Summary
Detta protokoll beskriver proceduren för genomredigering i makrofager från benmärg från möss med hjälp av Cas9-sgRNA-ribonukleoproteinkomplex som sätts samman in vitro och levereras genom elektroporering.
Abstract
Benmärgsderiverade makrofager (BMDM) från möss är ett viktigt verktyg för att studera den komplexa biologin hos vävnadsmakrofager. Som primära celler modellerar de fysiologin hos makrofager in vivo närmare än odödliga makrofagcellinjer och kan härledas från möss som redan bär på definierade genetiska förändringar. Att störa genfunktionen i BMDM är dock fortfarande tekniskt utmanande. Här tillhandahåller vi ett protokoll för effektiv CRISPR/Cas9-genomredigering i BMDM, vilket möjliggör införandet av små insättningar och deletioner (indels) som resulterar i frameshift-mutationer som stör genfunktionen. Protokollet beskriver hur man syntetiserar enkelstyrande RNA (sgRNA-Cas9) och bildar renade sgRNA-Cas9-ribonukleoproteinkomplex (RNP) som kan levereras genom elektroporering. Det ger också en effektiv metod för att övervaka redigeringseffektiviteten med hjälp av rutinmässig Sanger-sekvensering och ett fritt tillgängligt online-analysprogram. Protokollet kan utföras inom 1 vecka och kräver ingen plasmidkonstruktion; Det resulterar vanligtvis i 85 % till 95 % redigeringseffektivitet.
Introduction
Makrofager är medfödda immunceller som spelar en avgörande roll för vävnadsreparation och immunitet 1,2. Odödliga makrofagcellinjer, såsom RAW 264.7-celler från möss eller humana THP-1-celler, har flera fördelaktiga egenskaper, inklusive robust tillväxt och enkel genstörning genom att leverera vektorer för RNA-interferens eller CRISPR/Cas9 3,4. Onkogena transformationer förändrar dock dramatiskt deras fysiologi, vilket resulterar i avvikande aktivering av vissa vägar och dämpade reaktionerhos andra. Primära benmärgsderiverade makrofager (BMDM) rekapitulerar närmare in vivo makrofagfysiologi, men är fortfarande utmanande att genetiskt manipulera på grund av den låga effektiviteten hos både plasmidtransfektion och virustransduktion i dessa primära immunceller 7,8. Därför behövs effektivare metoder för att störa genernas funktion.
CRISPR/Cas9-genomredigering är ett kraftfullt verktyg för genetisk manipulation över en rad biologiska system, inklusive däggdjursceller 9,10,11,12. Streptococcus pyogenes Cas9-proteinet klyver effektivt och specifikt dubbelsträngat DNA när det komplexeras med ett sekvensspecifikt guide-RNA. DNA-reparation genom den icke-homologa ändsammanfogningen (NHEJ) av det klyvda DNA:t resulterar i små insättningar eller deletioner (indels) som skapar frameshift-mutationer. I tidiga studier levererades Cas9 och sgRNA genom plasmid- eller lentivirala vektorer, som är effektiva leveransmetoder för många cellinjer 9,10. Primära celler, och i synnerhet primära immunceller, är dock ofta resistenta mot dessa metoder på grund av den låga effektiviteten hos vektorleverans genom transfektion eller transduktion. Därefter har metoder utvecklats för att generera sgRNA-Cas9-komplex in vitro och för att leverera dem via elektroporering, och dessa metoder har uppnått hög effektivitet i en mängd olika celltyper13,14. Resultaten har föreslagit möjligheten att använda detta tillvägagångssätt för att utföra genomredigering i primära makrofager.
