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Artículo de método

Perfusión hepática aislada normomermica porcina

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DOI:

10.3791/65336

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9 de junio de 2023

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1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Laboratory of Abdominal Transplantation, KU Leuven, 2Department of Abdominal Transplant Surgery and Coordination, University Hospitals Leuven

En este artículo

Resumen

El modelo porcino de máquina de perfusión normotérmica hepática (NMP), descrito aquí, se puede utilizar con éxito para estudiar la NMP como estrategia de preservación, una herramienta para la evaluación de la viabilidad y una plataforma para la reparación de órganos. Tiene un alto valor traslacional, sin embargo, es técnicamente desafiante y requiere mucha mano de obra.

Resumen

Los modelos porcinos de perfusión normotérmica ex situ hepática (NMP) se utilizan cada vez más en la investigación de trasplantes. A diferencia de los roedores, los hígados porcinos son anatómica y fisiológicamente similares a los humanos, con un tamaño de órgano y una composición biliar similares. La NMP preserva el injerto hepático en condiciones casi fisiológicas al recircular una perfusión a base de glóbulos rojos caliente, oxigenada y enriquecida con nutrientes a través de la vasculatura hepática. La NMP se puede utilizar para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión, preservar un hígado ex situ antes del trasplante, evaluar la función del hígado antes de la implantación y proporcionar una plataforma para la reparación y regeneración de órganos. Alternativamente, se puede usar NMP con una perfusión a base de sangre total para imitar el trasplante. Sin embargo, este modelo es intensivo en mano de obra, técnicamente desafiante y conlleva un alto costo financiero.

En este modelo de NMP porcino, utilizamos hígados dañados isquémicos calientes (correspondientes a la donación después de la muerte circulatoria). En primer lugar, se inicia la anestesia general con ventilación mecánica, seguida de la inducción de isquemia caliente mediante el pinzamiento de la aorta torácica durante 60 min. Las cánulas insertadas en la aorta abdominal y la vena porta permiten la extracción del hígado con una solución de conservación fría. La sangre expulsada se lava con un protector de células para obtener glóbulos rojos concentrados. Después de la hepatectomía, se insertan cánulas en la vena porta, la arteria hepática y la vena cava infrahepática y se conectan a un circuito de perfusión cerrado preparado con un expansor de plasma y glóbulos rojos. Se incluye un oxigenador de fibra hueca en el circuito y se acopla a un intercambiador de calor para mantener una pO2 de 70-100 mmHg a 38 °C. La NMP se logra mediante un flujo continuo directamente a través de la arteria y a través de un depósito venoso a través de la vena porta. Los caudales, las presiones y los valores de gases en sangre se controlan continuamente. Para evaluar la lesión hepática, se toman muestras de perfusión y tejido en puntos de tiempo predefinidos; La bilis se recoge a través de una cánula en el conducto biliar común.

Introducción

El trasplante de hígado es el único tratamiento definitivo para la insuficiencia hepática terminal; Sin embargo, su éxito se ve limitado por un desequilibrio persistente entre los pacientes en lista de espera y la disponibilidad de órganos de posibles donantes1. Para aumentar el número de donantes, los criterios de los donantes se han ampliado gradualmente en la última década, incluyendo la edad avanzada del donante, la esteatosis hepática y la donación después de la muerte circulatoria (DCD)2,3. Durante un procedimiento de DCD, el hígado sufre invariablemente un período de isquemia caliente entre la retirada de la terapia de soporte vital, la declaración de muerte y el enfriamiento y conservación in situ, agravando la lesión por isquemia-reperfusión (IRI)4. Como resultado, los hígados con DCD se asocian con una mayor incidencia de disfunción temprana del injerto y complicaciones biliares 5,6.

