Artículo de método

Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley

DOI:

10.3791/65172

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7 de abril de 2023

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1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe una metodología para aislar e identificar células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC) de ratas Sprague Dawley.

Resumen

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Las células mesenquimales adultas han revolucionado la biología molecular y celular en las últimas décadas. Pueden diferenciarse en diferentes tipos de células especializadas, además de su gran capacidad de autorrenovación, migración y proliferación. El tejido adiposo es una de las fuentes menos invasivas y más accesibles de células mesenquimales. También se ha informado que tiene mayores rendimientos en comparación con otras fuentes, así como propiedades inmunomoduladoras superiores. Recientemente, se han publicado diferentes procedimientos para obtener células mesenquimales adultas de diferentes fuentes de tejidos y especies animales. Después de evaluar los criterios de algunos autores, estandarizamos una metodología que es aplicable a diferentes propósitos y fácilmente reproducible. Un conjunto de fracción vascular estromal (SVF) de tejido adiposo perirrenal y epididimario nos permitió desarrollar cultivos primarios con morfología y funcionalidad óptimas. Se observó que las células se adhirieron a la superficie plástica durante 24 h, y exhibieron una morfología similar a los fibroblastos, con prolongaciones y tendencia a formar colonias. Se utilizaron técnicas de citometría de flujo (CF) e inmunofluorescencia (IF) para evaluar la expresión de los marcadores de membrana CD105, CD9, CD63, CD31 y CD34. La capacidad de las células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) para diferenciarse en el linaje adipogénico también se evaluó utilizando un cóctel de factores (insulina 4 μM, 0,5 mM 3-metil-iso-butil-xantina y 1 μM dexametasona). Después de 48 h, se observó una pérdida gradual de la morfología fibroblastoide, y a los 12 días, se confirmó la presencia de gotas lipídicas positivas a tinción de rojo aceite. En resumen, se propone un procedimiento para obtener cultivos de ASC óptimos y funcionales para su aplicación en medicina regenerativa.

Introducción

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Las células madre mesenquimales (MSC) han tenido un fuerte impacto en la medicina regenerativa debido a su alta capacidad de autorrenovación, proliferación, migración y diferenciación en diferentes linajes celulares 1,2. Actualmente, una gran cantidad de investigación se centra en su potencial para el tratamiento y diagnóstico de diversas enfermedades.

Existen diferentes fuentes de células mesenquimales: médula ósea, músculo esquelético, líquido amniótico, folículos pilosos, placenta y tejido adiposo, entre otros. Se obtienen de diferentes especies, incluyendo humanos, ratones, ratas, perros y caballos3. Las MSC derivadas de médula ósea (BMSC) se han utilizado durante muchos años como una fuente importante de células madre en medicina regenerativa y como una alternativa al uso de células madre embrionarias4. Sin embargo, las MSC derivadas de tejido adiposo, o células madre derivadas de tejido adiposo (ASCs), son una alternativa importante con grandes ventajas debido a su facilidad de recolección y aislamiento, así como al rendimiento de las células obtenidas por gramo de tejido adiposo 5,6. Se ha informado que la tasa de cosecha de los ASC es generalmente más alta que la de las BMSC7. Inicialmente se propuso que la capacidad reparadora/regenerativa de las ASC se debía a su capacidad para diferenciarse en otros linajes celulares8. Sin embargo, la investigación en los últimos años ha reforzado el papel principal de los factores paracrinos liberados por las ASC en su potencial reparador 9,10.

