Summary
Explorar a mitofagia por meio de microscopia eletrônica, sensores genéticos e imunofluorescência requer equipamentos caros, pessoal qualificado e um investimento de tempo significativo. Aqui, demonstramos a eficácia de um kit comercial de corante de fluorescência na quantificação do processo de mitofagia em ambos Caenorhabditis elegans e uma linhagem celular de câncer de fígado.
Abstract
As mitocôndrias são essenciais para várias funções biológicas, incluindo produção de energia, metabolismo lipídico, homeostase do cálcio, biossíntese do heme, morte celular regulada e geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). As ROS são vitais para os principais processos biológicos. No entanto, quando não controladas, podem levar a lesões oxidativas, incluindo danos mitocondriais. As mitocôndrias danificadas liberam mais EROs, intensificando assim a lesão celular e o estado da doença. Um processo homeostático chamado autofagia mitocondrial (mitofagia) remove seletivamente as mitocôndrias danificadas, que são então substituídas por novas. Existem múltiplas vias de mitofagia, com o objetivo comum sendo a quebra das mitocôndrias danificadas nos lisossomos.
Várias metodologias, incluindo sensores genéticos, imunofluorescência de anticorpos e microscopia eletrônica, usam esse desfecho para quantificar a mitofagia. Cada método para examinar a mitofagia tem suas vantagens, como o direcionamento específico de tecido/célula (com sensores genéticos) e grande detalhe (com microscopia eletrônica). No entanto, esses métodos geralmente exigem recursos caros, pessoal treinado e um longo tempo de preparação antes do experimento real, como para a criação de animais transgênicos. Aqui, apresentamos uma alternativa custo-efetiva para medir mitofagia usando corantes fluorescentes comercialmente disponíveis visando mitocôndrias e lisossomos. Este método mede efetivamente a mitofagia no nematoide Caenorhabditis elegans e em células hepáticas humanas, o que indica sua potencial eficiência em outros sistemas modelo.
Introduction
As mitocôndrias são essenciais para todos os animais aeróbicos, incluindo os seres humanos. Eles convertem a energia química das biomoléculas em trifosfato de adenosina (ATP) via fosforilação oxidativa1, sintetizam heme2, degradam ácidos graxos através da oxidação β3, regulam a homeostase do cálcio4 e ferro5, controlam a morte celular pela apoptose6 e geram espécies reativas de oxigênio (EROs), que desempenham um papel vital na homeostase redox7. Dois processos complementares e opostos mantêm a integridade e o bom funcionamento das mitocôndrias: a síntese de novos componentes mitocondriais (biogênese) e a remoção seletiva dos danificados através da autofagia mitocondrial (i.e., mitofagia)8.
Várias vias mitofágicas são mediadas por enzimas, como PINK1/Parkin, e receptores, incluindo FUNDC1, FKBP8 e BNIP/NIX 9,10. Notadamente, a degradação seletiva de componentes mitocondriais pode ocorrer independentemente da maquinaria autofagossomal (isto é, através de vesículas derivadas da mitocôndria)11. No entanto, os desfechos das diferentes vias de mitofagia seletiva são semelhantes (i.e., degradação mitocondrial por enzimas lisossômicas)12,13. Por essa razão, vários métodos de identificação e mensuração da mitofagia dependem da colocalização de marcadores mitocondriais e lisossômicos 14,15,16,17 e diminuição dos níveis de proteínas mitocondriais/DNA mitocondrial 18.
A seguir, uma descrição concisa das metodologias experimentais existentes para medir a mitofagia em células animais usando microscopia de fluorescência, enfatizando a fase final da mitofagia.
Biossensores de mitofagia
A degradação mitocondrial ocorre no ambiente ácido do lisossomo19. Portanto, os componentes mitocondriais, incluindo proteínas, experimentam uma mudança de um pH neutro para um pH ácido no final do processo de mitofagia. Esse padrão sustenta o mecanismo de ação de vários biossensores mitofágicos, incluindo mito-Rosella18 e mCherry-GFP-FIS1 em tandem114. Esses sensores contêm uma proteína de fluorescência verde sensível ao pH (GFP) e uma proteína de fluorescência vermelha (RFP) insensível ao pH. Portanto, no final da mitofagia, a razão de fluorescência verde-vermelho cai significativamente devido à extinção do fluoróforo GFP. As principais limitações desses sensores são (1) possível transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre os fluoróforos; (2) a taxa de maturação diferencial de GFP e RFP; (3) dissociação entre GFP e RFP devido à clivagem proteolítica do polipeptídeo que as conecta; (4) sobreposição de fluorescência-emissão; e (5) brilho diferencial do fluoróforo e têmpera15,16.