Para estos hígados de donantes de alto riesgo, la conservación convencional con almacenamiento estático en frío no ofrece suficiente protección contra la IRI. Hasta ahora, las estrategias alternativas de conservación, como la perfusión normotérmica con máquina (NMP), han ganado una tracción considerable. Durante la perfusión normotérmica de la máquina, el hígado se conecta ex situ a un circuito aislado y se perfunde con una perfusión oxigenada y enriquecida en nutrientes a temperatura corporal. Los ensayos clínicos sugieren que la NMP reduce la lesión hepatocelular, como se refleja en la reducción de la liberación máxima de transaminasas y la disfunción temprana del injerto7. Sin embargo, se sabe poco sobre la biología de las células hepáticas durante la NMP8.

Los modelos animales han sido fundamentales en la evolución del trasplante de hígado. A diferencia de los modelos de roedores, se considera que el cerdo tiene un mayor valor traslacional, ya que el hígado porcino es anatómica y fisiológicamente similar al de los humanos, con un tamaño de órgano y una composición biliar similares. Sin embargo, los modelos de trasplante de hígado porcino son laboriosos, difíciles de estandarizar y conllevan un costo financiero significativamente mayor.

El NMP de hígado porcino se puede utilizar para diferentes propósitos. Se puede aplicar para imitar el trasplante ex situ cuando se utiliza una perfusión basada en sangre completa, para preservar el hígado de un donante en un entorno protector con una perfusión basada en glóbulos rojos con depleción de leucocitos, para evaluar posibles biomarcadores que predicen la función hepática ex situ antes del trasplante, o como plataforma para investigar la terapia regenerativa 9,10,11.

La adopción de modelos de NMP de hígado porcino es un desafío, mientras que los aspectos técnicos relacionados con la cirugía y la perfusión apenas se describen. En nuestro laboratorio de investigación, adoptamos la configuración NMP descrita originalmente por Butler et al.12 para desarrollar y validar un modelo de perfusión hepática aislada ex situ porcina de 24 h que podría usarse tanto para preservar un injerto hepático para trasplante como para imitar un trasplante. Aquí, describimos un protocolo paso a paso; En otros lugares se publica un marco metodológico y posibles escollos9.

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Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo después de la aprobación del comité de cuidado animal de KU Leuven y de acuerdo con las directrices europeas.

1. Información sobre animales

NOTA: Para este protocolo de estudio se utilizan cerdos machos TOPIGS TN70, de 3 meses de edad, con un peso corporal de aproximadamente 30 kg y un peso hepático de 600-700 g.

  1. Mantener a los animales bajo un ritmo día/noche de 12 h en corrales individuales con libre acceso a comida y agua del grifo y contacto visual, olfativo y auditivo entre ellos.
  2. Asegúrese de que los animales lleguen al menos 2 días antes de la cirugía para que se acostumbren a su entorno. Ayuna a los cerdos durante 12 horas antes de la cirugía con libre acceso al agua.
    NOTA: La anestesia se mantiene con isoflurano y la analgesia con fentanilo. Durante la anestesia, el electrocardiograma, la oximetría de pulso, la capnografía y la presión arterial se controlan continuamente. Los experimentos son terminales; Los cerdos son sacrificados por exanguinación mientras se obtiene el hígado bajo anestesia general y analgesia continuas.

