Este protocolo demuestra un modelo único de brazada de ratón con un infarto de tamaño medio y una excelente tasa de supervivencia. Este modelo permite a los investigadores preclínicos de accidentes cerebrovasculares extender la duración de la isquemia, utilizar ratones de edad avanzada y evaluar los resultados funcionales a largo plazo.
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Artículo de método
Un modelo de oclusión transcraneal modificado de la arteria cerebral media para estudiar los resultados del accidente cerebrovascular en ratones ancianos
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Resumen
Resumen
En la investigación experimental del ictus, la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) con un filamento intraluminal se utiliza ampliamente para modelar el ictus isquémico en ratones. El modelo de filamento MCAO suele exhibir un infarto cerebral masivo en ratones C57Bl/6 que a veces incluye tejido cerebral en el territorio irrigado por la arteria cerebral posterior, lo que se debe en gran medida a una alta incidencia de atresia de la arteria comunicante posterior. Este fenómeno se considera uno de los principales contribuyentes a la alta tasa de mortalidad observada en ratones C57Bl/6 durante la recuperación a largo plazo del accidente cerebrovascular después del filamento MCAO. Por lo tanto, muchos estudios sobre accidentes cerebrovasculares crónicos explotan modelos distales de MCAO. Sin embargo, estos modelos suelen producir infarto solo en el área de la corteza y, en consecuencia, la evaluación de los déficits neurológicos posteriores al accidente cerebrovascular podría ser un desafío. Este estudio ha establecido un modelo transcraneal modificado en el que el ACM en el tronco se ocluye parcialmente, ya sea de forma permanente o transitoria a través de una pequeña ventana craneal. Dado que la localización de la oclusión es relativamente proximal al origen de la ACM, este modelo genera daño cerebral tanto en la corteza como en el cuerpo estriado. La caracterización exhaustiva de este modelo ha demostrado una excelente tasa de supervivencia a largo plazo, incluso en ratones envejecidos, así como déficits neurológicos fácilmente detectables. Por lo tanto, el modelo de ratón MCAO descrito aquí representa una herramienta valiosa para la investigación experimental del ictus.
Introducción
Casi 800,000 personas sufren un accidente cerebrovascular en los EE. UU. cada año, y la mayoría de estos accidentes cerebrovasculares sonde naturaleza isquémica. El restablecimiento oportuno del flujo sanguíneo cerebral con un activador tisular del plasminógeno (tPA) y/o una trombectomía es actualmente el tratamiento más eficaz para los pacientes con ictus; sin embargo, la recuperación completa de las funciones neurológicas a largo plazo es rara 2,3. Por lo tanto, la búsqueda de nuevas terapias para el ictus que se dirijan a la mejora funcional es un área de investigación intensa que requiere modelos animales de ictus clínicamente relevantes.
El modelo de accidente cerebrovascular isquémico más común en roedores utiliza la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media (MCAO) para inducir el accidente cerebrovascular. En este modelo, desarrollado inicialmente por Zea Longa en 1989, se introduce un filamento de nylon en la arteria carótida interna (ACI) para bloquear el flujo sanguíneo a la arteria cerebral media (ACM)4. Sin embargo, este modelo tiene limitaciones. En primer lugar, cuando el filamento se inserta en la ICA, el flujo sanguíneo a la arteria cerebral posterior (PCA) también podría bloquearse parcialmente, especialmente en ratones. De manera crítica, la arteria comunicante posterior (PcomA), una pequeña arteria que conecta la circulación cerebral anterior y posterior, con frecuencia está subdesarrollada en algunas cepas de ratones, como C57Bl/6, la cepa utilizada predominantemente en la investigación experimental de accidentes cerebrovasculares. Se cree que esta permeabilidad de la PcomA contribuye a la variabilidad en el tamaño de la lesión en ratones después de un accidente cerebrovascular5. De hecho, cuando el flujo sanguíneo al ACP cae precipitadamente durante el ACM, y el PcomA no puede proporcionar suficiente flujo sanguíneo colateral, el infarto de accidente cerebrovascular puede expandirse hacia el territorio del ACP. Además, en este modelo, una larga duración de la isquemia conduce a una mayor probabilidad de mortalidad en ratones. En consecuencia, se suele utilizar una duración corta de MCAO de 30-60 min en ratones. Sin embargo, la mayoría de los pacientes con accidente cerebrovascular experimentan unas pocas horas de isquemia antes del tratamiento de reperfusión. Por lo tanto, un modelo de accidente cerebrovascular de ratón con una duración prolongada de isquemia es de alta relevancia clínica.
