Un protocolo eficiente para el análisis CUT&amp;RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Kamar Ghaibour; Joe Rizk; Claudine Ebel; Tao Ye; Muriel Philipps; Valérie Schreiber; Daniel Metzger; Delphine Duteil

doi:10.3791/65215

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Artículo de método

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

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DOI:

10.3791/65215

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7 de julio de 2023

Kamar Ghaibour^*¹ , Joe Rizk^*¹ , Claudine Ebel¹ , Tao Ye¹ , Muriel Philipps¹ , Valérie Schreiber¹ , Daniel Metzger¹ , Delphine Duteil¹

¹CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se presenta aquí un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón con aislamiento de células satélite de células satélite de células satélite de músculo de extremidades de ratón adaptado al estudio de la regulación de la transcripción en fibras musculares por escisión bajo dianas y liberación mediante nucleasa (CUT&RUN).

Resumen

Los análisis de todo el genoma con poblaciones de células pequeñas son una limitación importante para los estudios, particularmente en el campo de las células madre. En este trabajo se describe un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite del músculo de la extremidad, un tejido con un alto contenido de proteínas estructurales. Los músculos disecados de las extremidades de ratones adultos se interrumpieron mecánicamente mediante la picadura en medio suplementado con dispasa y colagenasa tipo I. Tras la digestión, el homogeneizado se filtró a través de filtros celulares y las células se suspendieron en tampón FACS. La viabilidad se determinó con tinción de viabilidad fijable y las células satélite inmunoteñidas se aislaron mediante FACS. Las células se lisaron con Triton X-100 y los núcleos liberados se unieron a perlas magnéticas de concanavalina A. Los complejos núcleo/perla se incubaron con anticuerpos contra el factor de transcripción o las modificaciones de histonas de interés. Después de los lavados, los complejos núcleo/perlas se incubaron con la proteína A-microcócica nucleasa y se inició la escisión de la cromatina con CaCl₂. Después de la extracción del ADN, se generaron y secuenciaron bibliotecas, y se obtuvieron los perfiles de unión al factor de transcripción de todo el genoma y modificaciones de histonas covalentes mediante análisis bioinformático. Los picos obtenidos para las diversas marcas de histonas mostraron que los eventos de unión eran específicos para las células satélite. Además, el análisis de motivos conocidos reveló que el factor de transcripción estaba unido a la cromatina a través de su elemento de respuesta afín. Por lo tanto, este protocolo está adaptado para estudiar la regulación génica en células satélite musculares de extremidades de ratones adultos.

Introducción

Los músculos estriados esqueléticos representan en promedio el 40% del peso total del cuerpo humano¹. Las fibras musculares exhiben una notable capacidad de regeneración ante una lesión, que se describe por la fusión de miocitos recién formados y la generación de nuevas miofibras que reemplazan a las dañadas². En 1961, Alexander Mauro reportó una población de células mononucleares a las que denominó células satélite³. Estas células madre expresan el factor de transcripción pareado box 7 (PAX7), y se localizan entre la lámina basal y el sarcolema de las fibras musculares⁴. S....