2. Preparación de la configuración de perfusión

  1. Instalación del kit de perfusión desechable
    1. Fije el depósito a una altura fija aproximadamente 15 cm más alto que el receptáculo del hígado.
    2. Conecte el cabezal de la bomba a la ranura designada de la bomba centrífuga. Conecte el tubo de oxígeno al oxigenador. Conecte los tubos de entrada y salida del calentador/enfriador a las ranuras designadas del oxigenador.
    3. Instale una válvula de apriete en el tubo de salida debajo del depósito. Instale la segunda válvula de apriete en el tubo de entrada al depósito después de la conexión en Y, donde el otro tubo alimentará la arteria hepática.
      NOTA: La primera válvula de pellizco controlará el flujo de entrada en la vena porta. Cerrar la segunda válvula de pinza aumentará el flujo y, por lo tanto, también la presión en la arteria hepática.
    4. Instale el sensor de flujo distal desde la primera válvula de apriete en el tubo de salida del depósito. Instale el segundo sensor de flujo en el tubo de entrada al cabezal de la bomba.
      NOTA: El primer sensor de flujo medirá el flujo hacia la vena porta. El segundo sensor de flujo medirá el flujo de salida de la vena cava.
    5. Corte el tubo de salida del oxigenador e inserte el filtro arterial en la dirección correcta.
      NOTA: Corte el tubo a no más de 2 cm después del oxigenador; si se deja demasiado tiempo, se retorcerá cuando el tubo se vuelva más blando cuando se perfunda con una perfusión de 37 °C. Si todavía se retuerce, sostenga el filtro arterial atándolo al soporte del depósito.
  2. Instalación del tubo de recirculación de fugas
    1. El kit de perfusión contiene dos tubos con un extremo 3/16 y otro 1/16. Conecte los dos tubos entre sí insertando el extremo 1/16 en el extremo 3/16. Conecte el extremo 3/16 al depósito.
    2. Instale el tubo en la bomba de rodillos, teniendo en cuenta la dirección de rotación. Configure el diámetro correcto del tubo y ajuste la velocidad a 15-18 rotaciones por minuto (rpm). Coloque el extremo 1/16 en el receptáculo hepático y fíjelo si es necesario.
  3. Calibración continua de análisis de gases en sangre en línea
    1. Encienda el analizador de gases y seleccione Calibrar.
    2. Compruebe el número de serie correcto en el paquete del sensor y pulse OK.
    3. Saque el soporte del sensor arterial del casete y conecte el sensor a él con una tapa azul en la parte superior y un filtro blanco en la parte inferior.
    4. Desenrosque y retire la tapa blanca debajo del filtro; No desenrosque el filtro en sí. Afloje la tapa de ventilación azul en la parte superior, no la quite. Inserte firmemente el sensor y el soporte del sensor en el casete de calibración.
    5. Inicie la calibración. Una vez finalizada la calibración, retire el sensor y el soporte del sensor del casete de calibración. Retire el filtro blanco en la parte inferior y apriete la tapa de ventilación azul en la parte superior.
    6. Inserte el sensor en la línea de muestreo del kit de perfusión. No inicie el análisis de gases hasta que el circuito de perfusión esté cebado.
  4. Cebado del circuito
    1. Inserte una línea de infusión en una bolsa de 500 ml de expansor de plasma y conéctela al depósito. Coloque una abrazadera de tubo en la línea de salida del depósito y llene el depósito con 300 ml de expansor de plasma.
    2. Retire la abrazadera del tubo y deje que el expansor de plasma llene el circuito
    3. Desairee el cabezal de la bomba y el oxigenador. El circuito ya está preparado. Encienda el calentador/refrigerador y ajústelo a 38 °C
  5. Preparación de las líneas de infusión
    1. Extraiga 5 mL (25.000 U) de una solución de heparina 5 U/mL en una jeringa de 50 mL. Extraiga 25 mL adicionales de solución de NaCl al 0,9% para obtener un volumen total de 30 mL de solución de heparina (velocidad de infusión: 1 mL/h).
    2. Disuelva 5 g de taurocolato de sodio en 50 mL de NaCl al 0,9% y extráigalo en 450 mL de NaCl al 0,9% para alcanzar una concentración del 1%. Se necesita un volumen total de 168 mL (velocidad de infusión: 7 mL/h).
    3. Extraiga 2 mL (200 U) de una solución de insulina de 100 U/mL en una jeringa de 50 mL. Extraiga 28 mL adicionales de solución de NaCl al 0,9% para obtener un volumen total de 30 mL de solución de insulina (velocidad de infusión: 1 mL/h).
    4. Extraiga 10 ml de tampón de glicina (diluyente) y añádalo al vial de 0,5 mg de epoprostenol. Usando el filtro microbiano provisto en el kit de epoprostenol, extraiga 5 mL del vial que contiene el epoprostenol reconstituido con tampón de glicina en una jeringa de 50 mL. Extraiga 25 mL adicionales de solución de NaCl al 0,9% para obtener un volumen total de 30 mL de solución de epoprostenol (velocidad de infusión: 1 mL/h).