El objetivo general de este procedimiento es modelar el accidente cerebrovascular isquémico en ratones que tienen un infarto de tamaño mediano y una excelente tasa de supervivencia. Este modelo transcraneal de MCAO aborda los atributos críticos del accidente cerebrovascular clínico, ya que se puede realizar isquemia prolongada y los ratones envejecidos toleran bien este modelo, lo que permite la evaluación a largo plazo de la recuperación funcional.
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Protocolo
Todos los procedimientos descritos en este trabajo se llevan a cabo de acuerdo con las pautas de los NIH para el cuidado y uso de animales en investigación, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Duke (IACUC). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57Bl/6 jóvenes (8-10 semanas de edad) y de edad (22 meses de edad). En la Figura 1 se ilustra una descripción general de este protocolo.
1. Preparación quirúrgica
- Examine el ratón en busca de anomalías graves y déficits de comportamiento.
NOTA: Antes de la cirugía, es importante que los cirujanos usen el EPP (equipo de protección personal) adecuado, que incluye mascarilla quirúrgica, gorro, guantes y bata. - Pesa el ratón; programar el ventilador (ver Tabla de Materiales) en función del peso corporal.
- Coloque el mouse en una caja de inducción de anestesia de 4 pulgadas x 4 pulgadas x 7 pulgadas. Encienda el medidor de flujo de oxígeno (consulte la Tabla de materiales), ajustado a 30, y el medidor de flujo de óxido nitroso, ajustado a 70. Enciende el vaporizador con isoflurano al 5%.
- Inserte el alambre guía en el catéter intravenoso (IV) de 20 G.
- Saque el ratón de la caja de inducción cuando su frecuencia respiratoria se reduzca a 30-40 respiraciones por minuto.
- Coloque el ratón en el banco quirúrgico en posición supina. Saca la lengua del ratón y sujétala con los dedos de la mano izquierda. Inserte un laringoscopio (ver Tabla de materiales) en la boca del animal para visualizar las cuerdas vocales.
- Estabilice la barbilla del ratón en el laringoscopio con el dedo medio derecho. Libere la mano izquierda para sostener el catéter intravenoso de 20 G.
- Inserte el alambre guía ligeramente en la cuerda vocal y luego empuje lentamente el catéter intravenoso de 20 G en la tráquea hasta que la parte del ala del catéter se nivele con la punta de la nariz.
NOTA: Si el mouse se está moviendo, no inserte el cable. Esto puede causar traumatismo en la tráquea y sangrado. - Encienda el respirador (consulte la Tabla de materiales) y conéctelo con el catéter intravenoso de 20 G intubado en el ratón. Reduzca el isoflurano al 1,5% y asegúrese de que ambos pulmones estén ventilados mecánicamente.
NOTA: No olvide reducir la concentración de isoflurano. De lo contrario, el ratón recibirá una sobredosis de anestesia. - Aplique ungüento ocular en ambos ojos e inyecte 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea.
- Mantenga el ratón en posición lateral con el área temporal derecha hacia arriba. Mantenga la temperatura rectal a 37 °C utilizando una almohadilla térmica (35 °C) y una lámpara de calor controlada por un regulador de temperatura (consulte la tabla de materiales).
- Afeitar la superficie entre el ojo derecho y la oreja, y desinfectar el área quirúrgica al menos tres veces con hisopos de yodo y alcohol.
2. Cirugía MCAO
- Abra el paquete de instrumentos estériles para la cirugía MCAO. Use guantes estériles y haga una incisión de 1 cm en la piel entre el ojo derecho y la oreja derecha con unas tijeras quirúrgicas.
NOTA: Controle el color de la piel, la temperatura corporal y la respuesta al pellizco de los dedos de los pies cada 15 minutos. - Disecciona la fascia subyacente con fórceps para exponer los músculos temporal y masetero.
NOTA: Tenga cuidado de no dañar la glándula parótida. - Utiliza fórceps para tocar la parte inferior del músculo temporal y detectar la ubicación del arco cigomático. Aparta con cuidado las ramas del nervio facial.
