Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial

Summary

Se describe un procedimiento para estudiar la dinámica del metabolismo del ADN mitocondrial (ADNmt) en las células utilizando un formato de placa de múltiples pocillos e imágenes de inmunofluorescencia automatizadas para detectar y cuantificar la síntesis y distribución del ADNmt. Esto se puede utilizar aún más para investigar los efectos de varios inhibidores, tensiones celulares y silenciamiento génico en el metabolismo del ADNmt.

Abstract

La gran mayoría de los procesos celulares requieren un suministro continuo de energía, cuyo portador más común es la molécula de ATP. Las células eucariotas producen la mayor parte de su ATP en las mitocondrias por fosforilación oxidativa. Las mitocondrias son orgánulos únicos porque tienen su propio genoma que se replica y se transmite a la siguiente generación de células. En contraste con el genoma nuclear, hay múltiples copias del genoma mitocondrial en la célula. El estudio detallado de los mecanismos responsables de la replicación, reparación y mantenimiento del genoma mitocondrial es esencial para comprender el buen funcionamiento de las mitocondrias y las células enteras tanto en condiciones normales como de enfermedad. Aquí se presenta un método que permite la cuantificación de alto rendimiento de la síntesis y distribución de ADN mitocondrial (ADNmt) en células humanas cultivadas in vitro . Este enfoque se basa en la detección por inmunofluorescencia de moléculas de ADN sintetizadas activamente marcadas por la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) y la detección concurrente de todas las moléculas de ADNmt con anticuerpos antiADN. Además, las mitocondrias se visualizan con colorantes o anticuerpos específicos. El cultivo de células en un formato de múltiples pocillos y la utilización de un microscopio de fluorescencia automatizado facilitan el estudio de la dinámica del ADNmt y la morfología de las mitocondrias en una variedad de condiciones experimentales en un tiempo relativamente corto.

Introduction

Para la mayoría de las células eucariotas, las mitocondrias son orgánulos esenciales, ya que desempeñan un papel crucial en numerosos procesos celulares. En primer lugar, las mitocondrias son los principales proveedores de energía de las células¹. Las mitocondrias también están involucradas en la regulación de la homeostasis celular (por ejemplo, redox^{2 intracelular} y el balance de calcio³), la señalización celular ^4,5, la apoptosis⁶, la síntesis de diferentes compuestos bioquímicos ^7,8 y la respuesta inmune innata⁹. La disfunción mitocondrial está asociada a diversos estados patológicos y enfermedades humanas¹⁰.

El funcionamiento de las mitocondrias depende de la información genética localizada en dos genomas separados: el nuclear y el mitocondrial. El genoma mitocondrial codifica un pequeño número de genes en comparación con el genoma nuclear, pero todos los genes codificados por ADNmt son esenciales para la vida humana. La maquinaria de proteínas mitocondriales necesaria para mantener el ADNmt está codificada por el ADNn. Los componentes básicos del replisoma mitocondrial, así como algunos factores de biogénesis mitocondrial, ya han sido identificados (revisado en investigaciones anteriores^11,12). Sin embargo, la replicación del ADN mitocondrial y los mecanismos de mantenimiento aún están lejos de ser entendidos. En contraste con el ADNn, el genoma mitocondrial existe en múltiples copias, lo que proporciona una capa adicional para regular la expresión génica mitocondrial. Actualmente se sabe mucho menos sobre la distribución y segregación del ADNmt dentro de los orgánulos, en qué medida estos procesos están regulados y, si lo están, qué proteínas están involucradas¹³. El patrón de segregación es crucial cuando las células contienen una población mixta de ADNmt mutado y de tipo salvaje. Su distribución desigual puede conducir a la generación de células con una cantidad perjudicial de ADNmt mutado.