El tejido adiposo (AT), además de ser una reserva de energía, interactúa con los sistemas endocrino, nervioso y cardiovascular. También está involucrado en el crecimiento y desarrollo postnatal, el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos, la reparación de tejidos y la regeneración. El AT está compuesto por adipocitos, células del músculo liso vascular, células endoteliales, fibroblastos, monocitos, macrófagos, linfocitos, preadipocitos y ASC. Estos últimos poseen un papel importante en la medicina regenerativa debido a su baja inmunogenicidad11,12. Los ASC se pueden obtener por digestión enzimática y procesamiento mecánico o por explantes de tejido adiposo. Los cultivos primarios de ASC son fáciles de mantener, cultivar y expandir. La caracterización fenotípica de las ASCs es esencial para verificar la identidad de las células mediante la evaluación de la expresión de marcadores específicos de membrana utilizando métodos como la inmunofluorescencia y la citometría de flujo13. La Federación Internacional de Terapéutica y Ciencia Adiposa (IFATS) y la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) han definido que las ASC expresan CD73, CD90 y CD105, mientras que carecen de la expresión de CD11b, CD14, CD19, CD45 y HLA-DR14. Por lo tanto, estos marcadores, tanto positivos como negativos, se consideran confiables para la caracterización de las ASC.

Este proyecto se centró en describir un procedimiento para el aislamiento e identificación de células mesenquimales adultas extraídas de TA de ratas, ya que esta fuente de células no presenta desafíos éticos, a diferencia de las células madre embrionarias. Esto solidifica el procedimiento como una opción viable debido a la facilidad de acceso y al método mínimamente invasivo en comparación con las células madre derivadas de la médula ósea.

Las células mesenquimales de esta fuente de tejido tienen un papel importante en la medicina regenerativa debido a sus capacidades inmunomoduladoras y bajo rechazo inmune. Por lo tanto, el presente estudio es una parte fundamental de futuras investigaciones sobre su secretoma y su aplicación como terapia regenerativa en diferentes enfermedades, incluidas enfermedades metabólicas como la diabetes.

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Protocolo

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Todos los procedimientos experimentales se realizaron siguiendo las Directrices Mexicanas para el Cuidado de los Animales, con base en las recomendaciones de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Animales de Laboratorio Internacional (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, México). El protocolo fue revisado, aprobado y registrado por el Comité de Ética en Investigación en Salud del Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Extracción de tejido adiposo de ratas mediante resección quirúrgica

  1. Preparar dos tubos cónicos con 20 ml de solución estéril 1x solución tamponada con fosfato antimicótico antibiótico (PBS-AA) (1x PBS, gentamicina [20 μg/ml] y anfotericina [0,5 μg/ml]) y mantener en hielo.
  2. Seleccione dos ratas Sprague Dawley macho adultas (R. norvegicus) en buen estado de salud. Asegúrese de que las ratas tengan entre 3 y 4 meses de edad y tengan un peso coporal de 350-450 g.
  3. Proceder a la sedación con 20 mg/kg de clorhidrato de xilazina, y 5 minutos después, administrar un anestésico con una dosis de 120 mg/kg de clorhidrato de ketamina por vía intraperitoneal. Lubrique ambos ojos con un ungüento oftálmico para evitar que se sequen. Luego, confirme la profundidad de la anestesia a través de la falta de reflejo pedal.
  4. Afeite y desinfecte la región abdominal e inguinal con una solución de yodo. Aplique cortinas quirúrgicas para mantener la esterilidad. Luego, haga una incisión longitudinal mediana desde el esternón hasta la región testicular.
  5. Retire el tejido adiposo que rodea tanto el epidídimo como los riñones con fórceps estériles y colóquelo en la solución 1x PBS-AA. Mantenga las muestras en hielo.
  6. Suturar la incisión cerrada si es necesario según las directrices institucionales y sacrificar a los animales con una dosis intracardíaca de 40 mg/kg de pentobarbital sódico. Una vez confirmada la muerte, deseche la canal siguiendo los procedimientos institucionales.
    NOTA: La muerte provoca mecanismos de señalización que afectan el inmunofenotipo, la capacidad de diferenciación y el efecto paracrino de las células mesenquimales. Por lo tanto, la recolección de tejido se realiza antes de la eutanasia. 

