Sistema de pseudoislotes humanos para la evaluación sincrónica de la dinámica de biosensores fluorescentes y perfiles de secreción de hormonas

Resumen

Este protocolo describe un método para la adquisición sincrónica y el co-registro de eventos de señalización intracelular y la secreción de insulina y glucagón por pseudoislotes humanos primarios utilizando la administración adenoviral de un biosensor de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), un detector de diferencia de cAMP in situ (cADDis) y un sistema de microperifusión.

Resumen

Los islotes pancreáticos de Langerhans, que son pequeñas colecciones 3D de células endocrinas y de soporte especializadas intercaladas por todo el páncreas, tienen un papel central en el control de la homeostasis de la glucosa a través de la secreción de insulina por parte de las células beta, que reduce la glucosa en sangre, y glucagón por parte de las células alfa, que eleva la glucosa en sangre. Las vías de señalización intracelular, incluidas las mediadas por AMPc, son clave para la secreción regulada de hormonas alfa y beta de las células. La estructura 3D de los islotes, si bien es esencial para la función coordinada de los islotes, presenta desafíos experimentales para los estudios mecanicistas de las vías de señalización intracelular en las células primarias de los islotes humanos. Para superar estos desafíos y limitaciones, este protocolo describe una plataforma integrada de imágenes de células vivas y microfluídica que utiliza pseudoislotes humanos primarios generados a partir de donantes sin diabetes que se asemejan a los islotes nativos en su morfología, composición y función. Estos pseudoislotes están controlados por tamaño a través del proceso de dispersión y reagregación de las células primarias de los islotes humanos. En el estado disperso, la expresión génica de las células de los islotes se puede manipular; por ejemplo, se pueden introducir biosensores como el biosensor de AMPc codificado genéticamente, cADDis. Una vez formados, los pseudoislotes que expresan un biosensor codificado genéticamente, en combinación con la microscopía confocal y una plataforma de microperifusión, permiten la evaluación sincrónica de la dinámica de los biosensores fluorescentes y los perfiles de secreción de hormonas de las células alfa y beta para proporcionar más información sobre los procesos y la función celular.

Introducción

Los islotes de Langerhans son mini órganos repartidos por todo el páncreas cuya función es crucial para el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa. La insulina es secretada por las células beta tras el metabolismo de la glucosa, el aumento de la relación ATP/ADP, el cierre de los canales de potasio sensibles al ATP, la despolarización de la membrana plasmática y la entrada de calcio extracelular^. La secreción de glucagón de las células alfa es menos conocida, pero se ha postulado que las vías intracelulares y paracrinas contribuyen a la exocitosis de los gránulos de glucagón ^2,3,4....

Protocolo

Los islotes humanos (preparaciones N = 4) se obtuvieron a través de asociaciones con el Programa Integrado de Distribución de Islotes, el Programa de Análisis de Páncreas Humano, Prodo Laboratories, Inc. e Imagine Pharma. La Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Vanderbilt no considera especímenes pancreáticos humanos no identificados como investigación con sujetos humanos. Este trabajo no sería posible sin los donantes de órganos, sus familias y las organizaciones de procuración de órganos. Consulte la Tabla 1 para obtener información demográfica de los donantes. Se aislaron islotes humanos de donantes de páncreas sin diabetes con meno....

Resultados

Los pseudoislotes humanos que expresan biosensores se crearon a través de la administración adenoviral de construcciones que codifican el biosensor cAMP cADDis (Figura 1A). La Figura 1B muestra la reagregación de las células de los islotes humanos transducidos a lo largo del tiempo, con pseudoislotes completamente formados observados después de 6 días de cultivo. Las células comenzaron a mostrar fluorescencia visible de cADDis dentro de las 48 h, y hubo.......

Discusión

La integración de un sistema de microperifusión, pseudoislotes que expresan biosensores y microscopía confocal de barrido láser permite la evaluación sincrónica de los eventos de señalización intracelular y los perfiles dinámicos de secreción de hormonas. El sistema dinámico de microperifusión puede entregar una serie de estímulos bien definidos a los pseudoislotes y permite la recolección del efluente, en el que las concentraciones de insulina y glucagón pueden medirse mediante ELISA disponible comercialmente. Al mismo .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ad-CMV-cADDis	Welgen	No aplicable
0.01" Tubo FEP	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriquecido con CMRL Componente de medios
1,5 mL y tubos cónicos	Cualquiera	Cualquiera
10 μ m Filtro de PTFE	Cole-Parmer	SK-21940-41	Cambiar cada 8-10
carreras 100 mM de piruvato de sodio	Thermo Scientific	11360070	Componente de medios CMRL enriquecido
prueba de 190 grados Etanol	Decon Labs	2816	Componente de etanol ácido
200 mM Suplemento GlutaMAX-I	Gibco	35050061	Componente de medios CMRL enriquecido
Ascorbato	Sigma	A5960	DMEM Componente tampón de perifusión
Albúmina sérica bovina	Sigma	A7888	DMEM Componente tampón de perifusión
Trampa de burbujas	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA  Microplacas de 96 pocillos	Perkin Elmer	6055330
cellSens software de análisis Olympus		v3.1	Software utilizado para el análisis de datos
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Componente de medio CMRL enriquecido
Adaptador cónico (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucosa	Sigma	G7528	Componente tampón de glucosa
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Componente tampón de perifusión Cámara
ambiental	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Componente tampón de estimulación
Suero fetal bovino (FBS), inactivado por calor	Sigma	12306C	Enriquecido-CMRL Componente de medios
glucagón ELISA	Mercodia	10-1281-01
Kit de glucagón HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Cualquiera	Cualquier	componente de etanol
ácido HEPES	Sigma	H7523	DMEM Componente de tampón de perifusión
iCell Células endoteliales Suplemento de medio	Cell Dynamics	M1019	iEC Componente de medios
Idex Tuerca y férula Derlin 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulina ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutilmetiltilonina (IBMX)	Sigma	I5879	Componente de tampón de estimulación
Microscopio confocal de barrido láser	Olympus	FV3000
L-glutamina	Sigma	G8540	DMEM Componente de tampón de perifusión
Microchip (Universidad de Miami, FP-3W)	Universidad de Miami	Soporte de microchip FP-3W
	Colector de fracciones Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
modelo 2110	Biorad	7318122
pipetas y puntas P10, P200 y P1000	Cualquiera	Cualquier
penicilina/estreptomicina	Gibco	15140-122	Componente de medio CMRL enriquecido
Bomba peristáltica	Instech	P720
Solución salina tamponada con fosfato	Gibco	14190-144	Wash Islotes
Platos Sarstedt Sarstedt		depende del diámetro del
Bicarbonato de sodio	Sigma	S6014	DMEM Componente tampón de perifusión
Piruvato de sodio	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μ m)	Millipore	SCGP00525	Filtrar todos los tampones dos veces
VascuLife VEGF Medio Kit completo LifeLine	Technology	LL-0003	iEC Componente de medios