Aquí se presenta un protocolo efectivo de perfusión sanguínea rápida para preparar muestras de tejido de ranas con garras africanas para estudios de transcriptómica y proteómica.
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Artículo de método
Perfusión sanguínea rápida y efectiva en Xenopus
En este artículo
Resumen
Resumen
Xenopus ha sido poderosos organismos modelo para comprender el desarrollo y la enfermedad de los vertebrados durante más de 100 años. Aquí, se define un protocolo de perfusión sanguínea rápida en Xenopus, dirigido a una reducción consistente y drástica de la sangre dentro de todos los tejidos. La perfusión se lleva a cabo insertando una aguja directamente en el ventrículo del corazón y bombeando solución salina tamponada con fosfato heparinizado (PBS) a través del sistema vascular. El procedimiento se puede completar en aproximadamente 10 minutos por animal. La sangre está dominada por unas pocas proteínas y tipos de células muy abundantes, creando numerosos problemas ya que estas proteínas enmascaran la mayoría de las otras moléculas y tipos de células de interés. La caracterización reproducible de tejidos adultos de Xenopus con proteómica cuantitativa y transcriptómica unicelular se beneficiará de la aplicación de este protocolo antes del muestreo de órganos. Los protocolos para el muestreo de tejidos se definen en documentos complementarios. Estos procedimientos están dirigidos a la estandarización de prácticas en Xenopus de diferente sexo, edad y estado de salud, específicamente X. laevis y X. tropicalis.
Introducción
La perfusión de todo el cuerpo de los anfibios se completa rutinariamente con fines de preservación y fijación 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos procedimientos ocurren a una velocidad que limita el número de muestras frescas que se pueden tomar por animal. El objetivo de este trabajo es desarrollar un protocolo efectivo de perfusión sanguínea en Xenopus, priorizando la velocidad de la técnica. El protocolo toma menos de 10 min por animal para X. tropicalis y menos d....
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las reglas y regulaciones de la Escuela de Medicina de Harvard IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales) (IS 00001365_3).
NOTA: Aunque el método primario de eutanasia descrito es considerado una técnica aceptable para la eutanasia por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria12, no se ha encontrado que conduzca al cese de un latido cardíaco13. Incluso el método secundario de doble picadura utilizado con frecuencia no evita esto, ni tampoco la eliminación del corazón del animal. La exanguinación de animales anestesiados s....
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Resultados
Después de una perfusión exitosa, todos los tejidos (excluyendo el hígado en Xenopus pigmentado) serán claramente más ligeros y menos saturados de sangre. Los vasos sanguíneos principales se volverán menos notables (Figura 10), y los tejidos (excluyendo el hígado) se enjuagarán limpiamente en el tampón después de ser muestreados. Si bien la ejecución exitosa del protocolo solo puede confirmarse en última instancia por la calidad de los datos de muestras de tejido exsanguinadas, en l.......
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Discusión
Este protocolo describe las técnicas tradicionales de disección para acceder a la cavidad celómica. Otras técnicas también son aceptables, siempre que causen un daño mínimo a los tejidos, el corazón sea accesible y el pulmón y el estómago sean visibles. Del mismo modo, la mayoría de las herramientas de disección enumeradas se pueden sustituir fácilmente con elementos comparables.
Si bien se han hecho intentos para optimizar la eficacia de este procedimiento, los resultados pueden variar depend.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención OD R24 de los NIH OD031956 y la subvención R01 del NICHD HD073104. Agradecemos a Darcy Kelly por las útiles discusiones y los aportes iniciales sobre este protocolo. También nos gustaría agradecer a Samantha Jalbert, Jill Ralston y Wil Ratzan por su asistencia y apoyo, así como a nuestros tres revisores anónimos por sus comentarios.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5x Lupa con luz LED y soporte | amazon.com | B08QJ6J8P1 | no debe producir calor |
| Pipetas de transferencia desechables | VWR | em>414004-036 | |
| Pinzas de disección de punta fina | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Tijeras de disección afiladas piont, rectas 6,5" | VWR | 76457-374 | |
| Bandeja de disección | Fisher Scinetific | 14-370-284 | Las láminas de espuma de poliestireno son una alternativa aceptable |
| Contenedor de eutanasia | Artículo de plástico de EE. UU | . 2860 | recipientes opacos alternativos aceptables |
| Tapa del contenedor de eutanasia | Artículo de plástico de EE. UU | . 3047 | |
| Clavijas de disección fina Living | Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| Agujas hipodérmicas de uso general, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | para X. laevis |
| Agujas hipodérmicas de uso general, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | para X. tropicalis |
| Heparina, mucosa | intestinal porcinaMilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Tijeras de iridictomía 6" | vwr | 470018-938 | Las tijeras de iris son una alternativa aceptable |
| Adaptador Luer a lengüeta macho Luer con anillo de bloqueo | amazon.com | B09PTX6M2Z | tamaño dependerá de la manguera de la bomba utilizada |
| portaagujas Mayo-Hegar Fisher | Scinetific | 08-966 | pinzas para mosquitos son una alternativa aceptable |
| MS-222: Sincaína (antes tricaína) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Bomba dosificadora de líquido peristáltica 5– 100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | cualquier bomba peristáltica capaz de bombear 5-10 mL/min es aceptable |
| Piedra de afilar | VWR | 470150-112 | opcional; para agujas desafiladas |
| Bicarbonato de sodio, en polvo, USP | Pinza de muestra Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| dentada | VWR | 82027-442 | |
| Clavijas en T para diseccionar | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Jeringas de insulina cortas ultrafinas, | de alambre VWR | BD328438 | |
| , cortaúñas de corte lateral ultra afilados y potentes de 6 pulgadas | amazon.com | B087P191LP |
Referencias
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B.
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Reimpresiones y permisos
