Artículo de método

Modelo de paro cardíaco en ratón para la obtención de imágenes cerebrales y la monitorización de la fisiología cerebral durante la isquemia y la reanimación

DOI:

10.3791/65340

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14 de abril de 2023

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1Multidisciplinary Brain Protection Program, Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Anesthesiology and Pain Management, UT Southwestern University Medical Center

En este artículo

Resumen

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Este protocolo demuestra un modelo único de ratón de paro cardíaco por asfixia que no requiere compresión torácica para la reanimación. Este modelo es útil para monitorizar y obtener imágenes de la dinámica de la fisiología cerebral durante el paro cardíaco y la reanimación.

Resumen

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La mayoría de los sobrevivientes de paro cardíaco (AC) experimentan diversos grados de déficits neurológicos. Para comprender los mecanismos que sustentan la lesión cerebral inducida por AC y, posteriormente, desarrollar tratamientos efectivos, la investigación experimental de AC es esencial. Con este fin, se han establecido algunos modelos de CA de ratón. En la mayoría de estos modelos, los ratones se colocan en decúbito supino para realizar la compresión torácica para la reanimación cardiopulmonar (RCP). Sin embargo, este procedimiento de reanimación dificulta la obtención de imágenes/monitorización en tiempo real de la fisiología cerebral durante la AC y la reanimación. Para obtener este conocimiento crítico, el presente protocolo presenta un modelo de AC de asfixia en ratón que no requiere el paso de RCP por compresión torácica. Este modelo permite el estudio de los cambios dinámicos en el flujo sanguíneo, la estructura vascular, los potenciales eléctricos y el oxígeno del tejido cerebral desde la línea de base pre-AC hasta la reperfusión post-CA temprana. Es importante destacar que este modelo se aplica a ratones envejecidos. Por lo tanto, se espera que este modelo de AC de ratón sea una herramienta crítica para descifrar el impacto de la AC en la fisiología cerebral.

Introducción

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El paro cardíaco (AC) sigue siendo una crisis de salud pública mundial1. Más de 356,000 casos de AC fuera del hospital y 290,000 en el hospital se reportan anualmente solo en los EE. UU., y la mayoría de las víctimas de CA tienen más de 60 años. Cabe destacar que las alteraciones neurológicas post-AC son comunes entre los sobrevivientes, y representan un desafío importante para el manejo de la AC 2,3,4,5. Para comprender los cambios patológicos cerebrales post-AC y sus efectos en los resultados neurológicos, se han aplicado diversas técnicas de monitorización neurofisiológica y de tejido cerebral en pacientes 6,7,8,9,10,11,12. Utilizando espectroscopía de infrarrojo cercano, también se ha realizado un monitoreo cerebral en tiempo real en ratas CA para predecir resultados neurológicos13.

Sin embargo, en los modelos murinos de AC, este enfoque de imagen se ha complicado por la necesidad de compresiones torácicas para restaurar la circulación espontánea, lo que siempre implica un movimiento físico sustancial y, por lo tanto, dificulta los delicados procedimientos de imagen. Además, los modelos de AC se realizan normalmente con ratones en posición supina, mientras que los ratones deben girarse a la posición prona para muchas modalidades de imágenes cerebrales. Por lo tanto, en muchos casos se requiere un modelo de ratón con un movimiento corporal mínimo durante la cirugía para realizar imágenes/monitoreo en tiempo real del cerebro durante todo el procedimiento de AC, que abarca desde antes de la AC hasta después de la reanimación.

Anteriormente, Zhang et al. informaron de un modelo de CA de ratón que podría ser útil para la obtención de imágenescerebrales 14. En su modelo, la AC fue inducida por inyecciones en bolo de vecuronio y esmolol seguidas del cese de la ventilación mecánica. Demostraron que después de 5 min de AC, la reanimación se podía lograr mediante la infusión de una mezcla de reanimación. Sin embargo, cabe destacar que el paro circulatorio en su modelo se produjo sólo unos 10 segundos después de la inyección de esmolol. Por lo tanto, este modelo no recapitula la progresión de la AC inducida por asfixia en los pacientes, incluida la hipercapnia y la hipoxia tisular durante el período previo a la detención.

El objetivo general del procedimiento quirúrgico actual es modelar la asfixia clínica de la AC en ratones, seguida de la reanimación sin compresiones torácicas. Este modelo de AC, por lo tanto, permite el uso de técnicas de imagen complejas para estudiar la fisiología cerebral en ratones15.

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Protocolo

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Todos los procedimientos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el cuidado y uso de animales en investigación, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Duke (IACUC). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6 de 8-10 semanas de edad.

