Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento del tejido pulmonar descelularizado regional. Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para estudiar las complejidades en la matriz extracelular y las interacciones célula-matriz.
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Artículo de método
Disección y aislamiento de tejido pulmonar descelularizado específico de la región
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Resumen
Resumen
El trasplante de pulmón es a menudo la única opción para los pacientes en las últimas etapas de la enfermedad pulmonar grave, pero esto es limitado debido tanto al suministro de pulmones de donantes adecuados como al rechazo agudo y crónico después del trasplante. Determinar nuevos enfoques de bioingeniería para el reemplazo de pulmones enfermos es imperativo para mejorar la supervivencia del paciente y evitar complicaciones asociadas con las metodologías actuales de trasplante. Un enfoque alternativo implica el uso de pulmones enteros descelularizados que carecen de componentes celulares que son típicamente la causa del rechazo agudo y crónico. Dado que el pulmón es un órgano tan complejo, es interesante examinar los componentes de la matriz extracelular de regiones específicas, incluida la vasculatura, las vías respiratorias y el tejido alveolar. El propósito de este enfoque es establecer métodos simples y reproducibles mediante los cuales los investigadores pueden diseccionar y aislar tejido específico de la región de pulmones completamente descelularizados. El protocolo actual ha sido diseñado para pulmones de cerdo y humanos, pero también puede aplicarse a otras especies. Para este protocolo, se especificaron cuatro regiones del tejido: vía aérea, vasculatura, alvéolos y tejido pulmonar a granel. Este procedimiento permite la obtención de muestras de tejido que representan con mayor precisión el contenido del tejido pulmonar descelularizado en comparación con los métodos tradicionales de análisis a granel.
Introducción
Las enfermedades pulmonares, incluyendo la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) y la fibrosis quística (FQ), actualmente permanecen sin cura 1,2,3,4. El trasplante pulmonar es a menudo la única opción para los pacientes en etapas posteriores, sin embargo, esta sigue siendo una opción limitada debido al suministro de pulmones de donantes adecuados y al rechazo agudo y crónico después del trasplante 3,5,6. Como tal, existe una necesidad crítica de nuevas estrategias de tratamiento. Un enfoque prometedor en bioingeniería respiratoria es la aplicación de andamios derivados de tejidos preparados a partir de tejido pulmonar nativo descelularizado. Como los andamios pulmonares completos acelulares conservan gran parte de la complejidad de la composición y bioactividad de la matriz extracelular nativa (MEC), se han estudiado intensamente para la ingeniería de órganos completos y como modelos mejorados para estudiar los mecanismos de la enfermedad pulmonar 7,8,9,10. Paralelamente, existe un creciente interés en utilizar tejidos descelularizados de diferentes órganos, incluidos los pulmones, como hidrogeles y otros sustratos para estudiar las interacciones célula-célula y célula-ECM en organoides y otros modelos de cultivo de tejidos 11,12,13,14,15,16,17 . Estos proporcionan modelos más relevantes que los sustratos disponibles comercialmente, como Matrigel, derivados de fuentes tumorales. Sin embargo, la información sobre los hidrogeles derivados de pulmón humano es relativamente limitada en la actualidad. Hemos descrito previamente hidrogeles derivados de pulmones de cerdo descelularizados y hemos caracterizado tanto sus propiedades mecánicas como materiales, así como demostrado su utilidad como modelos de cultivo celular18,19. Un informe reciente detalló la caracterización mecánica y viscoelástica inicial de hidrogeles derivados de pulmones humanos normales y enfermos descelularizados (EPOC, FPI)20. También hemos presentado datos iniciales que caracterizan el contenido de glicosaminoglicanos de pulmones humanos normales y EPOC descelularizados, así como su aplicabilidad para el estudio de las interacciones célula-célula y célula-MEC11.