2. Aislamiento de células mesenquimales del tejido adiposo

  1. Retire el tejido adiposo con pinzas estériles dentro de un gabinete de bioseguridad y colóquelo en papel de filtro estéril en una placa de Petri de 100 mm de diámetro para absorber el exceso de PBS.
  2. Transfiera el tejido adiposo a otra placa de Petri y realice tres lavados durante 5 min cada uno con 10 ml de 1x solución PBS-AA utilizando una pipeta de 10 ml.
  3. Desagregar mecánicamente el tejido en fragmentos de aproximadamente 1cm2 utilizando tijeras y un bisturí.
  4. Preparar colagenasa tipo IV (0,075%) en 20 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) no suplementado. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y conservar a 37 °C.
  5. Añadir la solución de colagenasa (20 ml) preparada en el paso 2.4 en un vaso de precipitados de cristal con el tejido fragmentado y una barra magnética. Sellar el recipiente e incubar bajo agitación lenta y continua a 37 °C.
    NOTA: La digestión enzimática dura aproximadamente 90 min (mantener la agitación lenta para preservar la integridad de las membranas celulares).
  6. Filtrar el homogeneizado a través de un filtro de acero inoxidable, malla 40 y 0,38 mm de apertura en una placa de Petri de 100 mm y recoger la suspensión celular en un tubo cónico estéril de 50 ml.
  7. Agregue 20 ml de DMEM suplementado calentado (suero bovino fetal al 10% [FBS], 2 mM de glutamina, piruvato de sodio 2 mM, solución de aminoácidos no esenciales 100x y solución antimicótica antibiótica 100x [AA]). Suspenda cuidadosamente la fracción vascular estromal (SVE).
  8. Centrifugar la suspensión celular a 290 x g durante 10 min, desechar el sobrenadante con una pipeta de 25 ml y lavar suavemente las células con 40 ml de un medio DMEM no suplementado.
  9. Repita este paso. Use un nuevo tubo cónico estéril entre los pasos para arrastrar la menor cantidad de detritus celulares y grasa.
  10. Suspender el pellet en 5 ml de DMEM suplementado con una pipeta de 5 ml y transferir a un frasco T-25 cm2 . Incubar durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2.
  11. Al día siguiente, realice tres lavados con 5 ml de PBS-AA calentado y dos lavados con DMEM no suplementado para eliminar los restos celulares y las células no adherentes. Añadir 5 ml de DMEM fresco, calentado y suplementado con una pipeta de 5 ml y cambiar el medio cada 3-4 días.

3. Mantenimiento y expansión de los cultivos primarios de ASC

  1. Una vez que las células alcancen 90% -100% de confluencia (8 ± 2 días), lavar dos veces con 5 ml de DMEM no suplementado. Añadir 1 ml de tripsina-2 mM ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) calentado al 0,025% e incubar durante 5-7 min a 37 °C.
  2. Cuando la monocapa celular se desprenda, agregue 4 ml de DMEM suplementado y desagregue suavemente la suspensión celular.
  3. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, agregue 5 ml de DMEM calentado y suplementado, y suspenda suavemente para homogeneizar.
  4. Centrifugar a 290 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y mezcle suavemente el pellet en 1 ml de DMEM suplementado. Contar las células en una cámara Neubauer después de teñir con azul de tripano.
  5. Finalmente, sembrar 2,5 x 103 células/cm2 en una proporción dividida de 1:4 en matraces T-75. Este paso asegura la formación de colonias y una alta tasa de proliferación.

