बीटीई) नाम दिया गया है, और साइट्रस नैदानिक प्रयोगशालाओं के लिए नमूना हैंडलिंग का एक विस्तृत, चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल। अनुसंधान ने बडवुड नमूनों के वर्तमान श्रम-गहन हाथ-काटने को बदलने और उच्चतम-थ्रूपुट और सबसे अधिक लागत प्रभावी साइट्रस बडवुड प्रसंस्करण उपकरण बनाने के लिए एक अभिनव ऊतक प्रसंस्करण विधि विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया। परिणाम बताते हैं कि बीटीई नमूना थ्रूपुट बढ़ाता है और सीसीपीपी नैदानिक प्रयोगशाला में उपयोग किए जाने वाले उपकरण और आपूर्ति की लागत को कम करता है। प्रस्तुत तकनीक और विधि में एनएफसी टैग, एक फोन ऐप और वास्तविक समय नमूना सूचना ट्रैकिंग के लिए एक ऑनलाइन डेटाबेस का उपयोग भी शामिल है। बडवुड नमूने एकत्र करने के बाद, फोन ऐप एनएफसी नमूना बैग क्लिप को एनएफसी ट्री टैग के साथ जोड़ता है। नमूने फिर बीटीई मशीन के साथ प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में भेज दिए जाते हैं। प्रत्येक नमूने के लिए जानकारी बीटीई शरीर के किनारे एक त्वरित स्वाइप के साथ दर्ज की जाती है। नमूना एनएफसी टैग के माध्यम से, प्रत्येक नमूने के लिए प्रसंस्करण समय और नमूने का वजन भी दर्ज किया जाता है और वास्तविक समय में ऑनलाइन डेटाबेस में अपलोड किया जाता है। यह विधि एक बहुत ही समय-कुशल प्रणाली प्रदान करती है, गुणवत्ता नियंत्रण में सुधार करती है (यानी, नमूना आईडी त्रुटियों से बचकर), और प्रयोगशाला दक्षता बढ़ाती है।

बीटीई उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण और सत्यापन "वास्तविक जीवन / क्षेत्र" साइट्रस नमूनों के साथ किया गया था, यह दर्शाता है कि अन्य नैदानिक प्रयोगशालाएं आसानी से प्रौद्योगिकी और पद्धति को अपना सकती हैं। इस तकनीक को अपनाने से परिचालन लागत को कम करने और नैदानिक क्षमता और प्रयोगशाला दक्षता में वृद्धि करने की अनुमति मिलेगी, इस प्रकार संक्रमण होने के बाद पहले चरण में रोगग्रस्त पेड़ों की पहचान करने और रोग फैलने की संभावना कम हो जाएगी। बीटीई बनाम पारंपरिक ऊतक-प्रसंस्करण विधियों की साइड-बाय-साइड तुलना दर्शाती है कि निकाले गए न्यूक्लिक एसिड की गुणवत्ता (यानी, एकाग्रता, शुद्धता और अखंडता) और डाउनस्ट्रीम रोगज़नक़ का पता लगाने के परिणाम तुलनीय हैं (चित्रा 3 ए-सी)। हालांकि, मैनुअल प्रोसेसिंग प्रोटोकॉल (यानी, 3.3 मिनट बनाम 6.8 मिनट) की तुलना में बीटीई का उपयोग करके नमूनों को संसाधित करने में बिताया गया समय काफी कम हो जाता है। कक्षों और बीटीई आधार को नियमित सफाई अनुसूची की आवश्यकता होती है। यद्यपि सफाई समय लेने वाली है और विधि की एक सीमा का गठन करती है, तकनीक कक्ष को साफ करने से पहले बीटीई में कई नमूनों को तेजी से संसाधित करने की अनुमति देती है। पारंपरिक तरीकों को कम सफाई की आवश्यकता होती है क्योंकि प्रत्येक नमूने का अपना प्रसंस्करण कंटेनर होता है, जो कई मामलों में, डिस्पोजेबल होता है, लेकिन उन्हें अधिक कंटेनर और भंडारण स्थान की आवश्यकता होती है (जैसे, 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर और -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर)।