Um sensor que supera algumas dessas limitações é o sensor mitocondrialKeima17. O sensor mt-Keima (derivado da proteína coral Keima) exibe um único pico de emissão (620 nm). No entanto, seus picos de excitação são sensíveis ao pH. Como resultado, há uma transição de uma excitação verde (440 nm) para uma excitação vermelha (586 nm) ao mudar de um pH elevado para um pH ácido16,17. Um sensor de mitofagia mais recente, o Mito-SRAI, tem avançado o campo ao permitir medições em amostras biológicas fixas20. No entanto, apesar das muitas vantagens dos sensores genéticos, como a capacidade de expressá-los em tecidos/células específicos e direcioná-los para compartimentos mitocondriais distintos, eles também apresentam limitações. Uma limitação é que os sensores genéticos precisam ser expressos em células ou animais, o que pode ser demorado e intensivo em recursos.
Além disso, a expressão dos sensores dentro das próprias mitocôndrias pode influenciar a função mitocondrial. Por exemplo, a expressão de GFP mitocondrial (mtGFP) nos músculos da parede do corpo do verme C. elegans expande a rede mitocondrial21. Esse fenótipo depende da função do fator de transcrição ativado por estresse ATFS-1, que desempenha um papel essencial na ativação da resposta proteica desdobrada na mitocôndria (UPRmt)21. Portanto, embora os biossensores mitocondria/mitofagia codificados geneticamente sejam extremamente úteis para monitorar a homeostase mitocondrial in vivo, eles podem afetar o próprio processo que são projetados para medir.
Anticorpos e corantes mitocondria/lisossomos específicos
Outra estratégia para testar a colocalização mitocondrial/lisossomal é a utilização de anticorpos contra proteínas mitocondriais/lisossomais, como a proteína de membrana externa mitocondrial TOM20 e a proteína de membrana associada lisossomal 1 (LAMP1)22. Na maioria dos casos, anticorpos secundários que são conjugados a um fluoróforo são usados para detectar o sinal de fluorescência via microscopia. Outra estratégia é combinar construções genéticas com corantes mitocondriais/lisossomais, como expressar uma fusão LAMP1::GFP em células enquanto as cora com um corante mitocondrial vermelho (por exemplo, Mitotracker Red)16. Essas metodologias, embora eficazes, requerem anticorpos específicos e muitas vezes envolvem o trabalho com espécimes fixos ou a geração de células/animais transgênicos expressando mitocôndrias/lisossomos marcados fluorescentemente.
Neste artigo, descrevemos a utilização de um kit comercial de coloração lisossomos/mitocôndrias/nucleares para avaliar as propriedades ativadoras da mitofagia da diamina sintética O,O (octano-1,8-diil)bis(hidroxilamina), doravante denominada VL-85023, em vermes de C. elegans e na linhagem de células cancerígenas humanas Hep-3B (Figura 1). O kit de coloração contém uma mistura de corantes lisossômicos/mitocondriais/nuclear-direcionados que coram especificamente essas organelas23. Utilizamos previamente este kit para demonstrar a atividade mitofágica de 1,8 diaminooctano (doravante denominada VL-004) em C. elegans23. É importante ressaltar que validamos os resultados do kit de coloração com o biossensor mito-Rosella e medidas de qPCR do conteúdo de DNA mitocondrial:nuclear23. Este kit de coloração oferece as seguintes vantagens. Primeiro, não há necessidade de gerar animais transgênicos ou células expressando um biossensor mitocondrial. Portanto, podemos estudar animais ou células selvagens não modificados e, assim, economizar muito tempo, dinheiro e trabalho. Além disso, como mencionado, a expressão de biossensores mitocondriais pode alterar a função mitocondrial. Em segundo lugar, o kit é econômico, fácil de usar e rápido. Terceiro, embora demonstremos o método em células de C. elegans e humanas, ele poderia ser modificado para outros tipos celulares e organismos.
