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Artículo de método

Lesión no invasiva del ligamento cruzado anterior (LCA) inducida por compresión e imágenes in vivo de la actividad de la proteasa en ratones

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DOI:

10.3791/65249

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29 de septiembre de 2023

 , 
1Lawrence J. Ellison Musculoskeletal Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of California Davis Health

En este artículo

Resumen

La lesión no invasiva del LCA es un método fiable y clínicamente relevante para iniciar la osteoartritis postraumática (PTOA) en ratones. Este método de lesión también permite la cuantificación in vivo de la actividad de la proteasa en la articulación en puntos de tiempo tempranos después de la lesión utilizando sondas de infrarrojo cercano activables por proteasa e imágenes de reflectancia de fluorescencia.

Resumen

Las lesiones articulares traumáticas, como la rotura del ligamento cruzado anterior (LCA) o las roturas de menisco, suelen provocar artrosis postraumática (PTOA) en un plazo de 10 a 20 años tras la lesión. Comprender los procesos biológicos tempranos iniciados por lesiones articulares (p. ej., inflamación, metaloproteinasas de matriz (MMP), proteasas de catepsina, resorción ósea) es crucial para comprender la etiología de PTOA. Sin embargo, hay pocas opciones para la medición in vivo de estos procesos biológicos, y las respuestas biológicas tempranas pueden confundirse si se utilizan técnicas quirúrgicas invasivas o inyecciones para iniciar la artrosis. En nuestros estudios de PTOA, hemos utilizado sondas activables de proteasa de infrarrojo cercano disponibles comercialmente combinadas con imágenes de reflectancia de fluorescencia (FRI) para cuantificar la actividad de la proteasa in vivo después de una lesión no invasiva del LCA inducida por compresión en ratones. Este método no invasivo de lesión del LCA recapitula fielmente las condiciones de lesión clínicamente relevantes y es completamente aséptico, ya que no implica alterar la piel ni la cápsula articular. La combinación de estos métodos de lesión e imagen nos permite estudiar el curso temporal de la actividad de la proteasa en múltiples puntos de tiempo después de una lesión articular traumática.

Introducción

La osteoartritis es un problema de salud generalizado que afecta a millones de personas enlos Estados Unidos. La osteoartritis postraumática (PTOA, por sus siglas en inglés) es un subconjunto de la artrosis que se inicia por una lesión articular, como la rotura del ligamento cruzado anterior (LCA), una lesión de menisco o una fractura intraarticular2. La proporción de pacientes con artrosis sintomática que se pueden clasificar como PTOA es de al menos el 12%3, y esta etiología suele afectar a una población más joven que la artrosis idiopática4. Los modelos murinos de artrosis son herramientas cruciales para investigar la etiología de la enfermedad y los posibles tratamientos para la artrosis en un plazo mucho más corto (4-12 semanas en modelos de ratón en comparación con 10-20 años en humanos). Sin embargo, los métodos para iniciar la artrosis en ratones suelen implicar técnicas quirúrgicas invasivas como la transección 5,6 del LCA, la extirpación o desestabilización del menisco medial 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, o una combinación de ambas 17,18,19, que no reproducen condiciones de lesión clínicamente relevantes. Los modelos quirúrgicos también exacerban la inflamación en la articulación debido a la alteración de la cápsula articular, lo que podría acelerar la progresión de la artrosis.

Los modelos de ratón con lesión de rodilla no invasiva brindan la oportunidad de estudiar los cambios biológicos y biomecánicos en los primeros momentos posteriores a la lesión y pueden arrojar resultados clínicamente más relevantes20. Nuestro laboratorio ha establecido un modelo de lesión no invasivo que utiliza una única sobrecarga de compresión tibial aplicada externamente para inducir la rotura del ligamento cruzado anterior (LCA) en ratones 21,22,23,24. Este método de lesión no invasivo es capaz de producir una lesión articular aséptica sin alterar la piel o la cápsula articular.