3. Inducción de la anestesia

  1. Sedación
    1. Prepare una jeringa con 2 mg/kg de xilacina y 8 mg/kg de Zoletil (4 mg/kg de tiletamina y 4 mg/kg de zolazepam), una jeringa con 10 mL de NaCl al 0,9%, una válvula de tres vías, una línea de extensión y una aguja intramuscular de 21 G.
    2. Coloque la aguja en el músculo glúteo, inyecte la mezcla de xilacina y tiletamina y enjuague la línea de extensión con NaCl al 0,9%. Después de 15 minutos, el cerdo es sedado.
    3. Pesar el cerdo y transportarlo al quirófano.
  2. Anestesia
    1. Encienda el ventilador
    2. Coloque al cerdo en posición supina sobre la mesa de operaciones y fije las extremidades.
    3. Preoxigenar con una mascarilla de ventilación con 1,5 L deO2, 1,5 L de aire e isoflurano al 1%.
    4. Coloque una sonda de saturación en la cola o la oreja. Conecte los tres cables del electrocardiograma para una monitorización continua.
    5. Inserte un catéter de 22 G en una vena del oído, conéctelo a una válvula de tres vías e inicie un goteo de líquidos intravenosos (IV) (plasmalyte) a una velocidad de 400 mL/h.
    6. Coloque una jeringa de 60 ml con 50 μg/ml de fentanilo en un controlador de jeringa automático. Administrar un bolo de 1 mL e iniciar una perfusión continua a razón de 0,16 mL/kg/h.
    7. Retire la máscara de ventilación e inserte el laringoscopio, levantando la epiglotis. Inserte un tubo endotraqueal en la tráquea e infle el globo para evitar fugas de aire. Fija el tubo con cinta adhesiva al hocico del cerdo.
      NOTA: Cierre el isoflurano al retirar la mascarilla de ventilación.
    8. Conecte el tubo endotraqueal al ventilador.
      NOTA: Ajustes del ventilador: volumen corriente de 0,4 L; Presión media de la vía aérea de 0,5 kPa; 2,5 kPa de presión en las vías respiratorias; 0,5 kPa presión positiva al final de la espiración; Frecuencia de 15/min; 4,7-5,3 kPa CO 2 al final de la espiración.
    9. Conecte el capnógrafo al tubo endotraqueal.