Dito isso, como qualquer método, o protocolo do kit de coloração tem desvantagens. Por exemplo, a incubação dos vermes com o reagente é realizada na ausência de alimento (vimos que mesmo bactérias mortas diminuem significativamente a eficiência de coloração). Embora o tempo de incubação seja relativamente curto, é possível que, mesmo nesse período de tempo, as respostas homeostáticas possam estar alteradas, incluindo a mitofagia. Além disso, a ligação dos corantes às proteínas ER/mitocondriais/nucleares e outras biomoléculas pode afetar as atividades dessas organelas. Além disso, ao contrário da medição da mitofagia com sensores genéticos, trabalhamos com vermes e células que sofreram fixação química. Portanto, é impossível continuar monitorando os mesmos vermes/células em momentos diferentes. Assim, recomenda-se a combinação de diferentes metodologias para validar a função da mitofagia em um determinado processo fisiológico. A seguir, apresentamos novos dados demonstrando que o VL-850 induz mitofagia robusta em vermes C. elegans e células Hep-3B. Portanto, esses dados apoiam ainda mais a hipótese de que o VL-850 estende a vida útil de C. elegans e protege C. elegans de danos oxidativos através da indução de mitofagia saudável . Utilizamos o ionóforo de prótons carbonil cianeto 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP), que é um potente indutor de mitofagia24, como controle positivo.
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Protocol
NOTA: Para maior comodidade dos leitores, dividimos o protocolo em duas partes: uma enfoca o protocolo de medição de mitofagia em C. elegans, e a outra foca o protocolo de medição de mitofagia em células hepáticas. A lista de materiais pode ser encontrada na Tabela de Materiais fornecidos.
1. O protocolo de C. elegans
- Preparo das placas de meio de cultura do nematoide (NGM) e do estoque bacteriano OP50 de Escherichia coli
OBS: A título de esclarecimento, embora tenhamos seguido protocolos padronizados para a preparação das placas NGM e estoque bacteriano OP5025,26, reconhecemos que pode haver variações nesses protocolos entre diferentes laboratórios. Portanto, incluímos os protocolos completos para garantir a replicação precisa do experimento.- Fazer um tampão fosfato de potássio 1 M, pH 6, adicionando ~150 mL de 1 M K 2 HPO 4 a 500 mL de 1 M KH2PO4 solução até atingir pH 6. Esterilize o tampão passando-o através de um filtro/sistema de armazenamento a vácuo de 0,22 μm.
- Fabricar 0,1 M de cloreto de cálcio (CaCl 2) e sulfato de magnésio (MgSO4) e esterilizá-los com um filtro de seringa de0,2 μm.
- Preparar 5 mg/mL de colesterol em etanol absoluto.
NOTA: Como o colesterol é preparado em etanol, não o filtre. - Preparar NGM-ágar dissolvendo 1,5 g de cloreto de sódio (NaCl), 1,25 g de peptona e 8,5 g de ágar em 500 mL de água bidestilada (DDW). Autoclave e deixe esfriar até ~55 °C.
- Em condições estéreis, adicionar 12,5 mL de tampão fosfato de potássio (pH 6), 0,5 mL de CaCl2 0,1 M, 0,5 mL de MgSO4 0,1 M e 1 mL de colesterol 5 mg/mL. Misture bem após cada adição.
- Adicionar 4 mL do ágar-NGM fundido a cada placa de 35 mm. Deixe os pratos durante a noite para solidificar à temperatura ambiente (RT, ~21 °C).
- Para fazer placas de ágar Luria-Bertani (LB), dissolver 5 g de NaCl, 5 g de triptona, 2,5 g de extrato de levedura e 7,5 g de ágar em 400 mL de água destilada e deionizada (DDW), ajustar o pH da solução para 7,0, levar o volume até 500 mL com DDW e autoclave. Uma vez arrefecida a solução a 55 °C, deite 25 ml da mistura em cada placa de Petri de 90 mm e deixe secar as placas durante 2 dias à temperatura ambiente. Em seguida, estique as bactérias OP50 nas placas de LB secas do estoque de glicerol e incube a 37 °C durante a noite para obter colônias únicas.
- Preparar 2x triptona de levedura (YT) dissolvendo 8 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 2,5 g de cloreto de sódio (NaCl) em 0,5 L de DDW. Ajuste o pH para 7 e autoclave.
- Após o resfriamento, inocular uma colônia de bactérias OP50 da placa LB recém-estriada em 50 mL de meio 2x YT em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL. Agitar a 37 °C e 250 rpm até uma densidade óptica (OD600) de aproximadamente 0,6.
- Preparação do veículo e das placas experimentais
- Adicionar 100 μL de bactérias OP50 ao centro de cada placa de ágar-NGM de 35 mm. Secar durante a noite em RT (temperatura ambiente, 21 °C).