Hasta ahora, los factores proteicos necesarios para el mantenimiento del ADNmt se han identificado principalmente mediante métodos bioquímicos, análisis bioinformáticos o mediante estudios asociados a enfermedades. En este trabajo, con el fin de garantizar una alta probabilidad de identificar factores que previamente han escapado a la identificación, se describe una estrategia diferente. El método se basa en el etiquetado del ADNmt durante la replicación o reparación con 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), un análogo nucleósido de la timidina. BrdU se incorpora fácilmente en las hebras de ADN nacientes durante la síntesis de ADN y, en general, se utiliza para monitorear la replicación del ADN nuclear¹⁴. Sin embargo, el procedimiento desarrollado aquí ha sido optimizado para detectar BrdU incorporado en el ADNmt utilizando la inmunofluorescencia de anticuerpos anti-BrdU.

El enfoque permite la cuantificación de alto rendimiento de la síntesis y distribución de ADNmt en células humanas cultivadas in vitro. Es necesaria una estrategia de alto rendimiento para realizar pruebas en diferentes condiciones experimentales en un tiempo relativamente corto; Por lo tanto, en el protocolo se propone utilizar un formato de pocillos múltiples para el cultivo celular y microscopía de fluorescencia automatizada para la obtención de imágenes. El protocolo incluye la transfección de células HeLa humanas con una biblioteca de ARNip y el posterior monitoreo de la replicación o reparación del ADNmt utilizando el etiquetado metabólico del ADN recién sintetizado con BrdU. Este enfoque se combina con la inmunotinción del ADN con la ayuda de anticuerpos anti-ADN. Ambos parámetros se analizan mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa. Además, las mitocondrias se visualizan con un tinte específico. Para demostrar la especificidad del protocolo, se probó la tinción de BrdU en células desprovistas de ADNmt (células rho0), en células HeLa tras el silenciamiento de factores de mantenimiento de ADNmt bien conocidos y en células HeLa después del tratamiento con un inhibidor de la replicación del ADNmt. Los niveles de ADNmt también se midieron mediante un método independiente, a saber, qPCR.

Protocol

1. Preparación de la mezcla de siRNA

1. Un día antes del inicio del experimento, células semilla (por ejemplo, HeLa) en un plato de 100 mm para que alcancen una confluencia del 70% -90% al día siguiente.
   NOTA: Todas las operaciones deben realizarse en condiciones estériles en una cámara de flujo laminar.
2. Preparar la cantidad adecuada de siRNA diluido a una concentración de 140 nM en medio Opti-MEM (ver Tabla de materiales). Una placa de 96 pocillos se puede utilizar como depósito.
3. Agregue 5 μL de la solución de ARNip (o medio Opti-MEM para las muestras de control) a cada pocillo de una microplaca de cultivo celular negro de 384 pocillos.
   NOTA: Dependiendo del número de muestras de ARNip analizadas, se puede utilizar una pipeta electrónica o multicanal.
4. Prepare la cantidad adecuada de solución de reactivo de transfección RNAiMAX (consulte la Tabla de materiales) en medio Opti-MEM. Añadir 1 μL de RNAiMAX por cada 100 μL de medio.
5. Agregue 10 μL de la solución de reactivo de transfección a cada pocillo de la placa de 384 pocillos. La forma más conveniente y rápida de hacerlo es con un dispensador de reactivos.
6. Incubar el ARNip con el reactivo de transfección durante 30 min a temperatura ambiente.

2. Preparación de células para la transfección

1. Durante la incubación (paso 1.6), aspirar el medio con un dispositivo de succión (ver Tabla de materiales) y lavar las células con 3 ml de PBS.
2. Añadir 1,5 ml de tripsina diluida 1:2 en PBS, e incubar las células a 37 °C durante 10 min.
3. Compruebe si las células se han desprendido; si es así, agregue 3 ml de medio DMEM con 10% de FBS. Suspenda bien las células y transfiéralas a un tubo de 15 ml. Tome al menos 150 μL de la suspensión y cuente las células en una cámara de conteo de células (consulte la Tabla de materiales).
4. Prepare una suspensión celular a la concentración apropiada (35,000 / ml para la línea HeLa) en medio DMEM con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina.

