Disección de estrías vasculares de ratón adulto para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción

Resumen

La estría vascular es vital para la generación de potencial endococlear. Aquí, presentamos la disección de la estría vascular del ratón adulto para la secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción.

Resumen

El potencial endococlear, que es generado por la estría vascular, es esencial para mantener un entorno propicio para la mecanotransducción adecuada de las células ciliadas y, en última instancia, la audición. Las patologías de la estría vascular pueden resultar en una disminución de la audición. La disección de la estría vascular adulta permite la captura focalizada de un solo núcleo y la posterior secuenciación e inmunotinción de un solo núcleo. Estas técnicas se utilizan para estudiar la fisiopatología de la estría vascular a nivel unicelular.

La secuenciación de un solo núcleo se puede utilizar en el contexto del análisis transcripcional de la estría vascular. Mientras tanto, la inmunotinción sigue siendo útil para identificar poblaciones específicas de células. Ambos métodos requieren una disección adecuada de la estría vascular como requisito previo, lo que puede resultar técnicamente desafiante.

Introducción

La cóclea consiste en tres cámaras llenas de líquido, la scala vestibuli, la scala media y la scala tympani. La scala vestibuli y la scala tympani contienen perilinfa, que tiene una alta concentración de sodio (138 mM) y una baja concentración de potasio (6,8 mM)¹. La escala media contiene endolinfa, que tiene una alta concentración de potasio (154 mM) y una baja concentración de sodio (0,91 mM)^1,2,3. Esta diferencia en la concentración de iones puede denominarse potencial endococlear (EP), y se genera principalmente por el movimiento de iones de potas....

Protocolo

Todos los experimentos y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerd....

Resultados

Presentamos un método para aislar el SV que se utilizará para sNuc-Seq o inmunotinción. La anatomía relevante (Figura 1) de la cóclea en relación con la SV puede ayudar a los usuarios a comprender mejor la organización de la SV y los pasos del protocolo de disección.

Cada paso de esta microdisección de SV desde un mouse P30 se detalla en el video asociado, y las instantáneas de los pasos clave de esta disección y aislamiento de SV se presentan en la

Discusión

Antes del advenimiento de la secuenciación de células individuales, muchos investigadores utilizaron el análisis de tejido a granel, que solo hizo posible analizar transcriptomas promediados en las células. En particular, la célula única y sNuc-Seq permitieron aislar el transcriptoma de una sola célula o de un solo núcleo, respectivamente³². En este caso, se pueden identificar transcriptomas de un solo núcleo para células marginales, intermedias y basales, así como para células fusiformes

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10-y micro; m filter (Polietilentereftalato)	PluriSelect	#43-50010-01	Tejido filtrante durante sNuc-Seq
18 x 18 mm cubreobjetos	Fisher Scientific	12-541A	Cubreobjetos para montaje SV
30-µ m filter (Polietilentereftalato)	PluriSelect	#43-50030-03	Tejido filtrante durante sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus	Microslide Daigger	EF15978Z	Microslide para montar SV en
ratones C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Cepa de ratón de propósito general que tiene pigmento que se ve más fácilmente en las células intermedias del SV.
Contador	de células Logos Biosystems	L20001	Se utiliza para el recuento de células
Cureta Chalizon 5'', tamaño 3 2.5 mm	Instrumentos de investigación biomédica	15-1020	Se utiliza para transferir SV
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Genera bibliotecas de expresión génica de 3' de una sola célula
Esmalte de uñas transparente	Fisher Scientific	NC1849418	Se utiliza para sellar placas de
cultivo de tejidos estándar Corning Falcon de montura SV, 24 pocillos	Corning	08-772B Placa de	cultivo utilizada para sostener la muestra durante la disección
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Tinción utilizada para el etiquetado de núcleos
Homogeneizador Dounce	Sigma-Aldrich	D8938	Se utiliza para homogeneizar tejido para pinzas
	sNuc-seq Dumont #5Fine Science Tools	11252-30	Pinzas generales para disección Pinzas
Dumont #55 Pinzas	Fine Science Tools	11255-20	Pinzas con punta fina que facilita la manipulación de SV
Suero fetal bovino	ThermoFisher	16000044	Se utiliza para los pasos de sNuc-Seq
Pegamento en barra	Fisher Scientific	NC0691392	Se utiliza para el montaje de SV
GS-IB4 Anticuerpo	Molecular Sondas	I21411, RRID: AB-2314662	Anticuerpo utilizado para el marcaje capilar
KCNJ10-ZsGreen Ratones	n/a	n/a Ratón	transgénico que expresa KCNJ10-ZsGreen, particularmente en las células intermedias del SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	utilizado para los pasos de sNuc-Seq
Reactivo de montaje	ThermoFisher	#S36940	Reactivo de montaje para SV
Multiwell Placa de 24 pocillos	Corning	#353047	Placa utilizada para la inmunotinción
NaCl	ThermoFisher AAJ216183		Se utiliza para los pasos de sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Se utiliza para los pasos de sNuc-Seq
Agua libre de nucleasa	ThermoFisher	4387936	Se utiliza para los pasos de sNuc-Seq
Agitador orbital	Silent Shake	SYC-2102A	Se utiliza para los pasos de inmunotinción
PBS	ThermoFisher	J61196. AP	Se utiliza para los pasos de inmunotinción y disección
ARN posterior	Invitrogen	AM7021	Se utiliza para la conservación de SV para sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Se utiliza para dividir el cráneo del ratón
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Se utiliza para los pasos de sNuc-Seq
Tinción de azul de tripano	Gibco	15250061	Se utiliza para el recuento de células
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Se utiliza para los pasos de sNuc-Seq
Microscopio estereoscópico Zeiss STEMI SV 11 Apo	Microscopio Zeiss	n/a	utilizado para disecciones