La imagen de reflectancia de fluorescencia (FRI) es un método de imagen óptica que consiste en excitar un objetivo con luz infrarroja en una longitud de onda específica y cuantificar la luz reflejada emitida en otra longitud de onda. Las sondas específicas de proteasa disponibles en el mercado se pueden inyectar en modelos animales y la FRI se puede utilizar para cuantificar la actividad de la proteasa en sitios específicos, como la articulación de la rodilla. Este método ha sido ampliamente utilizado para la detección in vivo de actividades biológicas como la inflamación. Las sondas utilizadas para esta aplicación se apagan con fluorescencia hasta que encuentran proteasas relevantes. Esas proteasas romperán un sitio de escisión enzimática en las sondas, después de lo cual producirán una señal fluorescente de infrarrojo cercano. Estas sondas y este método de imagen han sido ampliamente validados y utilizados en estudios de cáncer 25,26,27,28 y aterosclerosis 29,30,31,32, y nuestro grupo los ha utilizado para estudios del sistema musculoesquelético para medir marcadores de inflamación y degradación de la matriz 23,24,33.

Juntas, la lesión articular no invasiva combinada con FRI in vivo y sondas activables por proteasa proporcionan una capacidad única para rastrear la inflamación y la actividad de la proteasa después de una lesión articular traumática. Este análisis se puede realizar tan pronto como horas o incluso minutos después de la lesión, y el mismo animal puede ser evaluado varias veces para estudiar el curso temporal de la actividad de la proteasa en la articulación. Es importante destacar que este método de imagen puede no ser factible cuando se combina con modelos quirúrgicos de artrosis, ya que la alteración de la piel y la cápsula articular da como resultado una señal de fluorescencia que confundiría la señal desde el interior de la articulación.

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California Davis. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de 3 meses de edad.

1. Lesión no invasiva del LCA

NOTA: La lesión del LCA producida por una carga compresiva aplicada externamente es un método simple y reproducible que recapitula fielmente las condiciones de lesión del LCA en humanos. Este protocolo está escrito para un instrumento de bastidor de carga disponible comercialmente (véase la Tabla de materiales), pero podría adaptarse para sistemas similares.

  1. Abra el software compatible con el instrumento del bastidor de carga (consulte Tabla de materiales) y seleccione un archivo de control existente o cree un nuevo archivo.
  2. Encienda el actuador.
  3. En el menú de calibración, tara la lectura de fuerza de la célula de carga y ajuste el desplazamiento del actuador a 0.
  4. Use isoflurano inhalado al 1%-4% en oxígeno para anestesiar a los ratones y asegurarse de que los animales estén completamente anestesiados pellizcando los dedos de los pies y / o la cola.
  5. Coloque el ratón en posición prona sobre la plataforma. Coloque la pata inferior verticalmente entre dos accesorios de carga (Figura 1) (consulte la Tabla de materiales). Coloque el pie en el recorte del accesorio superior y la rodilla en la copa del accesorio inferior.
  6. Ajuste manualmente la altura del accesorio inferior para aplicar una precarga de 1-2 N (monitoreada en tiempo real en la pantalla de la computadora) y apriete el tornillo de fijación para mantener la posición. La precarga es necesaria para mantener la pierna en la posición correcta antes de aplicar la carga de lesión.
  7. Aplique una sola carga de compresión a una fuerza objetivo (~12-15 N) o desplazamiento objetivo (~1,5-2,0 mm).
    NOTA: La aplicación de la carga a una velocidad de carga más lenta (~1 mm/s) proporcionará un mayor nivel de monitoreo y control en tiempo real, pero probablemente resultará en una falla por avulsión del LCA. La aplicación de una tasa de carga más rápida (~200 mm/s) tendrá más probabilidades de producir una lesión del LCA de sustancia media22. Si se determina que se ha producido una fractura de tibia u otra lesión excesiva, se aplica la eutanasia al animal utilizando un método aprobado por la IACUC antes de que el animal se recupere de la anestesia.
    1. Establezca la velocidad de carga en el archivo de control del software y confirme utilizando los datos de desplazamiento de fuerza.
      NOTA: La fractura ósea durante la carga de compresión tibial generalmente no es una preocupación, ya que la fuerza de fractura (~ 20 N) es considerablemente mayor que la fuerza de la lesión del LCA. Sin embargo, esto debe controlarse con palpación, y se pueden utilizar imágenes (es decir, radiografías) para confirmar que no se han producido fracturas de tibia.
  8. Por lo general, la lesión se indica con un sonido ("clic" o "crujido") y una liberación de fuerza que es identificable en los gráficos de fuerza-desplazamiento (Figura 1C). Si se utiliza una velocidad de carga más lenta, detenga la carga de compresión inmediatamente después de la lesión para evitar una mayor carga y posibles daños a otros tejidos articulares.
    NOTA: La lesión del LCA generalmente ocurre a 8-15 N dependiendo de la masa corporal34. Es importante establecer una fuerza objetivo mayor que la fuerza de lesión anticipada del LCA.
  9. Confirmar la lesión del LCA mediante una prueba de cajón antero-posterior35,36 o una evaluación comparable de la inestabilidad articular.
  10. Administrar una dosis dependiente del peso del animal (p. ej., 0,05-0,1 mg/kg SC o IP de buprenorfina, ver Tabla de materiales) a los ratones después de la lesión, con la duración y la dosis recomendadas y aprobadas por la institución de origen IACUC.
    NOTA: Los AINE pueden alterar la progresión del PTOA después de la lesión, por lo que no se recomienda el uso de AINE para el tratamiento del dolor en este modelo de lesión, a menos que sea un objetivo específico del estudio.