- Preparar 0,5 M VL-850 em DMSO e diluir para 10 mM VL-850 usando tampão M9 (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, pH 7e 1 mM MgSO 4)26. Confirme se o pH é 7,0 (caso contrário, titular com HCl 0,1 M) e filtre e esterilize a solução com um filtro de seringa de 0,22 μm. Prepare o veículo como descrito acima, mas sem a droga (neste caso, VL-850). Fazer FCCP 50 mM em DMSO, diluir para FCCP 1 mM com tampão M9 e filtrar-esterilizar a solução com um filtro de seringa de 0,22 μm.
- Adicionar 25 μL de veículo (controle negativo), FCCP (controle positivo; 5 μM) ou VL-850 (tratamento experimental; 62,5 μM) às placas NGM semeadas separadamente no gramado bacteriano.
- Cubra as placas com papel alumínio e deixe-as secar em RT (temperatura ambiente, 21 °C). Use as placas após ~16 h.
- Obtenção sincronizada de adultos jovens hermafroditas de C. elegans
- Faça 1 L de tampão M9 com 22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO4 e 86 mM NaCl. Esterilizar em autoclave e deixar esfriar. Uma vez resfriado, adicionar 1 mL de 1 mM de MgSO4 (0,22 μm esterilizado por filtro).
- Misturar 0,8 ml de hidróxido de sódio a 2,5 N e 1 ml de uma solução a 5% de hipoclorito de sódio com 2,2 ml de DDW para criar 4 ml de solução alcalina de hipoclorito (concentração final de 0,5 N para hidróxido de sódio e 1,25% para hipoclorito de sódio).
- Coletar os vermes (hermafroditas gravídicos) em um tubo cônico de 15 mL lavando as placas de NGM com 1 mL de tampão M9 3x para garantir que todas as mães tenham sido coletadas no tubo.
- Sedimentar os vermes por centrifugação a 500 × g por 1 min e descartar o sobrenadante até restar um volume de 1 mL.
- Adicionar 1 mL de solução alcalina de hipoclorito e misturar invertendo o tubo 5x. Vórtice suavemente o tubo por 3 minutos para auxiliar a liberação de ovos e observe o estado dos vermes sob um estereoscópio dissecante.
- Quando aproximadamente 50% dos vermes estiverem quebrados, adicionar 5 mL de tampão M9 e sedimentar imediatamente os ovos centrifugando por 1 min a 500 × g.
- Retire o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o pellet. Adicionar 5 mL de tampão M9 e repetir o procedimento de lavagem 2x.
- Remova o sobrenadante até restar 2 mL e gire o tubo (rotação de 360°) a 20 rpm por ~16 h (TR, 21 °C) para obter larvas L1 sincronizadas. A partir deste tubo, pegue uma gota de 5 μL em uma lâmina de vidro, conte o número de larvas sob um estereoscópio, repita este passo 3x, faça uma média das três contagens e estime o número de vermes por microlitro (μL). Com base nesses cálculos, adicione ~200 larvas por placa NGM semeada com bactérias OP50.
- Cultivar as larvas L1 a 21 °C por ~48 h até a fase adulta jovem.
- Tratamento medicamentoso e procedimento microscópico
- Coloque 100 vermes em cada uma das placas experimentais ou de controle. Certifique-se de que as placas negativas, positivas e experimentais contenham o veículo, 5 μM FCCP e 62,5 μM VL-850, respectivamente. Incubar a 21 °C durante 6 h.
- Use 1 mL de tampão M9 para lavar os vermes de cada placa em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Gire o tubo brevemente (~3 s) em uma minicentrífuga. Em seguida, descarte o sobrenadante pipetando o tampão M9 suavemente sem perturbar a pelota de verme. Repita este passo de lavagem 2x e, em seguida, remova suavemente o sobrenadante sem perturbar a pastilha de minhoca.
- Adicionar 200 μL de tampão M9, que contém 0,1% v/v Poloxamer 188, 0,1% v/v Pluronic F127 e 2 μL do reagente do kit de coloração, à pastilha de minhoca. Deixe a mistura girar a 20 rpm (rotação de 360°) por 1 h em RT (temperatura ambiente, 21 °C). Para proteger os corantes da luz, cubra os tubos com papel alumínio.
- Gire os vermes suavemente, conforme descrito na etapa 1.3.4. Em seguida, remova a solução de coloração sem perturbar a pastilha de verme. Em seguida, lave as minhocas conforme descrito na etapa 1.3.2 e transfira-as para uma placa de ágar-NGM semeada contendo o tratamento adequado - por exemplo, as minhocas tratadas com FCCP são transferidas para uma placa contendo FCCP. Cubra as placas com papel alumínio porque o reagente de coloração é sensível à luz.