Här tillhandahåller vi ett protokoll för att använda sgRNA-Cas9 ribonukleoproteinkomplex (RNP) för att utföra genomredigering i primära BMDM. Den innehåller steg för att mildra aktiveringen av immunsensorerna som finns i primära immunceller och resulterar i upp till 95 % redigering på riktade loci med minimal toxicitet. Detta protokoll innehåller också arbetsflöden för att utvärdera redigeringseffektiviteten med hjälp av rutinmässig polymeraskedjereaktion (PCR) och Sanger-sekvensering, följt av in silico-analys av Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, ett välvaliderat online-mjukvaruverktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design av sgRNA
OBS: Detta steg beskriver val av målsekvenser och design av sgRNA. Det är bra att designa guider som finns i den första stora kodande exonen, så att alla översatta proteiner störs tidigt i den öppna läsramen. Det är också bra att välja målsekvenser som ligger inom samma exon, eftersom detta kommer att effektivisera analysen av redigeringseffektiviteten (steg 6). Exemplen på genomredigering som tillhandahölls med detta protokoll använde sgRNA riktade mot den första exonen av Src-genen och Cblb-genen , såväl som i den icke-kodande Rosa26-lokusen i musgenomet.
- Identifiera 20 nukleotidgenomiska sekvenser att rikta in sig på, med hjälp av ett av flera gratis designverktyg online (Tabell 1). Välj fyra till fem guider som inte överlappar varandra inom varje gen, eftersom Cas9-aktiviteten varierar beroende på vilken guide som väljs, och det är inte möjligt att på förhand förutsäga en mycket aktiv guide.
OBS: Det är viktigt att säkerställa att guiden är korrekt orienterad i förhållande till sekvensen för målplatsen. Designverktyg ger vanligtvis guidesekvensen i en 5' till 3' orientering, oavsett vilken kromosomsträng som är mål. För att verifiera strängorienteringen, kontrollera att det finns en protospacer intilliggande motivsekvens (PAM) för S. pyogenes Cas9 (nGG) omedelbart 3' av den riktade genomsekvensen. I sgRNA-sekvensen ingår inte PAM.
2. Syntes av sgRNA
OBS: Detta steg beskriver hur man syntetiserar sgRNA med PCR för att generera en mall för in vitro-transkription (IVT) och sedan renar sgRNA med hjälp av spinnkolonner (figur 1A). Anpassade syntetiska sgRNA är kommersiellt tillgängliga via flera leverantörer som ett alternativ till PCR/IVT.
- Utför PCR för att generera IVT-mallen för T7 RNA-polymeras. PCR-reaktionen använder universella primrar som innehåller en T7 RNA-polymeraspromotor och transaktiverande CRISPR RNA-sekvens (tracrRNA) (tabell 2), förutom korta individuella primers med den genspecifika guidesekvensen.
- Detta är det icke-förstärkande överlappningsförlängningssteget. Späd PCR-bufferten till 1x och tillsätt ytterligare 1 mM MgCl2. Tillsätt sedan 0,25 μL högupplöst DNA-polymeras, 0,5 mM deoxinukleotidtrifosfat (dNTP), 0,02 mM guidespecifik primer och 0,02 mM T7 omvänd lång universalprimer (tabell 2) till en total volym på 46 μL. Placera sedan röret i termocyklerna och kör två cykler på: 95 °C i 15 s, 37 °C i 15 s och 72 °C i 15 s. Kyl reaktionerna på is.
- Detta är PCR-förstärkningssteget. Tillsätt 2 μL 25 mM framåtamplifieringsprimer och 2 μL 25 mM omvänd amplifieringsprimer till varje reaktion. Den slutliga reaktionsvolymen är 50 μL. Denaturera i 30 s vid 95 °C. Kör sedan 35 cykler: 95 °C i 15 s, 65 °C i 20 s och 72 °C i 15 s. Utför en extra förlängning vid 72 °C i 2 minuter.
- Kontrollera PCR-reaktionsprodukten på en 2% agarosgel. Överlappningsförlängnings-PCR resulterar i en 127 bp dsDNA-molekyl med T7-promotorn uppströms den genspecifika 20-nukleotidguiden och tracrRNA omedelbart nedströms (Figur 1B).
- Rening av IVT-mallar: Det finns många protokoll och kit som fungerar bra för detta. Detta protokoll använder SPRI-pärlor (solid phase reversible immobilization). Blanda 50 μL av PCR-produkten med 90 μL pärlor och följ tillverkarens instruktioner. Eluera DNA genom att tillsätta 40 μL buffert (5 mM Tris, 0,1 mM etylendiamintetraättiksyra [EDTA]) och värm vid 65 °C i 5 min.