4. Cirugía

  1. Catéter venoso profundo y vía arterial
    1. Desinfecte el campo quirúrgico con betadine y coloque paños a ambos lados de la línea media.
    2. Realizar una incisión de 7 cm de largo desde el lado izquierdo de la parte superior del esternón lateralmente hasta el músculo esternocleidomastoideo y colocar un retractor ortostático.
    3. Diseccionar el tejido subcutáneo del músculo en dirección lateral e identificar la vena yugular externa. Diseccionar libremente la vena, ligando las ramas laterales si están presentes.
    4. Coloque dos ligaduras 2/0 alrededor de la vena yugular externa y ate la ligadura craneal.
    5. Corte la vena caudal de la ligadura atada e inserte un catéter venoso de French 12.
      NOTA: Asegúrese de que el catéter venoso esté enjuagado con solución salina heparinizada antes de la inserción.
    6. Fije el catéter con la segunda ligadura. Si el catéter venoso en la vena del oído es frágil o demasiado pequeño, cambie las vías de líquido intravenoso y fentanilo por el catéter venoso profundo. De lo contrario, no lo use hasta la recolección de sangre para el protector de células.
    7. Diseccionar el borde medial del músculo esternocleidomastoideo y reemplazar el retractor ortostático abriendo el plano entre el músculo esternocleidomastoideo en el lado lateral y la tráquea en el lado medial.
    8. Extirpar el timo para exponer la arteria carótida. Repita el paso 4.1.4 para la arteria.
    9. Inserte la vía arterial en la arteria carótida en dirección caudal y fije. Conecte la vía arterial a la vía del monitor de presión.
  2. Disección de la aorta y la vena cava
    1. Realizar una laparotomía de la línea media desde el xifoides hasta el hueso púbico.
      NOTA: En cerdos machos, caudal desde el pene, incidir 1 cm lateral desde la línea media para evitar dañar la uretra subcutánea.
    2. Transecto del ligamento umbilical. Coloque un retractor abdominal. Tire de los intestinos hacia la izquierda lateral y cranealmente para visualizar la aorta y la vena cava.
      NOTA: El intestino porcino no está rotado; Por lo tanto, no es necesaria la movilización del colon para acceder al retroperitoneo.
    3. Diseccionar libremente aproximadamente 3 cm de la aorta justo craneal de la bifurcación ilíaca y colocar dos ligaduras alrededor de la aorta.
      NOTA: Hay un gran vaso linfático cerca de la aorta; Tenga cuidado de no dañarlo, ya que esto difuminará el campo quirúrgico y complicará la disección.
    4. Diseccionar libremente la vena cava al mismo nivel que la aorta y colocar dos ligaduras.
  3. Disección del ligamento gastroduodenal
    1. Iniciar la disección en el lado lateral del ligamento gastroduodenal, diseccionar libremente el conducto biliar común y rodear con un asa vascular.
    2. Retrae el conducto biliar hacia el lado medial, exponiendo la vena porta. Extirpar un ganglio linfático grande en el lado lateral de la vena porta
    3. Liberar la vena porta hacia el páncreas; A menudo hay una rama del estómago y el páncreas que necesita ser ligada y seccionada. Rodea la vena porta con un asa vascular en el lado del hígado y una ligadura en el lado del páncreas. Retrae la vena porta lateralmente, asegurándote de no cerrarla.
    4. Identifique la arteria hepática común y rodéela con un asa vascular.
  4. Disección de la aorta torácica
    1. Tire de la caudal hepática y abra la parte tendinosa central del diafragma ventralmente desde la vena cava suprahepática. Retrae el esófago hacia el lado derecho, exponiendo la aorta torácica.
    2. Diseccione sin separarse del tejido circundante y tenga cuidado de no dañar la vena ácigos.
      NOTA: No es necesario rodear la aorta torácica; La disección debe extenderse lo suficiente como para colocar una pinza vascular.
  5. Preparación del protector de celdas
    1. Cuelgue el depósito en el anillo negro, retire la tapa de la pata única del adaptador y conecte el tubo al puerto de salida de 3/8 de pulgada en la parte inferior del depósito de recolección de sangre.
    2. Destape el tubo de succión/anticoagulante y conéctelo a uno de los puertos de entrada de sangre de 1/4 de pulgada en el borde superior del depósito de recolección de sangre.
    3. Inserte el recipiente del kit de lavado girando; Asegúrate de que se escuche un clic.
    4. Coloque el tubo en la bomba de rodillos y el divisor de tubos.