OBS: Transferimos os vermes para placas de cultura contendo bactérias e o agente de tratamento correspondente para minimizar o ruído de fundo devido ao excesso de corante. Por exemplo, vermes tratados com FCCP foram transferidos para placas suplementadas com FCCP, e assim por diante. - Lave as minhocas das placas em tubos de microcentrífuga frescos usando 1 mL de tampão M9; Lave as minhocas da mesma maneira 2x. Em seguida, fixar os vermes com formol a 1% no gelo por 30 min e lavar os vermes com 1 mL de tampão M9 3x para remover o formaldeído residual. Após as lavagens, gire os vermes até um pellet e aspirar a quantidade máxima de sobrenadante, mantendo o pellet de verme intacto em 10 μL de M9.
- Para preparar a agarose a 2,5%, pesar 0,125 g de agarose num tubo de ensaio de vidro borossilicato de 10 ml, adicionar 5 ml de tampão M9 e dissolver a agarose aquecendo suavemente o tubo com um queimador de Bunsen. Transfira a agarose derretida para um banho seco regulado a 75 °C e, com uma ponta de 1 mL, coloque 100 μL da agarose derretida em um vidro de cobertura do microscópio Deckgläser (24 mm x 60 mm). Imediatamente, coloque outra lâmina perpendicularmente sobre a gota de agarose, formando uma forma de cruz. Aguarde ~2 min, e separe suavemente as lâminas empurrando (suavemente) o vidro da tampa superior, deixando assim a almofada de agarose na tampa inferior.
NOTA: Tenha cuidado ao aquecer a agarose no tubo e certifique-se de que o tubo é mantido longe do corpo. Cortar a borda da ponta de 1 mL para minimizar a coagulação da agarose. - Transfira os vermes para a almofada de agarose com uma pipeta de vidro Pasteur (ou seja, toda a quantidade no tubo, ~10 μL). Retire o excesso de líquido com um pavio feito de um lenço de laboratório e, em seguida, cubra as minhocas com uma lâmina de cobertura menor (24 mm x 40 mm). Aplique esmalte transparente na periferia da lâmina de cobertura menor para evitar a evaporação. Coloque o slide em uma caixa escura para protegê-lo da luz.
- Use um microscópio confocal para obter imagens dos vermes dentro de 24 h nos comprimentos de onda apropriados (veja abaixo) usando uma lente de aumento de 60x.
- Coloque a lâmina no palco do microscópio.
- Abra o software de imagem e clique com o botão direito do mouse na área cinza do software. Aquisição Aberta | Almofada Completa Ti2 | Aquisição ND | LUTs clicando nas opções no pop-up que surge como resultado do clique direito.
- Em Ti2 Full Pad, selecione 60x.
- Em Aquisição, selecione Ocular DIA e coloque os vermes em foco usando o botão de foco fino do microscópio. Em Aquisição, selecione Disco giratório e escolha a opção 16 bits - Sem binning. Para cada filtro de fluorescência, defina o Tempo de exposição para 500 ms e 20 ms para Brightfield. Depois que esses parâmetros estiverem definidos, selecione Executar agora e aguarde até que a imagem de saída seja gerada como um arquivo ND2.
NOTA: O tempo de exposição precisa ser determinado experimentalmente, pois diferentes configurações de imagem têm características diferentes. Use tabelas de pesquisa (LUTs) para examinar a intensidade de fluorescência para cada comprimento de onda.
- Análise das imagens
- Abra as imagens confocais (aqui, arquivos Nikon ND2) no ImageJ27 com o plugin de colocalização. Cada arquivo ND contém planos de imagem obtidos em três comprimentos de onda (usando filtros DAPI, GFP/FITC [verde] e Texas Red [vermelho]) e luz visível. Para acessar essas imagens, abra o arquivo ND no servidor ImageJ e selecione Dividir imagens na caixa de diálogo. Trabalhe com imagens de campo brilhante (BF), canal verde e canal vermelho.
- Gere duplicatas dessas imagens para manter a imagem original intocada clicando em Imagem | Duplique ou use o atalho de teclado Shift + D.
- Para reduzir o plano de fundo, gere outra duplicata da imagem, como mencionado acima. Subtraia o plano de fundo com um raio de rolagem de 100 e selecione a opção Criar plano de fundo (não subtrair) para gerar uma imagem com o plano de fundo da imagem fornecida. Em seguida, vá para Processo | Calculadora de Imagem e subtraia a primeira imagem duplicada da segunda imagem duplicada. Use as imagens resultantes para a análise de colocalização.
- Para usar o plugin de colocalização, converta as imagens do canal verde e vermelho em 8 bits. Para isso, clique em Imagem | Tipo | 8 bits.