- Mät DNA-koncentrationen i IVT-mallen med hjälp av absorption vid en våglängd på 260 nm. En DNA-koncentration på minst 50 ng/μL behövs för IVT. IVT-mallen kan förvaras vid -20 °C.
- IVT-reaktion
- Använd ett kommersiellt kit som är utformat för att producera höga utbyten av IVT (se materialförteckning). Följ tillverkarens rekommendationer för att utföra IVT-reaktionen. Använd 250 ng IVT-mall i en 20 μL-reaktion och inkubera vid 37 °C i 4-16 timmar.
- Kontrollera IVT sgRNA-produkten genom att köra 1 μL av reaktionen på en 2% agarosgel. Ett ljust RNA-band bör observeras, som löper på samma sätt som 70 bp dsDNA (Figur 1C). Även om det inte är obligatoriskt, för att få skarpa och mer upplösta band, använd en RNA-provbuffert med urea och denaturera sample vid 65 °C i 5 minuter före laddning.
OBS: Svaga band med högre molekylvikt och små migrationsskillnader kan ses med vissa guide-RNA på grund av skillnader i RNA:s sekundära struktur.
- Defosforylera sgRNA IVT-produkten för att minimera aktiveringen av RIG-I (en främmande RNA-sensor) och efterföljande celldöd efter elektroporering. För varje 20 μL IVT-reaktion, tillsätt 69 μL vatten av molekylär kvalitet och 15 U kalvintestinalt fosfatas (CIP) i 1x CIP-buffert. Inkubera i 2 timmar vid 37 °C.
- Försämra IVT-mallen för att minimera aktiveringen av cellulära DNA-sensorer, som utlöser celldöd efter elektroporering. Till varje IVT-reaktion tillsätts 2 U RNasfritt DNas. Inkubera i 15 minuter vid 37 °C. IVT-produkten kan förvaras vid -20 °C i 1 dygn eller -80 °C i flera månader.
- Rena IVT-produkten med hjälp av spinnkolonner. För detta steg är SPRI-pärlreningssatser sämre.
- Bind RNA till kolonnen genom att tillsätta 220 μl bindningsbuffert till IVT-produkten, följt av 1 ml etanol av 100 % molekylärbiologisk kvalitet. Blanda väl och fyll kolonnen. Följ därefter tillverkarens instruktioner. Utför den slutliga tvätten i ett biosäkerhetsskåp med laminärt flöde för att undvika kontaminering av sgRNA.
- Utför elueringen i huven med laminärt flöde för att undvika kontaminering. Eluera RNA med hjälp av 30 μL steril 10 mM Tris-buffert (pH 8,0).
- Mät koncentrationen av sgRNA genom att mäta absorbansen vid en våglängd på 260 nm.
OBS: Typiska sgRNA-utbyten är minst 100 μg. - Förvara sgRNA vid -80 °C. Gör alikvoter för att undvika mer än tre frys-upptiningscykler.
3. Förberedelse för elektroporering
OBS: Alla steg bör utföras i en huv med laminärt flöde för att undvika kontaminering. Detta protokoll använder ett kommersiellt tillgängligt elektroporeringssystem (se materialförteckning) med 10 μL spetsar.
- Tina BMDM 48-72 timmar före användning och expandera dem på icke-vävnadskulturbehandlade (TC) plattor.
OBS: Per reaktion behövs 4 x 105 celler. - Sterilisera PCR-rör för reaktionsmontering. Bered ett PCR-rör per reaktion och värm dem i en termocykler i 10 minuter vid 98 °C. Förbered rören i omgångar och förvara dem stängda. Placera de steriliserade PCR-rören på is när de är redo att användas.
- Rengör pipettstationen med 70 % etanol och placera den i huven för laminärt flöde. Ställ in parametrarna på 1 900 V, 20 ms och en puls.