2. Preparación de animales para la obtención de imágenes FRI

NOTA: Para las imágenes ópticas, el pelaje de los animales (particularmente el pelaje oscuro) es muy eficaz para bloquear, absorber y dispersar la luz, por lo tanto, el pelaje debe eliminarse tanto como sea posible del área alrededor de las articulaciones de la rodilla antes de tomar imágenes. Una crema depilatoria suele ser más eficaz para eliminar el pelo que las tijeras. Los ratones desnudos o sin pelo no requieren la eliminación del pelo. Sin embargo, la eliminación del pelo es necesaria para las cepas de ratón más utilizadas (por ejemplo, C57BL/6). Si es posible, alimente a los ratones con alimentos purificados de baja fluorescencia antes de tomar imágenes. La comida estándar para ratones contiene clorofila, que emite autofluorescencia con una longitud de onda de alrededor de 700 nm y puede afectar la recopilación de datos del sistema FRI de infrarrojo cercano.

  1. Anestesiar ratones con isoflurano inhalado al 1%-4% en oxígeno. Mantenga a los ratones en una almohadilla térmica tanto como sea posible y aplique ungüento para los ojos para evitar la irritación de los ojos.
  2. Use un hisopo de algodón para aplicar crema depilatoria (ver Tabla de materiales) en la cara anterior (craneal) de las patas de los ratones alrededor de la articulación de la rodilla.
  3. Deje reposar la crema durante ~ 1 minuto, luego use toallitas para quitar la crema y el pelaje de la pierna. Repita si es necesario.
  4. Una vez que las articulaciones de las rodillas estén completamente expuestas sin que el pelo cubra el área, limpie las piernas con toallitas con alcohol para eliminar cualquier resto de crema depilatoria.
    NOTA: La crema depilatoria se puede usar en los mismos ratones varias veces a lo largo de un estudio, pero estas aplicaciones deben realizarse con al menos una semana de diferencia para evitar la irritación innecesaria de la piel.