4. Caracterización morfológica de cultivos primarios ASC

  1. Observar la morfología de los ASCs bajo microscopía invertida.
    NOTA: Antes de montar para la histología y la identificación de ASC, trate los cubreobjetos con una solución de gelatina al 1%. Irradiar con UV durante 15 min.
    1. Retire los cubreobjetos de la solución de etanol al 70% y déjelos secar durante 5 minutos.
    2. Sumerja los cubreobjetos en una solución estéril de gelatina al 1%, escurra y seque a temperatura ambiente (RT).
    3. Coloque cada cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 6 pocillos e irradie las placas con luz UV durante 15 minutos.
    4. Siembre una gota que contenga 25 x 103 células en el centro del pozo, espere 1 minuto y agregue 1 ml de medio DMEM suplementado. Incubar durante 96 h a 37 °C y 5%CO2.
    5. Retire el medio y realice tres lavados con 1x PBS-AA utilizando una pipeta de transferencia.
    6. Agregue 1 ml de formalina neutra al 3.5% a cada pocillo e incube durante 1 h en RT. Retire con cuidado la formalina y agregue 1 ml de etanol frío al 70% a cada pocillo.
    7. Selle la placa con parafilm hasta su uso, para evitar que se seque.
      NOTA: La morfología celular de las ASC también se evalúa mediante tinción de hematoxilina-eosina durante diferentes pasajes.
    8. Retire el etanol al 70% de cada pocillo e hidrate las células durante 5 minutos con agua destilada. Mientras tanto, filtre las soluciones de tinción.
    9. Retire el agua y tiñe las células bajo agitación lenta durante 15 minutos con la solución de hematoxilina de Harris.
    10. Retire la solución de tinción y realice dos lavados con 1x PBS.
    11. Manchar las células con solución de eosina bajo agitación lenta durante 1 min. Luego, retire la solución y realice dos lavados con 1x PBS.
    12. Retire con cuidado los cubreobjetos de cada pocillo y monte los portaobjetos en una gota de solución de montaje de PBS-glicerol (1:1 v/v).
    13. Coloque una línea de esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos y observe los portaobjetos histológicos bajo el microscopio óptico.

5. Marcadores de expresión de ASCs por inmunofluorescencia

  1. Prepare el tampón de lavado que contiene 1x PBS-0.05% Tween 20. Realizar los lavados en RT y con agitación lenta. Lave las placas tres veces con 2 ml de tampón/pocillo (incubar durante 3 minutos por cada lavado).
  2. Colocar 1 ml de reactivo bloqueador (1:10) e incubar con agitación lenta durante 20 min.
  3. Agregue 200 μL (dilución 1:50) de los siguientes anticuerpos primarios a cada pocillo: CD9 (ratón monoclonal), CD34 (conejo policlonal) y anti-CD63 (cabra policlonal). Incubar durante la noche a 4 °C.
  4. Lavar las placas tres veces de nuevo e incubar con 200 μL (dilución 1:50) de los siguientes anticuerpos secundarios: cabra conjugada anti ratón IgG FITCH, burro anticabra IgG DyeLight 550 y cabra anti conejo IgG Cy3.
  5. Lavar tres veces con 1x PBS-0.05% Tween 20 y contrateñir los núcleos celulares con 100 μL de DRAQ-7 (dilución: 17 μL en 1 mL de agua destilada doble) durante 20 min.
  6. Lavar tres veces más y montar las guías de acuerdo con los pasos 4.1.12-4.1.13. Guarde las muestras protegidas de la luz y congeladas hasta su uso.
  7. Visualice las muestras bajo microscopía confocal de epifluorescencia utilizando la configuración adecuada y el software recomendado para este equipo.