- Clique em Plugins | Colocalização. Para medir a colocalização de mitocôndrias e sinais lisossômicos usando o plugin de colocalização (veja acima), use os seguintes parâmetros: Razão = 75%, Canal vermelho limiar = 80,0, Canal verde limiar = 50,0. A saída é uma imagem binária de 8 bits contendo puncta colocalizado e uma combinação das três imagens de 8 bits (verde, vermelho e a imagem colocalizada) em uma imagem RGB.
- Concentre-se na puncta no músculo da parede do corpo da cabeça dos vermes selecionando manualmente esta área e criando uma máscara clicando em Editar | Seleção | Create Mask, que seleciona a região de interesse (Figura 2A, B). Remova seletivamente outras entidades coradas (por exemplo, os músculos faríngeos) para analisar a região muscular da parede do corpo da cabeça.
- Para selecionar as partículas na região de interesse (ROI), selecione as imagens de 8 bits e máscara colocalizadas usando a calculadora de imagens. Em seguida, use a operação AND (Figura 3A) para selecionar o ponto na ROI. Isso gera uma imagem com pontos na ROI (Figura 3B).
- Para analisar a área das mitocôndrias e lisossomos colocalizados, selecione Analisar | Analise as partículas e meça a soma dos pontos entre 0,1625 μm 2 e 4 μm2.
2. O protocolo de células cancerosas Hep-3B
- Preparando a solução estoque de medicamentos
- Preparar 100 mM VL-850 em DMSO. Diluir a 5 mM com tampão HEPES 0,5 M, pH 7,3, e esterilizar a solução com filtro de seringa de 0,22 μm. Em seguida, prepare o veículo como descrito anteriormente, mas sem a droga (neste caso, VL-850).
- Cultura de células Hep-3B para experimento, tratamento medicamentoso e procedimento de microscopia
- Cultivar células Hep-3B em placas de cultura de tecidos de 10 cm contendo o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor, 2% de L-glutamina e 1% de tetraciclina (doravante denominada DMEM completo). Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2.
- Escolha uma placa de células Hep-3B que exiba 70%-80% de confluência celular (fase logarítmica de crescimento), remova o meio e lave a placa com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-aquecida. Remover o PBS e incubar as células com 1 mL de tripsina 0,25% pré-aquecida/EDTA 0,02% por ~3 min a 37 °C; observar as células ao microscópio de cultura de tecidos (10x). Pare a digestão de tripsina quando as células se tornam redondas e comece a dissociar-se da placa adicionando 5 mL de DMEM completo. Centrifugar as células a 1.000 × g por 5 min, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de DMEM completo.
- Determine a concentração celular. Misturar 50 μL da suspensão celular com 50 μL de azul de tripano. Conte as células usando um contador de células automatizado ou usando um hemocitômetro 5x, e faça uma média dessas contagens para garantir a precisão das contagens.
- Semeando 42.000 células Hep3G em cada lâmina de μ de 8 poços em 400 μL de DMEM completo (conforme descrito acima). Incubar as células durante 24 h a 37 °C e 5% CO2.
- Após 24 h com ~80%-85% de confluência, remova 250 μL de meio de cada um dos poços e adicione 50 μL de meio com o tratamento ou veículo apropriado. Para seguir este protocolo, tratar as células com 100 μM VL-850, 5 μM FCCP e um veículo como controle.
- Após 6 h de incubação com os compostos, adicionar 50 μL de meio a cada poço contendo o reagente corante (0,5 μL de corante para 250 μL em cada poço). Incubar as células com o corante durante 30 min a 37 °C e 5% de CO2.
NOTA: Como o reagente de coloração é sensível à luz, minimize a exposição à luz cobrindo as amostras com papel alumínio e trabalhando em um ambiente de pouca luz (se possível). - Usando uma pipeta de 200 μL, remova suavemente todo o meio (250 μL) de cada poço e, em seguida, lave as células com 200 μL de PBS pré-aquecido.
- Fixar as células com 200 μL de solução fixadora contendo formaldeído a 4% e glutaraldeído a 2,5% preparada em PBS por 15 min em TR.
- Decantar a solução fixadora e lavar brevemente com 200 μL de PBS.
- Adicionar 200 μL de PBS, manter as células cobertas e protegidas da luz a 4 °C e imagem dentro de 24 h.
OBS: Utilizamos o microscópio confocal de disco giratório em quatro canais, incluindo DIC, TRITC, FITC e DAPI, conforme passo 1.4.8. Obtivemos imagens de ~300 células por tratamento.