3. Preparación de la solución de la sonda

  1. Si es necesario, diluya la sonda activable por fluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 1x. Un vial de la sonda disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) contiene típicamente 20 nmol en 0.15 mL de 1x PBS. Para diluir la solución en el vial, agregue 1,35 ml de 1x PBS para hacer 20 nmol en 1,5 ml de 1x PBS.
    NOTA: Después de la dilución, se puede usar un vial para obtener imágenes de diez ratones al inyectar 0,15 ml por ratón.
  2. Agite la solución con una velocidad mínima (~ 2000 rpm) durante 30 s para asegurarse de que la sonda se disuelva en la solución y luego centrifugue brevemente para asegurarse de que todo el líquido esté fuera de la tapa.
    NOTA: La solución puede almacenarse a 2-8 °C en un lugar protegido de la luz durante un máximo de 12 meses.

4. Inyección retroorbitaria

NOTA: Refiérase a Yardeni et al. sobre los detalles de este procedimiento37.

  1. Use isoflurano inhalado al 1%-4% en oxígeno para anestesiar ratones y coloque al ratón de lado con el hocico en un cono nasal.
  2. Utilice jeringas de insulina de ~29 G para la inyección de la solución de sonda (preparada en el paso 3).
  3. Mantenga la jeringa cubierta antes de usarla para evitar la exposición a la luz.
  4. Al administrar la inyección:
    1. Inyecte en el interior del ojo (carúnculo lagrimal) y asegúrese de que el bisel de la jeringa esté inclinado hacia el ojo. Para las personas diestras, se recomienda inyectar en el ojo derecho del ratón con el animal mirando hacia la derecha.
    2. Con la mano que no se inyecta, tire suavemente hacia atrás de la piel alrededor del ojo para estabilizar la cabeza y hacer que el ojo sobresalga.
    3. Inclina la jeringa paralela al cuerpo del ratón.
    4. Avance suavemente la jeringa más allá del ojo hasta que encuentre una resistencia rígida; No intentes ir más allá de este punto.
    5. Inyecte lentamente la solución de la sonda en el seno retroorbitario y, a continuación, saque lentamente la aguja de la cuenca del ojo. Si no sale ninguna solución con la aguja, la inyección es exitosa.
    6. Aplique solución salina o ungüento para los ojos en el ojo inyectado.
      NOTA: Según la documentación proporcionada con las sondas de imagen, el tiempo óptimo de obtención de imágenes suele ser de entre 1 y 2 días después de la inyección de la solución de sonda. Si es posible, se recomienda realizar un cribado de tiempo inicial para determinar el tiempo óptimo de obtención de imágenes para cada aplicación específica. Los ratones metabolizarán la sonda inyectada en un plazo aproximado de 7 días, después de lo cual será necesario inyectar una nueva dosis de solución de sonda si se desean puntos de tiempo adicionales.

5. Imágenes de reflectancia de fluorescencia

NOTA: Los procedimientos de esta sección son específicos de un sistema de imágenes ópticas disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales). Se pueden realizar imágenes similares con sistemas comparables.