Estos ejemplos ilustran el poder de utilizar ECM de pulmón humano descelularizado con fines de investigación. Sin embargo, el pulmón es un órgano complejo, y tanto la estructura como la función varían en diferentes regiones del pulmón, incluyendo la composición de la ECM y otras propiedades como la rigidez21,22. Como tal, es de interés estudiar la ECM en regiones individuales del pulmón, incluyendo la tráquea y las vías respiratorias grandes, las vías respiratorias medianas y pequeñas, y los alvéolos, así como los vasos sanguíneos grandes, medianos y pequeños. Con este fin, hemos desarrollado un método confiable y reproducible para diseccionar pulmones humanos y porcinos descelularizados y posteriormente aislar cada una de esas regiones anatómicas. Esto ha permitido un análisis diferencial detallado del contenido de proteínas regionales tanto en pulmones normales como enfermos21.
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Protocolo
Todos los estudios en animales se han realizado de acuerdo con el IACUC de la Universidad de Vermont (UVM). Todos los pulmones humanos fueron adquiridos de los Servicios de Autopsia UVM y los estudios relacionados se realizaron según las directrices del IRB de UVM.
NOTA: La descelularización de pulmones de cerdo y humanos ha sido previamente descrita por nuestro grupo 7,8,9,10,21. En resumen, los lóbulos pulmonares enteros se descelularizan mediante perfusión secuencial de las vías respiratorias y la vasculatura con una serie de detergentes de 2 L y soluciones enzimáticas utilizando una bomba peristáltica: 0,1% Triton-X 100, 2% desoxicolato de sodio, cloruro de sodio 1 M, 30 μg/mL DNasa/1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2, 0,1% ácido peracético/4% etanol, y un lavado con agua desionizada. Los métodos estándar para confirmar la descelularización eficiente incluyen la determinación de ADN bicatenario residual de <50 ng/mg dentro de los pulmones descelularizados y la ausencia de fragmentos de ADN por electroforesis en gel, y la tinción nuclear por tinción de hematoxilina y eosina (H&E) 9,21.
1. Configuración
- Reúna todo el equipo necesario para el procedimiento de disección, incluyendo una cazuela de vidrio, dos pares de pinzas quirúrgicas, un par de fórceps y un par de tijeras quirúrgicas, y autoclave antes de usar.
- Obtenga una sección del pulmón, colóquela en la cazuela de vidrio y oriente para que el extremo superior de la vía aérea se pueda ver claramente.
- Identifique el extremo proximal de la vasculatura y manténgalo intacto hasta pasos posteriores. El extremo de la vasculatura debe ser claramente visible y de color blanco completamente opaco.
- Con un par de pinzas y tijeras quirúrgicas, retire cualquier pleura que pueda estar recubriendo el exterior del pulmón y deséchela.
2. Exponer las vías respiratorias
- Usando una técnica de extensión con las tijeras quirúrgicas, trabaje suavemente para exponer las vías respiratorias adicionales.
- Localice la vía aérea más grande, que normalmente tendrá un diámetro de aproximadamente 2-4 cm. Otra forma de identificar una vía aérea es a través de la observación de anillos de cartílago, que se pueden detectar visualmente o mediante palpación del tejido.
- Usando un par de fórceps, palpar a lo largo de la vía aérea para determinar la ubicación de la vía aérea invisible a una profundidad de aproximadamente 1 pulgada.
NOTA: Al estar revestida con anillos de cartílago, la vía aérea es característicamente más dura que los otros tejidos pulmonares. Como tal, encontrar y palpar las vías respiratorias invisibles debe ser relativamente simple. - Sosteniendo las tijeras quirúrgicas paralelas a las vías respiratorias, inserte las puntas cerradas en el tejido que rodea directamente la vía aérea invisible.
- Abra lentamente las tijeras quirúrgicas para separar suavemente la membrana circundante. Posteriormente, retire las tijeras quirúrgicas y evite cortar cualquier tejido.
- Repita este proceso intermitentemente durante todo el procedimiento de disección para continuar exponiendo las vías respiratorias.
- Usando las tijeras quirúrgicas, corte las vías respiratorias en los puntos de ramificación y diseccione a lo largo de cualquiera de las ramas de forma independiente.
NOTA: Un punto de ramificación es un lugar en el que una vía aérea se divide en dos vías respiratorias separadas. - Cortar regiones de la vía aérea una vez que confíe en que los extremos intactos permanecerán identificables y fácilmente localizados para una mayor disección.