3. Transfección celular

1. Agregue 20 μL de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de 384 pocillos utilizando el dispensador de reactivos. Esto resultará en 700 células sembradas por pozo.
2. Incubar las células durante 1 h a temperatura ambiente y, a continuación, colocarlas en la incubadora durante 72 h (37 °C y 5% de_CO2).

4. Incorporación de BrdU

1. Prepare una solución de 90 μM de BrdU (consulte la Tabla de materiales) en medio DMEM con 10% de FBS.
2. A las 56 h después de la transfección del ARNip (16 h antes de la fijación celular), añadir 10 μL de solución de BrdU de 90 μM a cada pocillo de la placa de 384 pocillos (la concentración final de BrdU es de 20 μM).
   NOTA: La acción debe realizarse lo más rápido posible; Por lo tanto, es mejor usar un dispensador de reactivos, una pipeta electrónica o una pipeta de múltiples dispensadores. Recuerde preparar pozos de control sin la adición de BrdU.
3. Incubar las células durante 16 h (37 °C y 5%_CO2).

5. Etiquetado de las mitocondrias

1. Prepare una solución de 20 μM de BrdU en DMEM con 10% de FBS, y agréguele la solución de colorante de seguimiento de mitocondrias (consulte la Tabla de materiales) a una concentración de 1.1 μM.
2. A las 15 h después del inicio de la incorporación de BrdU (1 h antes de la fijación celular), agregue 10 μL de la solución de colorante de seguimiento de mitocondrias (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo de la placa de 384 pocillos (la concentración final de colorante es de 200 nM).
   NOTA: Utilice un dispensador de reactivo, una pipeta electrónica o una pipeta de varios dispensadores. Recuerde retener los pozos de control sin la adición de BrdU, pero con la adición del tinte de seguimiento de las mitocondrias.
3. Incubar las células durante 1 h (37 °C y 5%_CO2).

6. Fijación celular

NOTA: Todo el lavado se realiza más convenientemente con una lavadora de microplacas, mientras que la adición de reactivos se realiza más rápidamente con un dispensador de reactivos.

1. Usando la lavadora de microplacas (ver Tabla de materiales), enjuague cada pocillo dos veces con 100 μL de PBS. Después del segundo lavado, deje 25 μL de PBS en el pozo.
   NOTA: Dejar PBS en el pozo reduce la probabilidad de desprendimiento celular durante la adición de líquido en el siguiente paso. Todos los lavados se completan con el PBS sobrante; por lo tanto, la solución agregada en el siguiente paso siempre debe prepararse a una concentración de 2x, ya que se agregará en un volumen igual al PBS restante.
2. Fijar las células añadiendo 25 μL de una solución de formaldehído al 8% en PBS con Triton X-100 al 0,4% y Hoechst 33342 a una concentración de 4 μg/ml (las concentraciones finales de reactivos individuales son 4%, 0,2% y 2 μg/ml, respectivamente) (ver Tabla de materiales).
3. Incubar el plato en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.

7. Bloqueo

1. Enjuague cada pocillo cuatro veces con 100 μL de PBS. Después del último lavado, deje 25 μL de PBS en el pozo.
2. Agregue 25 μL de BSA al 6% en PBS (la concentración final de BSA es del 3%) a cada pocillo.
3. Incubar el plato en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.

8. Adición de los anticuerpos primarios

1. Aspirar el BSA con una arandela de microplacas y dejar 10 μL de solución en el pozo.
2. Añadir 10 μL de la solución de anticuerpos primarios preparada en BSA al 3% en PBS. Use anti-BrdU a 0.8 μg/mL y anti-DNA a 0.4 μg/mL (las concentraciones finales de anticuerpos son 0.4 μg/mL y 0.2 μg/mL, respectivamente) (ver Tabla de materiales).
3. Incubar la placa en la oscuridad a 4 °C durante la noche.