  1. Anestesiar a los ratones con isoflurano inhalado al 1%-4% en oxígeno y colocar al animal en decúbito supino en el sistema de imágenes con el hocico en un cono nasal.
  2. Coloque el ratón con la parte inferior de las piernas extendida de modo que las rodillas apunten ligeramente en el aire (puede ser necesario pegar los pies con cinta adhesiva). Es fundamental que se utilice un posicionamiento coherente para todos los animales.
  3. Abra el software compatible (consulte la Tabla de materiales) en la computadora del sistema de imágenes; aparecerá el "Panel de control de adquisición".
  4. Para calentar el sistema, haga clic en Inicializar y espere hasta que la luz de temperatura se vuelva verde.
  5. Haga clic en Asistente de imágenes y asegúrese de que aparezca la ventana "Asistente de imágenes".
  6. Haga clic en Par de filtros y asegúrese de que la configuración esté en 'Epi-Illumination', luego presione Siguiente.
  7. Para seleccionar los ajustes correctos de excitación/emisión, busque la sonda de interés en la lista desplegable. Si no se puede encontrar la sonda correcta, busque el nombre 'Input Ex/Em' y escriba manualmente el valor de Excitation Peak y Emission Peak en función de la propiedad de la sonda que se va a utilizar (por ejemplo, para Excitation Peak, ingrese 675 y para Emission Peak, ingrese 720). Haga clic en Siguiente.
  8. Elija el ratón para "Sujeto de imagen". En "Parámetros de exposición", asegúrese de que la opción Ajustes automáticos esté marcada y de que las opciones Fluorescente y Fotografía estén seleccionadas. Seleccione D-22,6 cm en la lista de verificación de "Campo de visión". Presione Siguiente.
  9. La configuración de la imagen se puede ver y modificar en el panel derecho del "Panel de control de adquisición". Asegúrese de que todos los ajustes sean correctos y presione el botón Adquirir secuencia . Después de que aparezca la imagen, confirme que la imagen tuvo una exposición adecuada. De lo contrario, cambie la configuración del tiempo de exposición y haga clic en Adquirir secuencia nuevamente.
  10. Para analizar la imagen, coloque un círculo de región de interés (ROI) con un tamaño constante sobre cada articulación de la rodilla en la imagen en blanco y negro (esto evita el posicionamiento sesgado en función de las áreas de señal fluorescente).
  11. Calcule la eficiencia radiante total y/o la eficiencia radiante promedio para cada articulación de la rodilla. Si la eficiencia radiante también se calcula en las piernas contralaterales, normalice los datos dividiendo la medición de la eficiencia radiante de la pierna lesionada por la medición de la eficiencia radiante de la pierna contralateral.
    NOTA: Si se utiliza una región de interés con un área constante para todas las rodillas, tanto la eficiencia radiante total como la eficiencia radiante promedio producirán resultados similares. Se recomienda utilizar una eficiencia radiante media si se utilizan regiones de interés con diferentes tamaños. La normalización de los datos de eficiencia radiante de la articulación lesionada con los datos de la rodilla contralateral no lesionada proporcionará un control interno para tener en cuenta cualquier diferencia en la cantidad de sonda inyectada y la eficiencia de administración entre diferentes animales.

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Resultados

Después de aplicar una sola fuerza de compresión (1 mm/s hasta la lesión) en la parte inferior de las piernas de ratones machos C57BL/6J de 3 meses de edad, la lesión del LCA se indujo consistentemente en todos los ratones. La fuerza de compresión promedio en la lesión de rodilla fue de aproximadamente 10 N (Figura 1).

El análisis de FRI mostró una actividad de proteasa significativamente mayor en las articulaciones lesionadas de ratones sometidos a una lesión no ...

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Discusión

Este protocolo ha establecido y descrito rigurosamente un método reproducible y no invasivo para inducir la lesión del LCA en ratones 20,21,24,33. Este método de lesión simple y eficiente se puede realizar en solo unos minutos, lo que facilita estudios de alto rendimiento de PTOA. Este método de lesión también recapitula de cerca las condiciones de lesión relevantes para la lesión del LCA human...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel, parte de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el número de adjudicación R01 AR075013.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10x Tejido salino tamponado con fosfatoProtechPBS01-32Ro equivalente
de anestesia de aireVaporizador de isoflurano con cámara de inducción y cono nasal
BuprenorfinaAnalgésico post-lesión 
Crema depilatoriaVeetB001KYPZ4Go equivalente
AccesoriosAccesorio de rodilla, accesorio de tobillo y plataforma hechos a medida
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262También puede utilizar el sistema de imágenes ópticas comparable
KimwipesKimberly-Clark Corporation06-666o
el software Living Image equivalente Perkin Elmer
Sistemas de ensayo de materiales TA InstrumentsElectroforce 3200 o equivalente
ProSense680Perkin ElmerNEV10003También puede utilizar otras sondas como OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Jeringa estéril con espectro de agujaChemical Mfg. Corp.550-82231-CSJeringa Covidien TB de 1 mL con 28 G x 1/2 pulg. Aguja, estéril o equivalente
Célula de carga uniaxialTA Instruments20 N de capacidad
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc.SI-0236o software WinTest equivalente
 Instrumentoscompatibles con Electroforce 3200
Sistema TA

Referencias

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