- Coloque las regiones cortadas de la vía aérea en el tubo correspondiente. El tamaño de las regiones cortadas variará dependiendo de la muestra pero, en general, oscilará entre 1-5 cm de longitud. El ancho varía según la ubicación relativa a lo largo del árbol de las vías respiratorias, con las regiones distales manteniendo anchos más pequeños que las regiones más proximales.
3. Exponer y extirpar regiones de la vasculatura
- Aplique una presión suave en la vasculatura y aléjese lentamente de las vías respiratorias. Permita que la vasculatura se estire ligeramente y use tijeras quirúrgicas para separar aún más la vasculatura de las vías respiratorias.
NOTA: Demasiada presión rasgará la vasculatura. Si la vasculatura se rasga, simplemente coloque esa sección de vasculatura en el tubo etiquetado correspondiente e identifique su extremo intacto. - Cuando se haya expuesto un punto de ramificación en el árbol vascular, use tijeras quirúrgicas y pinzas para exponer regiones más inferiores de la vasculatura.
- Comience insertando las puntas cerradas de las tijeras quirúrgicas justo debajo de un punto de ramificación y entre las dos regiones de vasculatura correspondientes.
- Abra lentamente las tijeras para separar los tejidos subyacentes.
- Intermitentemente, use un par de pinzas para eliminar el tejido que se separó usando las tijeras quirúrgicas, así como cualquier otro tejido que rodee directamente la vasculatura.
- Cuando la vasculatura cubra regiones de las vías respiratorias o se vuelva engorrosa para cualquier paso del procedimiento de disección, corte la vasculatura en un punto de ramificación y diseccione a lo largo de cualquiera de las ramas de forma independiente.
- Cortar regiones de la vasculatura una vez que confíe en que los extremos intactos permanecerán identificables y fácilmente localizados para una mayor disección.
4. Identificación y extirpación del tejido alveolar
- Usando un par de pinzas o pinzas, pellizque y luego arranque suavemente pequeñas regiones de tejido alveolar.
- Localice una región de tejido que no esté en las inmediaciones directas de las vías respiratorias o la vasculatura.
- Usando las pinzas, pellizque una pequeña región del tejido que parece estar desprovista de vasculatura o vía aérea.
- Desgarre la región pellizcada del tejido del pulmón.
- Observe la región de tejido extirpada y confirme si es o no tejido alveolar.
NOTA: El tejido alveolar está presente en todo el pulmón, por lo que puede y debe eliminarse durante todo el procedimiento de disección. Cualquier tejido que no pueda identificarse fácilmente como principalmente alvéolo, vasculatura o vía aérea debe clasificarse como tejido a granel y colocarse en el tubo etiquetado correspondiente.
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Resultados
En la figura 1 se muestra un esquema general del protocolo. Una vez dominada, la disección regional del tejido pulmonar descelularizado es fácilmente reproducible. Determinar la categorización de cada muestra de tejido cortado es imprescindible para el éxito del procedimiento de disección. El tejido vascular es sustancialmente más elástico que las vías respiratorias, por lo que el uso de fórceps para estirar el tejido es a menudo un fuerte indicador de si una muestra en particular es vascula...
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Discusión
Los tejidos descelularizados de humanos y otras especies se utilizan con frecuencia como biomateriales para estudiar la composición de la ECM, así como las interacciones célula-MEC en modelos de cultivo ex vivo, incluidos los hidrogeles 3D12,13. Al igual que otros órganos, los pulmones descelularizados se han utilizado previamente para determinar las diferencias de composición de la ECM en pulmones sanos versus enfermos (es decir, enfisematosos e IPF) y ...
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los servicios de autopsia de UVM para la obtención de pulmón humano y a Robert Pouliot PhD por sus contribuciones a las técnicas generales de disección. Estos estudios fueron apoyados por R01 HL127144-01 (DJW).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bonn Tijeras | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Pinzas finas | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Pinzas, curvas, S/S, romas, dentadas - 130mm | CellPath | N/A Tijeras | |
| Finas Endurecidas Herramientas de | Ciencia Fina | 14090-11 | |
| Pinzas de Iris Moria | Herramientas de Ciencia Fina | 11373-22 | |
| Cazuela de vidrio Pyrex | Cole-Parmer | 3175-10 |
Referencias
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