    5. Cuelgue una bolsa de recolección de sangre de citrato, fosfato, dextrosa adenina (CPDA)-1 en el poste y asegúrese de que la conexión esté apretada.
      NOTA: Composición de la bolsa de sangre CPDA-1 (63 mL): 2,99 g/L de ácido cítrico anhidro; 26,3 g/L de citrato de sodio dihidro; 2,22 g/L de fosfato sódico monohisrato; 31,9 g/L de dextrosa monohidrato; 0,275 g/L de adenina.
    6. Cuelgue la bolsa de residuos en el lateral de la máquina (asegúrese de que esté bien cerrada) y conéctela al kit de lavado (tapón amarillo).
    7. Conecte ambos tubos en forma de Y (tapas blancas) a una bolsa de 3 L de NaCl al 0,9%.
    8. Conecte el tubo con la tapa azul al tubo adaptador en la parte inferior del depósito de recolección de sangre. Encienda el sistema de autotransfusión.
  6. Canulación de la aorta y la vena cava
    1. Administrar 500 UI/kg de heparina y dejar circular durante 2 min. Ate la ligadura caudal alrededor de la aorta e inserte una cánula de 20 French en la aorta y fije. El mismo procedimiento se repite para la vena cava.
  7. Para imitar un procedimiento de DCD, la isquemia caliente se induce mediante el pinzamiento de la aorta torácica durante un período de tiempo, en este caso 60 min.
    NOTA: Durante la isquemia caliente, se abre el drenaje caval y yugular, y se inicia la recolección de sangre para el protector de células. Esto da como resultado la exanguinación del cerdo.
  8. Enjuague del hígado
    1. Al final de la isquemia tibia, iniciar un enjuague frío con 2 L de solución de conservación helada (4-6 °C) a través de la cánula aórtica y enfriar el abdomen con una aplicación tópica de hielo granizado.
      NOTA: Durante la descarga fría, toda la sangre restante se elimina y se recoge en el protector de celdas.
    2. Cuando se enjuaguen los primeros 2 L, retire la cánula de la aorta, ate la ligadura en la vena porta y canule la vena porta. Luego, fíjelo con el lazo del recipiente.
    3. Enjuague el hígado a través de la vena porta con otros 2 L de solución de conservación helada (4-6 °C).
  9. Hepatectomía
    1. Retira el hielo del abdomen. Transecto del conducto biliar cerca del páncreas.
    2. Retire la cánula porta y divida la vena porta. Retraiga los intestinos hacia la izquierda para exponer la vena cava infrahepática.
    3. Diseccionar la vena cava libre del retroperitoneo y dividir solo las venas craneales de las renales. Diseccionar la arteria hepática común hasta la arteria celíaca y proceder de la aorta.
      NOTA: Cortar los crus diafragmáticos correctos puede mejorar la exposición.
    4. Divida la arteria gastroduodenal y corte la arteria celíaca con un parche de la aorta. Transecto el epiplón menor cerca del estómago cranealmente hasta el esófago
    5. Movilizar el hígado izquierdo cortando el ligamento triangular izquierdo. Corta el diafragma en el lado izquierdo de la vena cava.
    6. Movilizar el hígado derecho cortando el diafragma derecho desde el ventral hasta el dorsal, terminando caudalmente desde la transección de la vena cava infrahepática.
    7. Corta la vena cava suprahepática y corta los accesorios restantes. El hígado ahora está libre; Retíralo y colócalo en un recipiente con agua helada.
  10. Procedimiento de la mesa trasera
    1. Pesa el hígado. Cánula la vena porta con una cánula francesa de 25 y asegúrela con ligaduras. Cánula de la arteria hepática con una cánula reforzada de 14 French y fijación con ligaduras.
    2. Cánula la vena cava infrahepática y colocar la punta de la cánula al nivel donde drenan las venas hepáticas en la vena cava. Fijar con ligaduras.
    3. Coloque una cuerda alrededor del borde del diafragma para evitar el sangrado de las venas diafragmáticas y ate la vena cava suprahepática.
    4. Desairee la cánula porta y realice un lavado de la vena porta con 250 mL de expansor de plasma frío. Compruebe si hay fugas.
      NOTA: Verifique que el flujo de salida sea adecuado a través de la cánula cava.
    5. Después de la descarga portal, coloque una pinza de tubo en la cánula portal, asegurándose de que no entre aire en la cánula y la vena porta.
    6. Desairee la cánula arterial y enjuague 250 mL de expansor de plasma frío a través de la arteria hepática. Compruebe si hay fugas y corte las ramas laterales. Coloque una pinza de tubo en la cánula arterial y cava.