- Ta försiktigt ut ett transfektionsrör ur förpackningen för att hålla det sterilt och fyll det med 3 ml "E"-buffert. Se till att E-bufferten har rumstemperatur före elektroporering. Sätt in röret i stationen och tryck ner det tills det klickar.
- För varje reaktion, alikvot 2,5 μl sgRNA vid en koncentration av 1 100 ng/μL. Späd sgRNA i kall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med 0,9 mM CaCl2 och 0,5 mM MgCl2 (PBS + Ca/Mg). Låt den ligga på is.
- Förbered två plattor: en 12-håls obelagd platta för cellerna och ytterligare en 24-håls platta för att hålla odlingsmediet. Alikvot 1,5 ml antibiotikafritt medium per reaktion i brunnarna på 24-hålsplattan.
- Förbered Cas9-protein. Det finns flera kommersiella och akademiska leverantörer av sterilt renat Cas9-protein. Späd Cas9 till en slutlig koncentration på 20 μM med kall PBS + Ca/Mg. För varje elektroporeringsreaktion, alikvot 1 μL 20 μM Cas9 i sterila PCR-rör. Låt ligga på is.
- Förbered cellerna för elektroporering.
- Ta bort odlingsmediet. Tvätta cellerna med PBS utan CaCl2 och MgCl2 (PBS-Ca/Mg) för att avlägsna serum och divalenta katjoner som främjar vidhäftning. Tillsätt sedan PBS + 1 mM EDTA och inkubera i rumstemperatur i cirka 5 minuter tills cellerna börjar lossna.
- Pipettera försiktigt upp och ner för att lossa cellerna. Överför cellerna till ett 15 ml rör med låg proteinbindningsförmåga. Pelletera cellerna med 500 x g i 5 min.
OBS: Makrofager är vidhäftande till plastgods. Användningen av centrifugrör med låg proteinbindning förbättrar cellutbytet avsevärt. - Arbeta snabbt för att undvika långvarig inkubation av celler i PBS + EDTA. Ta bort det mesta av supernatanten och lämna cirka 1 ml supernatant kvar i röret. Återsuspendera cellerna i den återstående supernatanten och överför sedan till ett 1,5 ml mikrofugerör med låg proteinbindningsgrad.
- Ta bort en liten delmängd celler som ska räknas. Pelletera de återstående cellerna genom centrifugering vid 500 x g vid rumstemperatur i 5 min.
- Under centrifugeringen, räkna cellerna och värm Cas9- och sgRNA-rören till rumstemperatur.
- Ta bort all supernatant från cellpelleten. Återsuspendera cellerna i PBS + Ca/Mg vid en koncentration av 4 x 107 celler/ml (4 x 105 celler per 10 μL reaktion).
OBS: Varje sats levereras med en begränsad mängd elektroporeringsbuffert (Buffer R, Buffer T). Vi finner dock att elektroporeringseffektiviteten med PBS + Ca/Mg är likvärdig med de proprietära buffertarna. - Vid elektroporering av sgRNA för olika gener, alikvotera cellerna i olika lågproteinbindande rör för varje gen för att undvika korskontaminering mellan sgRNA. Förvara cellerna i rumstemperatur tills de är redo för elektroporering.
4. RNP-montering
- Förvara sgRNA och Cas9 i rumstemperatur för att undvika utfällning. Tillsätt 2,5 μl sgRNA till 1 μl utspädd Cas9 i steriliserade PCR-rör. Fördela sgRNA långsamt under 15 s med blandning för att förhindra utfällning.
- Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur så att RNP-komplexet kan bildas.
5. RNP-leverans genom elektroporation
- Förbered elektroporeringsspetsen (kyvetten). Tryck in kolven för att förlänga skaftet. Sätt in skaftet i spetsen.
OBS: Se till att spetsen sitter fast och att kolven glider smidigt och sträcker sig utanför spetsmanteln. Om spetsen inte är korrekt placerad kan luftbubblor föras in i spetsen, vilket orsakar spetsfel. - Återsuspendera cellerna genom att pipettera upp och ner och ladda sedan elektroporationsspetsen med cellerna. Dra ut spetsens fulla volymkapacitet på 10 μL och undvik bubblor.