6. Marcadores de expresión de ASCs por citometría de flujo

  1. Ajustar una suspensión de una sola célula a partir de células tripsinizadas o descongeladas (subpasajes 3 o 4) a una concentración de 1 x 106 células/ml de 1x PBS-5% FBS. Alícuota 100 μL con 100.000 células en tubos centrífugos de 1,5 ml. Utilice una alícuota sin etiquetado para el control de autofluorescencia.
  2. Agregue al resto todas las cantidades apropiadas de Anti-CD105 AF-594 y Anti-CD31 AF-680, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar en la oscuridad durante 20 min a 4 °C.
  3. Lavar el exceso de tinción con 1 mL de 1x PBS-5% FBS por centrifugación a 250 x g durante 5 min y suspender en 300 μL de formalina al 1%.
  4. Realizar la adquisición de muestras en un citómetro de flujo. La estrategia de compuerta de las células se basa en FSC-A vs. SSC-A gating, celdas individuales cerradas usando SSC-H vs. SSC-A seguido de FSC-A vs. FSC-H.
  5. Utilice el detector Y610-mCherry-A para CD105 AF-594 y el detector R660-APC-A para CD31 AF-680.

7. Diferenciación de ASCs al linaje adipogénico

  1. En una placa de 6 pocillos, sembrar 1 x 104 células (P-4) por cm2 e incubar a 37 °C, 5% CO2, hasta la confluencia del 60-80% (~72-96 h). Inducir diferenciación, aplicando directamente al medio de cultivo: 4 μM de insulina, 1 μM de dexametasona 21-acetato (Dxa) y 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (MIX). Cambiar el medio de diferenciación cada 2-3 días.
  2. Preparar una solución madre de insulina de 800 μM en 2 ml de agua ultrapura estéril (añadir 20 μL de HCl 1 N para asegurar la disolución completa) y almacenar a -20 °C. Añadir 10 μL de caldo de insulina, previamente diluido 1:100, y aplicar 10 μL a un volumen final de 2 ml por pocillo.
  3. Prepare una solución madre de 1 mM Dxa en 5 ml de agua ultrapura estéril (tenga en cuenta que no se produce una disolución completa). Conservar a 4 °C. Añadir 40 μL/pocillo de una dilución 1:4 de material Dxa.
  4. Preparar un stock de 100 mM de MIX en 2,5 ml de NaOH 0,1 N, vórtice, y añadir 40 μL de NaOH de 1 N para la disolución completa. Conservar a -70 °C. Añadir 10 μL/pocillo de material MIX.
  5. Filtrar las soluciones madre a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm antes de almacenarlas.
  6. El día 12, lavar las células tres veces con 1x PBS e incubar con 500 μL de formalina al 4 % durante 1 h en RT. Lavar cada pocillo dos veces con agua destilada seguida, al 60% de isopropanol durante 5 min y dejar secar.
  7. Añadir 0,5% de aceite rojo O diluido en isopropanol al 60% (500 μL/pocillo) e incubar durante 20 min a RT. Lavar con 1 ml de agua destilada tres veces y observar bajo un microscopio invertido.
    NOTA: Para los reactivos, equipos y materiales requeridos, consulte la Tabla de materiales.

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Resultados

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El tejido adiposo se obtuvo de ratas adultas Sprague Dawley de 3-4 meses de edad y con un peso corporal de 401 ± 41 g (media geométrica ± DE). Un valor medio de 3,8 g de tejido adiposo epididimario y perirrenal correspondió al análisis de 15 extracciones experimentales. Después de 24 h de cultivo, las poblaciones celulares permanecieron adheridas a la superficie plástica y exhibieron una morfología heterogénea. El primer pasaje se realizó a los 8 ± 2 días, con un rendimiento de 1,4 ± 0,6 x 106 células en un to...

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Discusión

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En las últimas cuatro décadas desde el descubrimiento de las MSC, varios grupos de investigadores han descrito procedimientos para obtener MSCs de diferentes tejidos y especies. Una de las ventajas de utilizar ratas como modelo animal es su fácil mantenimiento y rápido desarrollo, así como la facilidad de obtención de MSCs a partir del tejido adiposo. Se han descrito diferentes fuentes tisulares para la obtención de ASCs, como grasa visceral, perirrenal, epididimaria y subcutánea 12,13,14,15,16.