बीटीई प्रक्रिया की कल्पना और निर्माण थोक नमूना प्रसंस्करण और परीक्षण के माध्यम से एक समस्या क्षेत्र की पहचान करने की संभावना को बढ़ाने के लिए किया गया था (यानी, एक बड़े साइट्रस जर्मप्लाज्म फाउंडेशन ब्लॉक, नर्सरी, या बाग के भीतर एक रोगग्रस्त पेड़ खोजना) केवल थोड़ी संख्या में थोक परीक्षण चलाकर जो गर्म स्थानों की पहचान कर सकते हैं। इसलिए, यह केवल तभी विचलित होता है जब सकारात्मक परिणाम मिलता है। जब ऐसा होता है (चित्रा 4 बी, बैच 1 और बैच 5), बाद में नमूना प्रसंस्करण और सकारात्मक सामग्री वाले एक ही बैच से व्यक्तिगत नमूनों का परीक्षण (यानी, नमूनों का केवल एक उप-समूह) यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक है कि कौन से नमूने सकारात्मक हैं। इस प्रकार, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह प्रक्रिया मुख्य रूप से कम संक्रमण दर वाले मामलों के लिए उपयुक्त है, जहां यह कई पेड़ों से उच्च मात्रा में सामग्री के परीक्षण की अनुमति देता है, जो बदले में, बड़ी संख्या में व्यक्तिगत नमूनों का परीक्षण किए बिना रोग का पता लगाने की संभावना को बढ़ाता है। उच्च संक्रमण दर वाले मामलों में पारंपरिक तरीके इष्टतम विकल्प होंगे, क्योंकि वे प्रत्येक नमूने को व्यक्तिगत रूप से परीक्षण करने की अनुमति देते हैं। यह कैलिफोर्निया20 में एचएलबी सर्वेक्षणों (अभी भी कम एचएलबी सकारात्मकता दर पर) के मामले में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जहां सीएलएएस का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीसीआर-आधारित तरीके मुख्य रूप से स्पर्शोन्मुख पेड़ों में सीएलए की उपस्थिति या अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए हैं (यानी, कोई विशिष्ट धब्बा नहीं, कैनोपी पीलापन, या पेड़ की गिरावट) जो सीएलएएस-पॉजिटिव एशियाई साइट्रस प्सिलिड्स (एसीपी) के संपर्क में आए हैं। इस तथ्य को देखते हुए कि हम नहीं जानते कि पेड़ में एक संक्रामक एसीपी कहां खिलाया गया है, खेत में या किसी अन्य बड़े क्षेत्र में या किसी अन्य बड़े क्षेत्र में कम संख्या में नमूनों का परीक्षण करके संक्रमित लेकिन स्पर्शोन्मुख पेड़ की पहचान करने की संभावना बहुत कम है (उदाहरण के लिए, कैलिफोर्निया में, वर्तमान में 20 पत्तियां एकत्र की जाती हैं, और प्रति पेड़12 पत्तियों का परीक्षण किया जाता है)। जाहिर है, पेड़ की छतरी जितनी बड़ी होगी, सीएलएएस का पता लगाने की संभावना उतनी ही कम होगी। भले ही पीसीआर की लागत (यानी, अभिकर्मकों, बुनियादी प्रयोगशाला उपकरण, और थर्मोसायकलर), जो नमूना प्रसंस्करण का पालन करती है, और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और शुद्धिकरण बीटीई प्रक्रिया में अपरिवर्तित रहती है, यह निर्धारित करने के लिए कि वे संक्रमित हैं या नहीं, स्पर्शोन्मुख पेड़ों से नमूने कहां एकत्र किए जाएं, इस बारे में अनिश्चितता अभी भी बनी हुई है और, हमारी राय में, कैलिफोर्निया में एचएलबी सर्वेक्षण की अकिलिस हील है। प्रस्तुत उपकरण, प्रौद्योगिकी, विधि और सुधार कम समय में और कम लागत पर बड़े नमूना आकार के प्रसंस्करण की अनुमति देंगे। इसलिए, यह विधि समय पर संक्रमित पेड़ों की पहचान करने की संभावना को बढ़ाएगी और कैलिफोर्निया में एचएलबी या साइट्रस के अन्य आक्रामक रोगजनकों के उन्मूलन के प्रयासों में सुधार करेगी (उदाहरण के लिए, अगस्त 2022 में कैलिफोर्निया में रिपोर्ट किए गए साइट्रस पीले नस समाशोधन वायरस)।

स्वचालित ऊतक प्रसंस्करण विधियों के साथ संयुक्त, थोक नमूने और परीक्षण पौधे ऊतक प्रसंस्करण लागत में कमी के लिए अनुमति देगा। यह लागत में कमी कई नैदानिक प्रयोगशालाओं को कई राज्यों में बागों की अधिक प्रभावी ढंग से जांच करने और एचएलबी और अन्य बीमारियों के आंदोलन को बेहतर ढंग से ट्रैक करने की अनुमति देगी। अंततः, इसका मतलब है कि उत्पादकों के पास अधिक कुशल बड़े पैमाने पर परीक्षण के माध्यम से बीमारियों के प्रसार को धीमा करने के लिए एक अधिक प्रभावी उपकरण होगा। जबकि बीटीई उपकरण साइट्रस प्रयोगशालाओं की वर्तमान नैदानिक क्षमता में सुधार कर सकता है और पूरे साइट्रस उद्योग को लाभान्वित कर सकता है, साथ ही, प्रौद्योगिकी को अन्य पेड़ फसलों में भी स्थानांतरित किया जा सकता है। ओडी द्वारा अनुमानित न्यूक्लिक एसिड सांद्रता और शुद्धता के प्रारंभिक आंकड़ों ने संकेत दिया है कि बीटीई बादाम (59.87 एनजी / μएल ± 7.43 एनजी / μL और ए 260/ए 280 1.17 ± 0.05, एन = 9), अंगूर (135.74 एनजी / μएल ± 50.74 एनजी / μL और A260/μL 1.17 ± 0.06, n = 9) से ऊतकों ±±को प्रभावी ढंग से संसाधित कर सकता है। एन = 9) (यूसी डेविस में फाउंडेशन प्लांट सर्विसेज द्वारा प्रदान किए गए नमूने)।