- Börja med det negativa kontroll-sgRNA, överför 10 μL celler i elektroporeringsspetsen till provröret som innehåller 3,5 μL RNP från steg 4. Pipettera upp och ner tre gånger för att blanda väl. Dra tillbaka 10 μL av blandningen i spetsen och se till att det inte finns några bubblor.
- Placera spetsen i elektroporeringsstationen och sänk ner den i bufferten. Undvik att komma i kontakt med plastytor med spets för att bibehålla steriliteten. Tryck på Start på pekskärmen.
- När det är klart kommer displayen att indikera en lyckad puls. Ta bort pipetten från enheten och placera cellerna i en torr brunn på den märkta, obelagda 12-hålsplattan.
- Skölj spetsen genom att pipettera upp och ner två gånger i 15 ml PBS + Ca/Mg. Lägg pipetten åt sidan med spetsen fortfarande fastsatt. Se till att spetsen inte vidrör någonting och förblir steril.
OBS: I många experiment är det möjligt att återanvända spetsen för flera prover, till exempel efter det inaktiva negativa kontroll-sgRNA-provet, eller under de första utvärderingarna av guideaktiviteten när fyra till fem sgRNA testas per gen och den enda avläsningen är redigeringseffektiviteten. Vid funktionell analys på redigerade celler rekommenderas dock en ny spets för varje gen, eftersom små mängder sgRNA eller cellöverföring kan påverka de experimentella resultaten. - Tillsätt omedelbart 1 ml antibiotikafritt medium (anges i steg 3.6) till cellerna och skaka försiktigt plattan för att blanda.
- Upprepa steg 5.2-5.6 för de återstående reaktionerna.
- Sätt tillbaka cellerna i inkubatorn.
- Kontrollera cellernas livskraft 1-2 timmar efter elektroporering. Cellerna ska vara >90% vidhäftande. Valfritt: Tillsätt gentamicin (5 μg/ml) till cellerna 1–2 timmar efter elektroporering för att förhindra kontaminering om detta inte stör nedströmsexperimenten.
6. Bedömning av redigeringseffektiviteten
OBS: De flesta redigeringar är klara efter 48 timmar.
- Kontrollera cellens monolager 48 timmar efter elektroporering. Om cellerna är över 50 % sammanflytande, fortsätt sedan vidare. Om cellerna är <50 % sammanflytande, vänta ytterligare 1-2 dagar. Den genomiska DNA-analysen för att bestämma redigeringseffektiviteten kräver 1 x 105 celler, utöver de celler som behövs för nedströmsexperimentet.
- Förbered genomiskt DNA (gDNA).
- Tvätta cellerna med PBS(-Ca/Mg). Tillsätt 1 ml PBS + 1 mM EDTA. Inkubera i rumstemperatur i ca 5 min tills cellerna börjar lossna från plattan.
- Lossa cellerna genom pipettering. Överför till ett mikrofugerör med låg proteinbindningsgrad.
- Räkna cellerna och ta bort en alikvot på 1 x 105 celler. De återstående cellerna kan pläteras om för att användas i ytterligare experiment. I allmänhet utförs experimenten 5 dagar efter elektroporering för att möjliggöra sönderfall av proteinet.
- Pelletera cellerna för gDNA-analys i 15 s med maximal hastighet i ett mikrofugerör.
- Återsuspendera pelleten i 50 μL lyseringsbuffert. Virvel för att lossa eventuella celler som fastnat på rörets väggar och värm vid 98 °C i 10 minuter för att lysera cellerna och inaktivera endogent DNas.
- Lägg rören på is.
- Tillsätt 1 μl proteinas K (20 mg/ml). Inkubera i minst 1 timme vid 37 °C. Den kan lämnas över natten för enkelhetens skull.
- Värm till 98 °C i 10 minuter för att inaktivera proteinas K.
- Centrifugera i rumstemperatur i 5 minuter på maximal hastighet. Ta bort supernatanten, som innehåller DNA. Detta råa preparat utan ytterligare rening fungerar bra för de flesta PCR-reaktioner.