5. Perfusión de la máquina normotérmica

  1. Perfundir
    1. Durante la preparación de la mesa trasera, agregue los glóbulos rojos lavados y producidos por el protector de células al circuito para obtener el hematocrito deseado del 30%. Ponga en marcha la bomba para mezclar los glóbulos rojos con el expansor de plasma. Inicie el analizador de gas continuo.
      NOTA: La fórmula para el volumen de glóbulos rojos para obtener el hematocrito deseado: (peso del hígado + volumen de cebado) x hematocrito deseado / hematocrito después del lavado. El analizador continuo de gases también proporciona información sobre la temperatura de perfusión, que normalmente coincide con el ajuste del calentador a 38 °C.
    2. Añadir 10 mL de gluconato cálcico al 10%, 2 mL de heparina (10.000 UI) y 750 mg de cefuroxima en 10 mL de NaCl al 0,9% a la perfusión. Ajuste el mezclador de gas manual a 0,5 L/min FiO2 del 21%.
  2. Inicio de la perfusión
    1. Encienda los sensores de presión, los sensores de flujo y la bomba de rodillos para la recirculación de fugas.
    2. Coloque el hígado en el recipiente. Coloque las abrazaderas del tubo en el tubo de entrada portal y arterial y el tubo de salida caval del circuito, y corte el conector en Y.
    3. Conecte las cánulas a sus respectivos tubos de entrada y salida con una pieza de conexión en T en el medio. Evite que el aire entre en el circuito.
    4. Instale grifos de tres vías en las piezas de conexión en T y conecte las líneas de presión a ellas. Cero presión en las líneas e inicio de un monitoreo continuo de la presión.
    5. Ajuste de las válvulas de aprieto, cerrándolas casi por completo, para evitar flujos suprafisiológicos y estrés endotelial.
    6. Inicie la perfusión retirando las pinzas del tubo de entrada del portal. Inmediatamente después de que haya comenzado el flujo de entrada del portal, retire las abrazaderas del flujo de salida cavo y encienda la bomba. La velocidad de la bomba está controlada por presión, por lo que debe apuntar a una presión en el flujo de salida cavo entre -5 mmHg y -2 mmHg. Aspire a un flujo portal de 0,75 mL/min/g de hígado.
    7. Cuando la perfusión portal es estable y las presiones cavas son adecuadas, retire las pinzas del tubo arterial. Apunte a presiones de alrededor de 55-60 mmHg y flujos de alrededor de 0,25 mL/min/g de hígado.
  3. Mantenimiento de una hemodinámica de perfusión estable
    1. Cubra el hígado con una cúpula de vidrio o una envoltura de plástico para evitar la pérdida de calor de la superficie.
    2. Si el flujo portal es demasiado alto, cierre la válvula de apriete en el tubo de entrada del portal.
    3. Si la presión cava se vuelve demasiado negativa, aumenta el riesgo de crear un vacío dentro de la vena cava. Las presiones negativas excesivas se pueden contrarrestar disminuyendo la velocidad de la bomba. Alternativamente, el aumento del flujo de entrada a través de la vena porta reduce la presión de salida negativa al proporcionar más volumen a la vena cava.
    4. Si la presión arterial es demasiado baja, se puede aumentar aumentando la velocidad de la bomba o cerrando la válvula de apriete hacia el depósito portal para empujar más flujo a través del tubo de entrada arterial.
  4. Muestreo
    1. Obtenga las muestras de perfusión de la válvula de tres vías de salida caval o de una línea de muestreo designada entre el oxigenador y el depósito portal.
    2. Obtener biopsias con aguja durante toda la perfusión. Los orificios de la aguja deben suturarse ya que no hay coagulación debido a la heparinización del circuito.
    3. Recoja la bilis fijando una cánula francesa de 8 en el conducto biliar. Asegúrate de ligar el conducto cístico.

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Resultados

El protocolo de perfusión presentado utiliza la autorregulación del flujo sanguíneo hepático para lograr condiciones hemodinámicas estables hasta por 24 h y simular la distribución fisiológica del flujo sanguíneo en la vena porta y la arteria hepática. La figura 1 representa una descripción esquemática del circuito de perfusión. La figura 2A muestra una distribución constante del flujo sanguíneo, con la vena porta y la arteria hepática contribuyendo aproximadame...