1. Preparación quirúrgica

  1. Pese un mouse en una báscula digital y colóquelo en una caja de inducción de anestesia de plexiglás de 4 pulgadas x 4 pulgadas x 7 pulgadas.
  2. Ajuste el vaporizador de anestesia a 5% de isoflurano, el medidor de flujo de oxígeno a 30 y el medidor de flujo de nitrógeno a 70 (consulte la Tabla de materiales).
  3. Saque al animal de la caja de inducción y colóquelo en posición supina en el banco quirúrgico cuando su frecuencia respiratoria haya disminuido a 30-40 respiraciones por minuto.
  4. Saca la lengua con unas pinzas romas y sujétala con la mano no dominante. Use la mano dominante para insertar un laringoscopio (ver Tabla de materiales) en la boca del ratón y visualice la cuerda vocal.
  5. Use la mano no dominante para insertar un alambre guía y un catéter intravenoso de 20 G en la boca. Inserte suavemente el alambre guía en la tráquea.
  6. Empuje el catéter dentro de la tráquea hasta que la parte del ala del catéter esté nivelada con la punta de la nariz.
    NOTA: No intuble a un ratón que no esté completamente anestesiado, ya que esto puede lesionar la tráquea y causar sangrado en las vías respiratorias.
  7. Conecte el ratón intubado a un ventilador para animales pequeños (ver Tabla de materiales) y reduzca el isoflurano al 1,5%.
  8. Introduzca el peso corporal del ratón en el panel de control del ventilador para determinar el volumen corriente y la frecuencia respiratoria.
  9. Mantenga el ratón en posición supina bajo una lámpara de calor y mantenga la temperatura rectal a 37 °C con un controlador de temperatura.
  10. Afeitar las áreas inguinales, desinfectar el área quirúrgica al menos tres veces con yodo y alcohol (ver Tabla de materiales) y cubrir el área con un paño quirúrgico estéril.
  11. Aplique ungüento ocular en ambos ojos y administre 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea antes de la cirugía.
  12. Abra el paquete de instrumentos estériles para la cirugía. Realice una incisión en la piel de 1 cm con unas tijeras quirúrgicas para acceder a las arterias femorales de ambos lados. Diseccionar y ligar la arteria femoral distal con una sola hebra de sutura de seda 4-0 (ver Tabla de materiales), y aplicar una gota de lidocaína.
  13. Aplique una pinza para aneurisma en la arteria femoral proximal y haga una pequeña incisión en la arteria distal a la pinza. Inserte un catéter de polietileno 10 (PE-10, ver Tabla de materiales) en las arterias femorales izquierda y derecha.
    NOTA: La línea arterial izquierda se utiliza para la monitorización de la presión arterial, mientras que la derecha se utiliza para la extracción de sangre y la infusión de mezcla de reanimación.
  14. Inyecte 50 μL de solución salina heparinizada 1:10 en cada vía arterial para evitar la formación de coágulos en la vía.
  15. Gire el ratón a la posición prona y móntelo en un marco de cabeza estereotáxico.
  16. Conecte tres electrodos de aguja (rojo, verde y negro) al brazo izquierdo, la pierna izquierda y el brazo derecho para el monitoreo del electrocardiograma (ECG, consulte la Tabla de materiales).
  17. Pegue una sonda de fibra plástica flexible en el cráneo temporal intacto a través de una incisión en la piel de 0,5 cm para controlar el flujo sanguíneo cerebral. Este paso es opcional.
  18. Afeitar la parte superior de la cabeza, desinfectar el área quirúrgica al menos tres veces con yodo y alcohol, y cubrir el área con un paño quirúrgico estéril.
  19. Realice una incisión en la línea media de la piel de 2,5 cm y use cuatro retractores pequeños para exponer toda la superficie del cráneo para obtener imágenes cerebrales.
  20. Coloque un generador de imágenes de monitoreo (p. ej., un generador de imágenes de contraste de manchas láser, consulte la Tabla de materiales) sobre la cabeza.
    NOTA: Se pueden agregar unas gotas de solución salina a la superficie del cráneo para facilitar la obtención de imágenes de contraste con manchas láser.

2. Inducción de paro cardíaco

  1. Llene una jeringa de plástico de 1 ml con 26 μl de la solución madre del cóctel de reanimación.
    NOTA: Cada mililitro de esta solución contiene 400 μL de 1 mg/mL de epinefrina, 500 μL de bicarbonato de sodio al 8,4%, 50 μL de heparina de 1.000 U/mL y 50 μL de cloruro de sodio al 0,9% (ver Tabla de materiales).
  2. Espere hasta que la temperatura corporal alcance los 37 °C. Ajuste el medidor de oxígeno al 100% para oxigenar la sangre durante 2 min.
  3. Extraer la sangre arterial oxigenada hasta 200 μL a través de la arteria femoral derecha en la jeringa de plástico preparada que contiene 26 μL de solución madre de cóctel de reanimación.
  4. Apague el oxígeno y aumente el nitrógeno al 100% para inducir la anoxia.
    NOTA: Después de aproximadamente 45 s, el corazón dejará de funcionar y la frecuencia cardíaca disminuirá rápidamente, lo que indica el inicio de la AC. Después de aproximadamente 2 minutos de privación de oxígeno, el monitoreo del ECG indicará una asistolia, y no habrá presión arterial sistémica medible y un flujo sanguíneo cerebral insignificante.
  5. Apague el ventilador, el vaporizador de isoflurano, el controlador de temperatura y el medidor de flujo de nitrógeno. Ajuste el oxígeno al 100% en preparación para la reanimación.