यहां प्रस्तुत बडवुड ऊतक प्रसंस्करण मंच ने अतिरिक्त पौधे ऊतक प्रसंस्करण उपकरण के विकास को प्रेरित किया है। उदाहरण के लिए, एक पत्ती ऊतक निकालने वाला (एलटीई) वर्तमान में विकास के अधीन है। खट्टे पत्तों का उपयोग करके प्रारंभिक परीक्षण परिणामों से पता चला है कि एलटीई उपकरण कैलिफोर्निया20 में उपयोग की जाने वाली वर्तमान मानक 12 पत्ती विधि की तुलना में प्रसंस्करण समय में केवल 35% की वृद्धि के साथ लगभग सात गुना अधिक पत्तियों को संसाधित कर सकता है। हमने अनुमान लगाया है कि एक एलटीई-समर्थित थोक नमूनाकरण और परीक्षण प्रोटोकॉल प्रति साइट्रस पत्ती परीक्षण की समग्र लागत को एक चौथाई तक कम कर सकता है। इस तकनीक के व्यावहारिक अनुप्रयोग के मूल्य को साबित करने के लिए अनुसंधान वर्तमान में हमारी प्रयोगशालाओं में सीडीएफए विशेषता फसल ब्लॉक अनुदान के तहत चल रहा है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक ों ने काहुइला लोगों को भूमि के पारंपरिक संरक्षक के रूप में स्वीकार किया जिस पर प्रयोगात्मक कार्य पूरा हुआ था। हम यूसीआर कैलिफोर्निया कृषि और खाद्य उद्यम (सीएफे) पहल के तहत इस परियोजना के लिए अनुसंधान गतिविधियों को पूरा करने के लिए प्रयोगशाला स्थान प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड में प्रोफेसर नॉर्मन एलस्ट्रैंड के आभारी हैं। इस शोध को सीडीएफए - विशेष फसल ब्लॉक अनुदान कार्यक्रम (अनुदान संख्या 18-0001-055-एससी) द्वारा समर्थित किया गया था। सीआरबी परियोजना 6100 द्वारा अतिरिक्त सहायता भी प्रदान की गई थी; यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर, हैच प्रोजेक्ट 1020106; और नेशनल क्लीन प्लांट नेटवर्क-यूएसडीए पशु और संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षण सेवा (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, और AP20PPQS&T00C049) जॉर्जियोस विडालाकिस को सम्मानित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08" Hex Trimmer line PowerCare FPRO07065 Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor California Air Tools 8010 Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube Globe Scientific 111558B Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set Technology Evolving Solutions TE006-F1-10A-G1000-E1 Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler Westcott ‎16012 To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite Hasa 1041 Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer Insignia NS-CZ70WH0 Store sample after processing
4" x 12" plastic bags Plymor FP20-4x12-10 Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab Puritan 806-PCL Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote HDX 206152 Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun JASTIND ‎JTABG103A Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie Sharpie  S-19421 Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor Brand Z627569 Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber Technology Evolving Solutions TE002BB-A05-E1 Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap Dawn 57445CT Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter Air Science P5-36XT-A Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container PolarTech 261/J50C Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat Red Kap KP14WH LN 46 Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop Microsoft Surface Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone Samsung Galaxy S9 Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag Technology Evolving Solutions TE005-Clip-E1 Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag Technology Evolving Solutions TE005-Collar-E1 Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves Usa Scientific 3915-4400 Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff 3M 90565-4DC-PS Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose FYPower ‎510019 Attaches air gun to compressor
Saftey glasses Solidwork SW8329-US Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle JohnBee B08QM81BJV Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base Technology Evolving Solutions TE001-A-E1 System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale Technology Evolving Solutions TE003-A05-200g-01-E1 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
Vermiculite EasyGoProducts B07WQDZGRP Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter Boenfu ‎BOWC-06002-US Wire cutters to cut trimmer line

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References

  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

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Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

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Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E.,… More

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E., Uribe, G., De Francesco, A., Milton, R., De La Torre, A., Mounkam, A., Dang, T., Bodaghi, S., Lavagi-Craddock, I., Syed, A., Grover, W., Okamba, A., Vidalakis, G. Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. J. Vis. Exp. (194), e65159, doi:10.3791/65159 (2023).

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