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Discusión

Aquí, hemos detallado nuestra experiencia con el hígado porcino NMP. Las ventajas de esta técnica incluyen un alto valor traslacional y versatilidad. La NMP del hígado porcino se puede aplicar para investigar y aumentar la comprensión de esta técnica de preservación mejorada o, alternativamente, para imitar el trasplante. Esta configuración permite el control manual de todos los aspectos de la perfusión, lo que permite ajustar la presión y el flujo tanto portal como arterial de varias ma...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a todos los estudiantes de investigación de la facultad de medicina de KU Leuven involucrados en estos experimentos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bomba de jeringa Alaris GH PlusBD Care Fusion80023 UN 01-G
Dispositivo de anestesiaDrä GerTitus
Catéter arterial Cavafix CertoBraun, Melsungen, AlemaniaBRAU4152557
Analizador de gases en sangreRadiómetroABL815
Gluconato de calcio 10%Braun, Melsungen, Alemania570/13596667/1214
CapnógrafoDrä GerScio
Protector de celdasMedtronicRegistro automático
Bomba centrífuga BiomedicusMedtronic85315 REV 3.0
Centrífuga Rotina 420R HettichVWR521-1156
Circuito de perfusión a medidaMedtronicM323901C
Conjunto desechable de ahorro de celdasMedtronicATLS24
Cánula venosa de una sola etapa DLP, recta 20FMedtronic66120
EpoprostenolGlaxoSmithKline Bélgica, Wavre, BélgicaFlolan
Fentanilo-Janssen 0.05 mg/mLJanssenHK-08700
Sensor de caudal BioPro TTEm-Tec12271
Formaldehído 4%VWRVWRK4078.9005
Congelador -80 ° CNuevo Brunswick CientíficoU570-86
NeveraLiebherrCOPA 3513
GeloplasmaFresenius-Kabi, Bad Homburg, AlemaniaFreeflex
Enfriador de calentadorStö ckert-Shiley, grupo Sorin16-02-1950
Heparina 5000 IE/mlLeo Pharma, Ballerup, DinamarcaHeparinaLeo
Cánula de la arteria hepáticaMedtronicBIO-MEDICUS 12F
Solución de preservación de órganos IGL-1Institut Georges LópezIGL-1/1000/D
Analizador de gases en sangre en líneaTERUMOCalibrador 3MCDI 540/CDI 500
Insulina 200 UI ActrapidNovo Nordisk, Dagsvaerd, DinamarcaMEDI-00018
Isoflurano 1000 mg/g Vapor de inhalaciónChanelle PharmaIso-Vet
catéter intravenoso BD Insyte-W 20 GBD381334
Tanque de nitrógeno líquidoIsoterma KGWS22
Mersilene 250CM M3 USP2/0 ligapak sin agujasJNJ médicoF4503
Mersilene 250CM M3.5 USP0 ligapak sin agujasJNJ médicoF4504
Mersilene 5X70CM M3.5 USP0 sin agujasJNJ médicoEH6935H
Mersilene 6X45CM M3 USP2/0 sin agujasJNJ médicoEH6734H
Micro pipetas 1000 µ LSocorex82,51,000
MonitorizaciónSiemensSC 8000
Plasmalyte ViafloBaxterPlasmalyte Viaflo
Cánula de la vena portaLABORATORIOS CALMADOS18F RV-40018
Sensor de presiónStö ckert-Shiley, grupo Sorin22-06-2000
Servorregulador de presiónMedtronicBM 9505-2
Prolene 4-0JNJ médicoEH7151H
Bomba de rodillosCobe Century USA468048-000 REV C
Bicarbonato de sodio 8,4%Braun, Melsungen, Alemania362 2339
Taurocolato de sodioSigma Aldrich, Burlington, Estados Unidos86339
Bisturí quirúrgico nº 24Swann Morton0211
Catéter venoso, 3 lúmenes; 12FRFLECHAAK-12123-F
Vicryl Vio 250CM M2 USP3/0 gigapak sin agujaJNJ médicoV1205G
Xilacina 2%VMD Ganadería farmacéuticaXYL-M 2%
Zinacef Cefuroxima 750 mgGlaxoSmithKline Bélgica, Wavre, BélgicaNDC 0173-0353-32
Zoletil 100VirbacZoletil 100

Referencias

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