9. Adición de los anticuerpos secundarios

1. Enjuague cada pocillo cuatro veces con 100 μL de PBS. Después del último lavado, deje 10 μL de PBS en el pozo.
2. Añadir 10 μL de la solución de 4 μg/ml de anticuerpos secundarios preparada en BSA al 6% en PBS (la concentración final es de 2 μg/ml). Utilice anticuerpos específicos del isotipo (IgG1 anti-ratón e IgM anti-ratón) conjugados a fluorocromos como Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 555 (ver Tabla de materiales).
3. Incubar el plato en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h.
4. Enjuague cada pocillo cuatro veces con 100 μL de PBS. Después del último lavado, deje 50 μL de PBS en el pozo.
5. Selle la placa con una película de sellado adhesiva (consulte la Tabla de materiales) y guárdela en la oscuridad a 4 °C. Las imágenes deben realizarse dentro de las 2 semanas.

10. Imágenes

NOTA: Las imágenes deben realizarse con un microscopio automatizado de campo amplio; El microscopio debe estar equipado con una etapa de motor suministrada con controles para obtener imágenes automáticas de áreas individuales de la placa.

1. Compruebe la configuración del enfoque automático en las áreas de esquina de la placa (pozos A1, A24, P24, P1) y en el centro.
   NOTA: Para la obtención de imágenes, se recomienda utilizar un objetivo de distancia de trabajo corta de 20x (consulte la Tabla de materiales) con la apertura numérica más alta posible.
2. En función de los histogramas de intensidad generados por el software de imágenes en el modo de visualización en vivo, seleccione un tiempo de exposición suficientemente largo para los canales de fluorescencia individuales para que la imagen resultante no esté sobresaturada.
3. Establezca el número adecuado de planos para obtener imágenes en el eje z.
   NOTA: El campo de visión con un aumento de 20x es lo suficientemente grande como para que no todas las celdas estén en el mismo plano de enfoque, por lo que se debe realizar una sección z para ver todas las celdas en su plano de enfoque correcto. Por lo general, cinco aviones son suficientes. Dependiendo de la disponibilidad de espacio en disco, se pueden guardar pilas z individuales o solo proyecciones de intensidad máxima. El análisis de imágenes que se muestra en la sección de resultados representativos se basa en proyecciones de intensidad máxima.
4. Seleccione el número adecuado de campos de vista para mostrar por pozo.
   NOTA: Dependiendo de la confluencia, se pueden obtener imágenes de aproximadamente 60-300 celdas en un campo de visión. Por lo general, para las células HeLa con una confluencia del 60% -90%, la imagen de cinco campos de visión permitirá analizar desde 500 células hasta más de 1,000 células.
5. Seleccione los pozos de los que desea obtener la imagen y comience a crear imágenes.

11. Análisis cuantitativo de imágenes

NOTA: El análisis cuantitativo de las imágenes adquiridas se puede realizar utilizando un software de código abierto como Cell Profiler¹⁵. Para el presente estudio, el análisis se realizó utilizando el software ScanR 3.0.0 (ver Tabla de Materiales).