- Utvärdera redigeringseffektiviteten med Sanger-sekvensering.
- Konstruera PCR-primers 200-300 bp uppströms de flesta 5' guideplatserna och 200-300 bp nedströms de flesta 3' guideplatserna. Den typiska amplikonstorleken är ~500 bp. Utforma en kapslad sekvenseringsprimer minst 125 bp från närmaste guideplats (Figur 2A).
- Utför PCR med 2 μL gDNA.
- Förbered PCR-produkten för sekvensering. I detta protokoll används en exonukleas I/räka alkaliskt fosfatas (ExoI/SAP) behandling. Kommersiella DNA-reningssatser fungerar också men kräver mer praktisk tid.
- Bered 15 μl av PCR-produkten. Tillsätt 7,5 μL vatten, 1 μL 10x ExoI-buffert, 10 U ExoI och 1 U SAP för att bryta ned dNTP:er och primers som stör Sanger-sekvenseringen.
- Inkubera vid 37 °C i 30 minuter, följt av 85 °C i 20 minuter för att inaktivera enzymerna.
- Utför Sanger-sekvensering på den Exo/SAP-behandlade PCR-produkten; använda en känd mängd DNA-storleksmarkör för att uppskatta storleken på PCR-produkten som finns i provet. Sekvenseringsreaktionerna kan kräva optimering, eftersom TIDE-programvaran behöver sekvenskromatogram av hög kvalitet för att exakt uppskatta redigeringseffektiviteten. Sekvenskromatogrammet för det oredigerade lokuset bör ge tydliga toppar med minimal bakgrund (figur 2B, C).
- För att uppskatta redigeringseffektiviteten, använd TIDE för att analysera Sanger-sekvenskromatogramfilerna med hjälp av det redigerade gDNA:t och det oredigerade kontroll-gDNA:t. (Tabell 1, figur 2). Ladda upp Sanger-sekvenseringsfilerna och kör programvaran med standardinställningarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVT-mallen är en PCR-produkt med 127 bp (figur 1B). Fullängds-IVT-produkten är ett 98 nt RNA, som migrerar på samma sätt som ett 70 bp dubbelsträngat DNA-fragment (Figur 1C).
Efter elektroporering ska cellerna vara >90 % livskraftiga, med ett totalt cellantal på >70 % av startcellantalet. Den resulterande poolen av muterade celler bör ha en varierad uppsättning indels, med början nära Cas9-klyvningsstället. Analysen av de målinriktade generna med PCR- och Sanger-sekvensering bör visa flera nukleotider vid varje position nedströms Cas9-klyvningsstället (figur 2).
Figur 1: Översikt över sgRNA-Cas9-redigeringsprocessen. (A) Schematisk för styrdesign, sgRNA-generering och Cas9-sgRNA-leverans. (B) PCR-produkten från IVT för Src sgRNA 1, 2 och 3 upplöstes på en 2% agarosgel. Pilen indikerar rätt 127 bp PCR-produkter. (C) RNA-produkterna efter IVT för Src sgRNA 1, 2 och 3 upplöstes på en 2 % agarosgel. Parenteserna anger rätt sgRNA-produkter. Den variabla migrationen av sgRNA beror på RNA:s sekundära struktur. Denna figur är ett utdrag ur försteförfattarens masteruppsats16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Hög redigeringseffektivitet uppnådd för flera målgener. (A) Schematisk bild av PCR- och Sanger-sekvenseringsprimrar. (B) Schematisk bild av arbetsflödet för TIDE för att bedöma redigeringseffektiviteten. C) Representativt Sanger-sekvenseringskromatogram av ROSA26-lokus från BMDM elektroporerade med en kontroll-icke-målsökande sgRNA-Cas9 RNP (överst) och ROSA26-specifik sgRNA (nederst). Cas9-klyvningsplatsen är markerad. Tidvattenutgången (höger) med den beräknade redigeringseffektiviteten och procentandelen sekvenser som innehåller det angivna antalet indels. (D,E) Sangersekvensering av kromatogram av (D) Src och Cblb gener i de redigerade BMDM:erna. Denna figur är ett utdrag ur försteförfattarens masteruppsats16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Måttlig ökning av redigeringseffektiviteten på grund av den kommersiella elektroporationsförstärkaren. BMDM:erna elektroporerades med lågeffektiva guider för att utvärdera effekten av en kommersiell redigeringsförstärkare. Före elektroporeringen tillsattes 1 μL av förstärkaren till de monterade RNP:erna till en slutlig koncentration på 4 μM. Redigeringseffektiviteten hos det indikerade Src sgRNA utvärderades med hjälp av TIDE. Denna figur är ett utdrag ur försteförfattarens masteruppsats16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Verktygets namn | URL | ||
| Synthego - Designverktyg för CRISPR | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| Det breda institutet - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| Spårning av indels genom nedbrytning (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Tabell 1: Webbadresser till onlineverktyg.
