Artículo de método

Modelado de tumores cerebrales in vivo mediante la administración basada en electroporación de ADN plasmídico que representa las firmas de mutación del paciente

DOI:

10.3791/65286

⸱

23 de junio de 2023

 , 
1Board of Governor’s Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Center for Neural Sciences in Medicine, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La utilización de un modelo tumoral autóctono inmunocompetente impulsado por mutaciones comunes de los pacientes para las pruebas preclínicas es fundamental para las pruebas inmunoterapéuticas. Este protocolo describe un método para generar modelos de ratón con tumores cerebrales utilizando la administración de ADN plasmídico basado en electroporación que representa mutaciones comunes de los pacientes, proporcionando así un modelo de ratón preciso, reproducible y consistente.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los modelos tumorales son fundamentales para las pruebas preclínicas de los tumores cerebrales en términos de explorar tratamientos nuevos y más eficaces. Con un interés significativo en la inmunoterapia, es aún más importante contar con un modelo de ratón consistente, clínicamente pertinente e inmunocompetente para examinar las poblaciones de tumores y células inmunitarias en el cerebro y su respuesta al tratamiento. Si bien la mayoría de los modelos preclínicos utilizan el trasplante ortotópico de líneas celulares tumorales establecidas, el sistema de modelado presentado aquí permite una representación "personalizada" de las mutaciones tumorales específicas del paciente en un desarrollo gradual pero efectivo a partir de construcciones de ADN insertadas en células precursoras neurales (NPC) en división in vivo. Las construcciones de ADN presentan el análisis en mosaico con el método de intercambio de casetes mediado por recombinasa dual (MADR), lo que permite la mutagénesis somática de una sola copia de las mutaciones conductoras. Utilizando crías de ratón recién nacidas entre el nacimiento y los 3 días de edad, los NPC son atacados aprovechando estas células en división que recubren los ventrículos laterales. La microinyección de plásmidos de ADN (p. ej., derivados de MADR, transposones, sgRNA dirigido por CRISPR) en los ventrículos es seguida de electroporación utilizando paletas que rodean la región rostral de la cabeza. Tras la estimulación eléctrica, el ADN es absorbido por las células en división, con el potencial de integrarse en el genoma. El uso de este método se ha demostrado con éxito en el desarrollo de tumores cerebrales pediátricos y adultos, incluido el tumor cerebral maligno más común, el glioblastoma. Este artículo discute y demuestra los diferentes pasos del desarrollo de un modelo de tumor cerebral utilizando esta técnica, incluyendo el procedimiento de anestesia de crías de ratón jóvenes, hasta la microinyección de la mezcla de plásmidos, seguida de electroporación. Con este modelo de ratón autóctono e inmunocompetente, los investigadores tendrán la capacidad de ampliar los enfoques de modelado preclínico, en un esfuerzo por mejorar y examinar el tratamiento eficaz del cáncer.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los modelos de tumores cerebrales murinos son cruciales para comprender los mecanismos de formación y tratamiento de tumores cerebrales. Los modelos actuales suelen incluir trasplantes subcutáneos u ortotópicos producidos rápidamente de líneas celulares tumorales de uso común, basados en un número limitado de mutaciones conductoras o modelos de xenoinjertos derivados de pacientes, utilizando ratones inmunodeficientes que dificultan los estudios de inmunoterapia adecuados 1,2,3,4. Además, estos resultados preclínicos pueden conducir a falsos ....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos de este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico Cedars Sinai. Los ratones mTmG homocigotos se cruzaron con ratones C57BL/6J para obtener camadas de ratones mTmG heterocigotos de sexo mixto para su uso en el siguiente protocolo. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Las crías de ratón fueron electroporadas entre los días postnatales 0 y 3 (P0-P3).

1. Configuración quirúrgica

  1. Rocíe la mesa quirúrgica con desinfectante quími....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito anteriormente se ha utilizado para desarrollar con éxito modelos de ratones con tumores cerebrales pediátricos y adultos, y el primero se ha publicado con gran detalle en Kim et al.8. Con la técnica adecuada y una planificación cuidadosa del diseño de plásmidos, el éxito para el desarrollo de tumores EP suele ser del 100%. La histología es la forma más rápida y sencilla de comprobar el éxito de la inserción de plásmidos de ADN cuando se utiliza una proteína indicadora. Este p.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La administración de ADN plasmídico basada en la electroporación permite el uso in vivo de la biología molecular, similar a la utilizada en modelos de ratón modificados genéticamente, pero con la velocidad, localización y eficiencia de la transducción viral 8,13,14. Con esto último, sin embargo, vienen preocupaciones de seguridad, así como respuestas inmunitarias. Hemos demostrado en nuestro sistema de modelado utilizan.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Gi Bum Kim por la tinción inmunofluorescente y las imágenes. También agradecemos a Emily Hatanaka, Naomi Kobritz y Paul Linesch por sus útiles consejos sobre el protocolo.

....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.1-2.5 y micro; L pipeta de 1 canalEppendorf3123000012
2 µ L puntas de pipetaFisher Scientific02-707-442
20 µ L puntas de pipetaFisher Scientific02-707-432
2-20 µ L Pipeta de 1 canalEppendorf3123000098
DNAZap PCR Soluciones de degradación de ADNFisher ScientificAM9890
ECM 830 Cuadrado Porator ElectroporatorBTX45-0662
Gel de electrodoParker LabsPLI152CSZ
Fast Green DyeSigma-AldrichF7258-25G
Ayuda a soldar para manos amigasPro'sKit900-015
Micro Tijeras de Disección, 4.5" Rectas AfiladasRobozRS-5916
Cepa de Ratón: C57BL/6JEl Laboratorio JacksonJAX: 000664
Cepa de ratón: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/JEl Laboratorio Jackson  JAX: 007676
ParafilmGrainger16Y894
Plásmido: pCag-FlpO-2A-Cre EV Addgene129419
Pinza de platino, 7 mm de diámetroBTX45-0488
Contenedor de objetos punzocortantes, 1 cuarto de galónUlineS-15307
Capilares de vidrio estándar, 4 pulgadas, 1 mm de diámetro exterior, 0,58 mm de diámetro interior1B100F-4World Precision Instrumentsdeben extraerse - consulte la referencia 10 para obtener más detalles. 
Extractor de micropipetas verticalSutter InstrumentsP-30 Ajustes decalor: Calor #1 a 880, Calor #2 a 680; tirón a 800. Consulte la referencia 10 para obtener más detalles sobre la tracción.
Solución de tableta Vimoba QuipLaboratoriesVIMTAB
Microinyector digital XenoWorksSutter InstrumentsBRE
Soporte de micropipeta XenoWorksSutter InstrumentsBR-MH
Las pipetas capilares de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
  2. Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology A....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Modelos de tumores cerebralesentrega mediante electroporaci nmodelo de rat n inmunocompetentemodelado de glioblastomamicroambiente tumoralt cnica de microinyecci nmutag nesis som ticapruebas precl nicas de c ncer

Artículos relacionados