1. Comience el análisis realizando la corrección de fondo para todas las imágenes de todos los canales de fluorescencia. Dependiendo del tamaño de los objetos analizados, seleccione el tamaño de filtro apropiado: 80 píxeles para núcleos celulares y 4 píxeles para puntos de BrdU y ADNmt.
2. Comience a segmentar la imagen creando una máscara del objeto principal basada en la relación entre la intensidad de la señal de fluorescencia y el fondo para el canal correspondiente a los núcleos celulares.
3. Cree máscaras para los subobjetos que representan los puntos BrdU y ADNmt, respectivamente, utilizando los canales de fluorescencia apropiados para las estructuras dadas.
   NOTA: Cada subobjeto se asigna al objeto principal más cercano (núcleo celular).
4. Establezca los parámetros que se medirán durante el análisis y mida la intensidad de los píxeles individuales dentro de cada máscara para todos los canales de fluorescencia.
   NOTA: También es necesario calcular el número de subobjetos asignados a un núcleo celular dado y el área de cada subobjeto.
5. Definir los parámetros derivados a calcular en base a los datos obtenidos. Para obtener las intensidades de fluorescencia totales para el canal BrdU o ADNmt, suma las intensidades de todos los subobjetos asignados a un núcleo celular dado. Para obtener la intensidad media de fluorescencia, divida la intensidad total de fluorescencia por la suma del área de los subobjetos asignados a un núcleo celular dado.
   NOTA: Para asegurarse de que el subobjeto creado (BrdU o punto de ADNmt) se encuentra realmente en las mitocondrias, es necesario protegerlos en función de la intensidad de fluorescencia del tinte de seguimiento de las mitocondrias.
6. Realice un análisis más detallado de los datos obtenidos con el software ScanR utilizando el software estadístico R 4.2.2¹⁶ junto con los siguientes paquetes: dplyr 17, data.table¹⁸, ggplot2¹⁹ y ggpubr²⁰. Este paso es opcional.

Results

En la Figura 1 se muestra un esquema del procedimiento para el estudio de alto rendimiento de la dinámica de la síntesis y distribución del ADNmt. El uso de un formato de placa de múltiples pocillos permite el análisis simultáneo de muchas condiciones experimentales diferentes, como el silenciamiento de diferentes genes utilizando una biblioteca de ARNsi. Las condiciones utilizadas para el etiquetado de moléculas de ADN recién sintetizadas con BrdU permiten la detección de ADN marcado con Br...

Discussion

Históricamente, el etiquetado de ADN por incorporación de BrdU y detección de anticuerpos se ha utilizado en la replicación del ADN nuclear y la investigación del ciclo celular 14,27,28. Hasta ahora, todos los protocolos para detectar ADN marcado con BrdU han incluido un paso de desnaturalización del ADN (ácido o térmico) o digestión enzimática (DNasa o proteinasa) para permitir la exposición al epítopo y facilitar la penetració...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Didesoxicitidina (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Microplacas de cultivo celular de pozos,	Greiner Bio-One	#781946
negro 5-Bromo-2′-deoxyuridina (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Disuelva el polvo de BrdU en agua hasta 20 mM de solución madre y alícuota. Uso 20 µ M BrdU solución para etiquetado.
Película de sellado adhesiva	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario IgG1 anti-ratón	de cabra Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 anticuerpo secundario IgM anti-ratón de cabra	Thermo Fisher Scientific	A-21426
Lavadora de microplacas BioTek 405 LS	Albúmina
BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cámara de recuento de células Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Suero fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Solución de formaldehído	Sigma-Aldrich	F1635	El formaldehído es tóxico; lea atentamente la hoja de datos de seguridad.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 anticuerpo primario monoclonal de ratón anti-BrdU (IIB5)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM anticuerpo primario monoclonal de ratón anti-ADN (AC-30-10)	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Reactivo de transfección	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Tinte de seguimiento de mitocondrias
Dispensador de reactivos combinado multigota	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) Cámara CCD	Hamamatsu
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
imprimación qPCR Fw B2M (referencia)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
cebador qPCR Fw GPI (gen de referencia)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
cebador qPCR Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
cebador qPCR Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
imprimación qPCR Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
cebador qPCR Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
cebador qPCR Rev B2M (referencia)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
cebador qPCR Rev GPI (gen de referencia)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
cebador qPCR Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
cebador de qPCR Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
cebador de qPCR Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
cebador de qPCR Rev TWNK			AACATTGTCTCTTCCTGGC
Microscopio ScanR	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Dispositivo de succión	NeoLab	2-9335	Dispositivo de succión para cultivo celular
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Tripsina	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objetivo	Olimpo