| Primer Namn | Sekvens | ||
| Guide-specifik primer | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| Guidespecifik primer - Cbl-b Guide 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| Guidespecifik primer - Cbl-b Guide 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| Guidespecifik primer - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGAAGATgttttagagctagaa | ||
| Guidespecifik primer - Scramble | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| Guide-specifik primer - Src Guide 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| Guidespecifik primer - Src Guide 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| Guidespecifik primer - Src Guide 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 Omvänd Lång Universal Primer | aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac | ||
| Universell Forward Amplification Primer | ggatcctaatacgactcactcactatag | ||
| Universell omvänd förstärkningsprimer | aaaagcaccgactcgg | ||
Tabell 2: Oligonukleotider som används i PCR för att generera mallen för IVT av sgRNA. De 20 nukleotidmålsekvenserna för genspecifika primers kapitaliseras.
| BMDM Tillväxt media. Förvaras vid 4 °C. | |||
| DMEM | |||
| Serum hos foster hos nötkreatur | 0.1 | ||
| L-glutamin | 0,2 M | ||
| MCSF-supernatanten från 3T3-MCSF-celler** | 0.1 | ||
| Natriumpyruvat | 11 mg/ml | ||
| Lysis buffert. Förvaras vid 4 °C. | |||
| 2-merkaptoetanol (tillsätt omedelbart före användning) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 mM | ||
| Tris | 20 m² | ||
| Triton-X 100 | 0.005 | ||
| **3T3-MCSF-celler odlas i DMEM+10% FCS. Supernatent med MCSF skördas på den 5:e dagen efter att ha nått 100 % sammanflöde. Som ett alternativ kan 10 ng/ml rekombinant MCSF användas i stället för konditionerade medier | |||
Tabell 3: Mediernas sammansättning och buffertar.
Tilläggsfil 1: Råsekvenseringsfil för ROSA_ Mock Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Råsekvenseringsfil för ROSA_TargettingGuide Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 3: Råsekvenseringsfil för ScrambleGuide Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 4: Råsekvenseringsfil för SrcG5+SrcG6 Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 5: Råsekvenseringsfil för CBLB_Mock Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 6: Råsekvenseringsfil för CBLB_TargetingGuide Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 7: Råsekvenseringsfil för Mock_Guide2Locus Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 8: Råsekvenseringsfil för Mock_Guide6Locus Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 9: Råsekvenseringsfil för SrcGuide2_Enhancer Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 10: Råsekvenseringsfil för SrcGuide2_NoEnhance Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 11: Råsekvenseringsfil för SrcGuide6_Enhancer Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 12: Råsekvenseringsfil för SrcGuide6_NoEnhancer Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genomredigering med hjälp av elektroporerade Cas9-sgRNA-komplex möjliggör effektiv störning av genfunktionen i BMDM. Redigeringseffektiviteten varierar beroende på målsekvens och gen. Vanligtvis screenas fyra till fem sgRNA för att identifiera en som är mycket aktiv. Vissa loci har lägre redigeringseffektivitet, troligen på grund av kromatinstrukturen. I dessa fall kan flera ändringar göras för att öka redigeringseffektiviteten. Samleverans av två aktiva sgRNA till samma exon resulterar i förbättrad redigering för vissa gener. Men när två guider transfekteras samtidigt har vi observerat att TIDE kan förlora noggrannhet. Därför kan alternativa tekniker för att bedöma redigering, till exempel Western blotting, krävas. Dessutom ökar införandet av en kommersiellt tillgänglig NHEJ-förstärkare ofta redigeringseffektiviteten med ~20 % (figur 3).