- Análise das imagens
- Execute as etapas 1.5.1-1.5.5. Para obter a ROI das células, gere uma imagem que destaque a área das células. Para isso, escolha uma imagem de pontos colocalizados (RGB) (Figura 4A). Para selecionar toda a área da célula, selecione Processo | Binário | Crie Mask para obter uma imagem binária (Figura 4B). Para analisar a área da célula, selecione Analisar | Analise partículas e meça todas as partículas na imagem de 0 ao infinito, que é a configuração padrão para Analisar partículas.
- Para analisar a área das mitocôndrias e lisossomos colocalizados, selecione uma imagem colocalizada de 8 bits, converta-a em binária selecionando Processo | Binário | Tornar binário, selecione Analisar | Analise as partículas e meça a soma dos pontos entre 0,1625 μm 2 e 4 μm2. Para medir os pontos colocalizados, divida a área das mitocôndrias e lisossomos colocalizados pela área celular total.
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Representative Results
Indução de uma resposta robusta de mitofagia em vermes C. elegans e células Hep-3B com VL-850
O VL-850 protege vermes C. elegans e queratinócitos humanos (células HaCaT) do estresse oxidativo23. Para explorar melhor seu mecanismo de ação, examinamos se o VL-850 induz mitofagia em C. elegans e outras células humanas. Para testar isso, expomos vermes C. elegans (adultos jovens, 3 dias pós-L1) a 62,5 μM VL-850, 5 μM FCCP (controle positivo) e veículo (controle negativo) por 6 h. Como descrito acima, medimos a mitofagia usando o reagente de coloração. Optou-se por utilizar a concentração de 62,5 μM para VL-850 por proteger os vermes do estresse oxidativo e prolongar significativamente sua vida útil23. A VL-850 induziu mitofagia robusta nos músculos da parede do corpo da cabeça dos vermes (Figura 5), indicando que é um potente indutor de mitofagia. Vale ressaltar que a potência mitofágica da VL850 foi semelhante à da FCCP (Figura 5).
Além disso, realizamos um experimento semelhante com células Hep-3B; essa linhagem celular originou-se de um homem negro de 8 anos de idade com carcinoma hepatocelular primário (CHC)28. Semelhante ao experimento de C. elegans , as células foram expostas a 100 μM de VL-850, 5 μM de FCCP (controle positivo) e veículo (controle negativo) por 6 h e usamos o reagente de coloração para quantificar a mitofagia. VL-850 e FCCP induziram mitofagia significativa (em extensão semelhante) nas células Hep-3B (Figura 6), apoiando ainda mais nossa hipótese de que VL-850 é um potente indutor de mitofagia tanto em C. elegans quanto em células humanas.
Figura 1: Medição da mitofagia em células de C. elegans e Hep-3B. Desenho esquemático ilustrando o uso do kit de coloração para medir a mitofagia em vermes C. elegans e células de câncer de fígado. Abreviações: VL-850 = O,O (octano-1,8-diil)bis(hidroxilamina); FCCP = cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona; PBS = solução salina tamponada com fosfato; NGM = meio de crescimento do nematoide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Seleção da região muscular cabeça-parede de interesse em C. elegans. (A) A região de interesse é selecionada manualmente e uma máscara é gerada. (B) A imagem da máscara resultante exibe a principal região de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação dos pontos colocalizados em uma região de interesse em C. elegans. (A) Para selecionar o ponto na região de interesse, a operação "E" deve ser selecionada. (B) A imagem resultante exibe o ponto na região de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Selecionando células em uma região de interesse . (A) Uma imagem de pontos colocalizados (RGB) é gerada após a função de colocalização. (B) Imagem de máscara que representa toda a área celular em que os pontos devem ser estudados. Abreviação: RGB = vermelho, verde e azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Indução de mitofagia robusta em C. elegans pelo VL-850. (A) As pontas de seta retratam a colocalização de mitocôndrias e lisossomos como exemplo de colocalização representativa. O inset, que tem um aumento de oito vezes, é fornecido para melhor visualização. Barras de escala = 100 μm. (B) A colocalização foi quantificada com três repetições biológicas e 30 vermes por tratamento. A significância dos resultados foi determinada comparando-os com os controles do veículo, e os asteriscos indicam significância estatística. A análise estatística foi realizada por meio de ANOVA one-way não pareada (testes ANOVA de Brown-Forsythe e Welch com correção de Welch), sendo considerado estatisticamente significante um valor de p menor que 0,0001 (****p < 0,0001). Abreviatura: FCCP = cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: VL-850 induz mitofagia significativa em células Hep-3B. (A) As pontas das setas mostram