3. Procedimiento de reanimación

  1. Encienda el ventilador a los 8 minutos después del inicio de la AC.
  2. Comience inmediatamente a infundir la sangre oxigenada extraída mezclada con el cóctel de reanimación en la circulación sanguínea a través de la arteria femoral derecha en 1 min.
    NOTA: La infusión conduce a un aumento gradual de la frecuencia cardíaca y al restablecimiento de la perfusión sanguínea; finalmente, se logra el retorno de la circulación espontánea (ROSC).

4. Recuperación posterior a la CA

  1. Coloque el ratón en posición supina después de retirarlo del marco estereotáxico y retire los catéteres PE-10 de las arterias femorales.
  2. Aplique bupivacaína al 0,25% en la incisión cutánea y sure las incisiones cutáneas con una sutura de nailon 6-0 (consulte la tabla de materiales). Aplique un ungüento antibiótico en la superficie de la incisión en la piel.
  3. Desconecte el ventilador del ratón cuando se restablezca la respiración espontánea.
  4. Transfiera el ratón a una cámara de recuperación con una temperatura controlada de 32 °C.
  5. Después de 2 h de recuperación, extubar al ratón y devolverlo a la jaula de origen. Inyecte 0,5 ml de solución salina normal por vía subcutánea para prevenir la deshidratación.

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Resultados

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Para inducir la AC, el ratón fue anestesiado con isoflurano al 1,5% y ventilado con nitrógeno al 100%. Esta afección condujo a una bradicardia severa en 45 s (Figura 1). Después de 2 minutos de anoxia, la frecuencia cardíaca se redujo drásticamente (Figura 2), la presión arterial disminuyó por debajo de 20 mmHg y el flujo sanguíneo cerebral cesó por completo (Figura 1). A medida que se apagaba el isoflurano, la temperatura corporal ...

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Discusión

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En estudios experimentales de AC, se ha utilizado asfixia, inyecciones de cloruro de potasio o fibrilación ventricular derivada de corriente eléctrica para inducir AC 16,17,18,19,20,21,22,23. Normalmente, se requiere RCP para la reanimación en estos modelos...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a Kathy Gage por su apoyo editorial. Este estudio contó con el apoyo de fondos del Departamento de Anestesiología (Centro Médico de la Universidad de Duke), una subvención de la American Heart Association (18CSA34080277) y subvenciones de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) (NS099590, HL157354, NS117973 y NS127163).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AdrenalinaPar PharmaceuticalNDC 42023-159-01
Hisopos con alcoholBD326895
Animal Bio AmpADInstrumentosFE232
Transductor BPADInstrumentosMLT0699
Bridge AmpADInstrumentosFE117
Inyección de heparina sódica, USPFresenius KabiNDC 63323-540-05
IsofluranoCovetrusNDC 11695-6777-2
Monitor de perfusión DopplerMoor InstrumentsmoorVMS-LDF1
Sistema de imagen por moteado láserRWDRFLSI III
Pomada lubricante para los ojosBausch + Lomb339081
Micro clipRobozRS-5431
Sonda rectal de ratónPhysitempRET-3
Electrodo de agujaADInstrumentosMLA121329 Ga, casquillo de 1,5 mm
NitrógenoAirgasUN1066
Fibra óptica de plásticoMoor InstrumentsPOF500
OtoscopioWelchallyn7282,5 mm Espéculo
OxígenoAirgasUN1072
Tubo de PE-10BD427401Tubo de polietileno
Povidona yodadaCVS955338
PowerLab 8/35ADInstrumentos
Rimadyl (carprofeno)Zoetis6100701Inyectable 50 mg/ml
Ventilador para animales pequeñosKent ScientificRoVent Jr.
Controlador de temperaturaPhysitempTCAT-2DF
Triple antibiorico y analgésicoCVSNDC 59770-823-56
VaporizadorRWDR583S
0.25% bupivacaínaHospiraNDC 0409-1159-18
Criruro de sodio 0.9%UCI MedicalNDC 0990-7983-03
1 mL plástico jeringaBD309659
4-0 sutura de sedaLookSP116Seda trenzada negra
6-0 sutura de nylonEthilon1698G
8,4% bicarbonato de sodio Inj., USPHospiraNDC 0409-6625-02
20 G catéter intravenosoBD38153420GA 1,6 PULGADAS
30 G Aguja PrecisionGlideBD30510630 G X 1/2
láser

Referencias

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