Den här metoden har flera fördelar. Den direkta leveransen av sgRNA-Cas9 till celler kräver inte de tidskrävande stegen för plasmidkonstruktion eller produktion av lentivirala vektorer för att transducera BMDM. Processen att syntetisera sgRNA, elektroporering och generera muterade celler kan slutföras på 1 vecka. Denna teknik kan också användas med BMDM som härrör från genetiskt modifierade möss för att skapa dubbelmuterade celler. Även om det finns kemiska metoder för att transfektera primära immunceller med siRNA eller mRNA17, är dessa kemiska metoder betydligt mindre effektiva än elektroporering när det gäller att leverera Cas9-sgRNA-komplex till immunceller18. Det finns flera typer av elektroporationsenheter tillgängliga kommersiellt. Dessa enheter förväntas fungera på liknande sätt för leverans av Cas9-sgRNA-komplex, även om spänningsparametrarna sannolikt måste optimeras för varje enskild enhet. Även om detta protokoll främst har använts på BMDM på möss, har liknande resultat erhållits med BMDM på råttor (opublicerade data). Det är möjligt att andra typer av primära makrofager, såsom peritoneala makrofager hos möss eller alveolära makrofager, också kan vara mottagliga för detta tillvägagångssätt, även om detta ännu inte har testats.
Den här metoden har vissa begränsningar. Antalet celler som produceras av detta protokoll är något begränsat; Våra standardförhållanden genererar 4 x 105 celler per elektroporation. Det kan dock vara möjligt att skala upp utbytet avsevärt, eftersom effektiviteten är oförminskad i en 10 μL-reaktion med upp till 2,4 x 106 celler med samma mängd RNP (opublicerade data). Dessutom finns 100 μL elektroporeringsspetsar tillgängliga. En annan nackdel med denna metod är kostnaden; Kostnaderna för både elektroporatorn och förbrukningsvarorna för elektroporering är betydande. Dessa kostnader kan minskas avsevärt genom att återanvända spetsarna när man använder olika sgRNA som riktar sig mot samma gen och genom att använda PBS istället för de proprietära buffertarna. Även om sammansättningen av de proprietära buffertarna inte är känd, är det förmodligen så att elektrolytsammansättningen av PBS med 0,9 mM CaCl2 och 0,5 mM MgCl2 approximerar den elektriska konduktansen för den proprietära bufferten. Dessa ändringar minskar kostnaden för förbrukningsvaror med ungefär 80 % i detta protokoll.
Det finns flera kritiska steg i protokollet, vars avvikelser dramatiskt kan påverka genredigeringens effektivitet. En av de potentiella fallgroparna är att vanliga IVT-kit, som inte är utformade för hög avkastning, ofta producerar otillräckliga IVT-produkter. Dessutom kan användningen av vanliga mikrofugerör av polypropen istället för lågbindande rör orsaka betydande cellförlust genom vidhäftning. Den ofullständiga defosforyleringen av IVT-produkten och förekomsten av kvarvarande DNA i sgRNA-preparatet kan leda till aktivering av makrofagimmunsensorer och efterföljande toxicitet. Högre eller längre spänningspulser kan också leda till ökad celldöd.
Sammanfattningsvis är detta genomredigeringsprotokoll, som använder elektroporering för att leverera Cas9-sgRNA RNP:er, en effektiv metod för att störa gener i BMDM hos möss. Detta gör det möjligt för användare att snabbt screena för fenotyper i primära celler som närmare rekapitulerar den komplexa biologin hos makrofager in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NIH-anslaget 5R01AI144149. De schematiska figurerna skapades med BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , Master's thesis (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