a colocalização de mitocôndrias e lisossomos para representar a colocalização, e um inset é incluído para demonstrar a colocalização em oito vezes de aumento. Barras de escala = 25 μm. (B) A colocalização foi quantificada com três repetições biológicas e N ≥ 411 células por tratamento (411 estão dentro da faixa que permite significância estatística e confiança nos resultados). Diferenças estatisticamente significantes foram avaliadas em comparação com os controles do veículo, e os asteriscos indicam significância. Os dados foram analisados por meio de ANOVA one-way não pareada (testes ANOVA de Brown-Forsythe e Welch com correção de Welch), sendo considerado estatisticamente significante um valor de p menor que 0,0001 (****p < 0,0001). Abreviatura: FCCP = cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Múltiplas vias de mitofagia envolvem várias proteínas e biomoléculas (por exemplo, cardiolipina29). Entretanto, o desfecho dessas vias é semelhante, a degradação das mitocôndrias por enzimas lisossômicas12,13. De fato, vários métodos utilizam esse desfecho para quantificar a mitofagia. No entanto, alguns métodos, como a microscopia eletrônica, exigem acesso a equipamentos caros, especialistas treinados e um tempo de preparação prolongado para os espécimes e análises. Além disso, apesar das vantagens do uso de biossensores mitofágicos, que incluem a medida da mitofagia em tecidos/células/compartimentos subcelulares específicos, a expressão desses sensores pode alterar a fisiologia dacélula21. Portanto, há necessidade de um método confiável, econômico e rápido para quantificar a mitofagia sem a necessidade de interferência a longo prazo com a fisiologia celular normal.
Aqui, descrevemos tal método, que envolve o uso de uma mistura comercial acessível de coquetel mitocôndria/lisossomo/corante nuclear. Recentemente demonstramos sua utilidade na mensuração da mitofagia em C. elegans e imortalizou queratinócitos humanos (células HaCaT)23. Os resultados do kit de coloração foram validados com dois biossensores, incluindo mito-Rosella (em C. elegans) e cox8-mCherry-EGFP (em células humanas de neuroblastoma SH-SY5Y), bem como experimentos de qPCR que quantificaram a relação entre o conteúdo de DNA mitocondrial e nuclear e a expressão de vários genes de mitofagia/autofagia23.
Neste estudo, expandimos nossa pesquisa para explorar a potência ativadora da mitofagia do VL-850 em vermes C. elegans e células Hep-3B de adenocarcinoma hepático humano. Os resultados mostram que o VL-850 é um potente indutor de mitofagia (Figura 5 e Figura 6). Esses resultados apoiam ainda mais as observações anteriores de que o VL-850 protege C. elegans do estresse oxidativo e prolonga sua vida útil, além de induzir mitofagia em células HaCat23.
Apesar da utilidade do kit de coloração, ele apresenta algumas limitações em relação aos estudos com C. elegans. Primeiro, pelo menos nas condições estudadas, não observamos coloração de dendritos e axônios. Portanto, o protocolo atual não é útil para medir mitofagia nessas entidades neuronais. Em segundo lugar, a autofluorescência intestinal pode interferir com o sinal de fluorescência verde do corante mitocondrial. Portanto, deve-se ter cuidado ao aplicar este método para medições de mitofagia no intestino. Finalmente, e especialmente no contexto de linhagens celulares humanas/roedoras, o corante lisossomo pode manchar entidades ácidas dentro do núcleo. Portanto, recomenda-se titular empiricamente a concentração do reagente de coloração/tempo de incubação para cada linhagem/composição do meio.
Além disso, como sugerido acima, nenhum método único é suficiente para demonstrar mitofagia. Assim, recomendamos a validação dos resultados dos reagentes de coloração usando métodos alternativos (por exemplo, biossensores de mitofagia, qPCR, imunomarcação) e sempre incluir um controle positivo da mitofagia (por exemplo, FCCP). Em conclusão, o coquetel de corantes reagentes fornece um método confiável e econômico para quantificar mitofagia em células de C. elegans e humanas. Dada a diferença significativa entre células humanas e células de C. elegans , prevemos que este método poderia ser facilmente adaptado a outros sistemas animais.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do laboratório Gross pela leitura crítica do manuscrito e seus comentários e conselhos. Agradecemos ao Caenorhabditis Genetics Center (CGC), que é financiado pelo National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), por fornecer algumas das cepas. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Vitalunga Ltd e da Israel Science Foundation (processo nº 989/19). A figura do resumo gráfico (Figura 1) foi gerada com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
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