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen al Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) y al Hospital Infantil de México, Federico Gómez (HIMFG) y al personal de Bioterio de la Coordinación de Investigación del IMSS, por el apoyo brindado para llevar a cabo este proyecto. Agradecemos al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca AOC (815290) y a Antonio Duarte Reyes por el apoyo técnico en el material audiovisual.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anfotericina BHyCloneSV30078.01
Balanza analíticaSartoriusAX224
Anticuerpo anti-CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
Anticuerpo anti-CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
Anticuerpo anti-C63Santa CruzSc-5275
Anticuerpo anti-Endoglina/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
Anticuerpo anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
Anticuerpo Cabra antirrábico IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
Anticuerpo Burro anti-cabra IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
Anticuerpo anti-ratón IgG FITC cabra conjugada F (ab´)Sistemas RD.Nº F103B
Tapa de botella Filtro estérilCORNING10718003
Matraces de cultivo de células y tejidosBIOFIL170718-312B
Contador de células Hemacitómetro de línea brillante con portaobjetos para cámara de recuento de célulasSIGMA Aldrich Z359629
Pocillos de células: 6 pocillos con tapaCORNING25810
Tubos cónicos decentrífugaCentrífuga HeTTICHROTANA460R
Tubos Eppendorf FischerScientificM0018242_44797
Colágeno IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Life Science43112
Tubos de cultivoGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman CoulterVersión
Citómetro CytoFlex LXBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 DyeThermo Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eosina amarillentaHycel300
Etanol 96%Baker64-17-5
Tubos Falcon 15 mLGreiner Bio-One 188271
Tubos Falcon 50 mLGreiner Bio-One 227261
Suero Fetal Bovino CORNING35-010-CV
GelatinaSIGMA Aldrich128111163
GentamicinaGIBCO 15750045
Glicerina-Alta PurezaHerschi Trading 56-81-5
HematoxilinaAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubadora Thermo Sc.
Ketamina Pet (Clorhidrato de Ketamina)ArandaSV057430
L-Glutamina GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5Versión
Cabina de seguridad biológica Clase IINuAire12082100801
Microscopio epifluorescente Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
Microscopio invertido Olympus CK40CK40-G100
Aminoácidos no esenciales 100XGIBCO11140050
Micro tubos 2 mL Sarstedt 72695400
Microtubos 1,5 mLSarstedt 72706400
Micropipetas 0,2-2 μ LFinnpipetteE97743
Micropipetas 2-20 μ LFinnpipetteF54167
Micropipetas 20-200 μ LFinnpipetteG32419
Micropipetas 100-1000 μ LFinnpipetaFJ39895
Tanque de nitrógeno líquidoTaylor-Wharton681-021-06
ParaformaldehídoSIGMA Aldrich SLBC3029V
Penicilina / Estreptomicina GIBCO/ Thermo Sc.
Placa de Petri Cultivo celularCORNING Inc
Puntas de pipetaAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (pentobarbital sódico)PISA AgropecuariaQ-7833-215
Cloruro de potasio J.T.Baker7447-40-7
Fosfato de potasio DibásicoJ.T Baker2139900
S1 Llenadoras de pipetasThermo Sc9531
Pipeta serológica 5 mLPYREXL010005
Pipeta serológica 10 mLPYREXL010010
Bicarbonato de sodioJ.T Baker144-55-8
Cloruro de sodio J.T.Baker15368426
Fosfato de sodio dibásico anhidroJ.T Baker7558-79-4
Piruvato de sodioGIBCO BRL11840-048
Filtro de jeringa estérilEspectrofotómetro de 431222
CORNING PerkinElmer Lambda 25L6020060
Agitador de placas de titulaciónLAB-LINE1250
Pipetas de transferenciaSamco/Thermo Sc728NL
Trypan Blue tinciónGIBCO1198566
tripsina de páncreas porcinoSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
Reactivo de bloqueo universal 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (clorhidrato de xilacina)Pet' s FarmaciaQ-7972-025
gratuita50116047gratuita15140122 480167

Referencias

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