- Use la punta de un asa de cauterización a alta temperatura (ver Tabla de materiales) para hacer una incisión transversal de 5 mm en el músculo temporal.
- Use dos pinzas para diseccionar el arco cigomático subyacente y exponer la articulación entre el maxilar y los huesos cigomáticos.
- Con unas tijeras se corta una porción de 3 mm del arco cigomático y se retira. Separa el músculo masetero de la base del cráneo.
NOTA: Tenga cuidado de no fracturar el seno retroorbitario y la vena temporal superficial. - Aplique cuatro pequeños retractores colocados en diferentes direcciones para exponer la base del cráneo craneal, con las ramas del nervio trigémino tiradas lateralmente por un retractor.
NOTA: Un surco en la superficie externa de la base craneal marca la ubicación de la fisura lateral entre los lóbulos frontal y temporal. El MCA se encuentra aquí (Figura 2A), y su tronco y ramas son visibles a través del cráneo delgado y transparente (Figura 2B). La relación de esta arteria con otras arterias cerebrales principales se muestra en la Figura 2A. - Aplicar una gota de solución salina normal al 0,9% sobre el cráneo por encima del tronco de la ACM y proximal a la rama de la corteza rinal. Use una amoladora eléctrica para adelgazar el cráneo hasta que se vea una pequeña fractura.
NOTA: No empuje la amoladora contra el cráneo, ya que puede penetrar en el cráneo y lesionar la arteria subyacente. - Use la punta de las pinzas para levantar el cráneo adelgazado y extraerlo. En el caso de los ratones simulados, deténgase aquí y no lige la arteria.
NOTA: Se forma una pequeña ventana rectangular a través del tronco MCA. - Coloque un lazo de una sola hebra de seda trenzada negra encima del MCA (Figura 2C). Inserta un 8-0 aguja microquirúrgica para levantar el tronco de la ACM y atar la sutura (ver Tabla de materiales) debajo de la aguja, dejando ambos extremos de la aguja en la parte superior del nudo del bucle de hilo de seda (Figura 2D).
- Para el MCAO transitorio, apriete ligeramente el nudo del hilo de seda debajo de la aguja para bloquear el flujo sanguíneo arterial (Figura 2E), que representa el inicio del MCAO.
- Use las pinzas para sujetar la sutura y retire lentamente la aguja al final de la isquemia (p. ej., 60 minutos o más).
NOTA: Cuando se retira la aguja, el nudo de hilo de seda se desliza fuera del MCA y se vuelve a perfundir el cerebro (Figura 2F). - Para un MCAO permanente, apriete firmemente el lazo de hilo de seda alrededor de la arteria y retire la aguja. Cortar y retirar el exceso de materiales de sutura.
- Aplique una gota de bupivacaína al 0,25% en la incisión cutánea y suture el músculo y la piel por separado utilizando suturas de nailon 6-0 de forma intermitente (ver Tabla de materiales). Aplique un ungüento antibiótico en la superficie de la incisión en la piel.
NOTA: La incisión en la piel también se puede cerrar con grapas estériles o pegamento.
3. Cuidados postquirúrgicos
- Apague el isoflurano para despertar al ratón. Desconecte el ventilador cuando se restablezca la respiración espontánea.
- Transfiera el ratón a una cámara de recuperación (consulte la tabla de materiales) con una temperatura controlada.
- Extuba el ratón cuando se restablezca su reflejo de enderezamiento o comience a moverse.
- Supervise de cerca el mouse en una cámara con temperatura y humedad controladas. Regrese el ratón a la jaula doméstica después de que recupere la conciencia completa (período de recuperación ~ 2 h). Administrar 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea al día durante 3 días.
4. Imágenes de contraste de moteado láser (LSCI)
- Seis y 24 h después de la MCAO, montar el ratón anestesiado en el marco estereotáxico. Afeita la parte superior de la cabeza y límpiala con tres hisopos alternos de yodo y alcohol.
NOTA: La anestesia se realizó como se mencionó en el paso 1.3. La LSCI también se realiza antes de la MCAO. - Haga una incisión de 3 cm en la línea media de la piel y diseccione la piel del cráneo. Aplique cuatro pequeños retractores de aguja para exponer la parte superior del cráneo.
- Mueva la cámara de moteado láser (consulte la Tabla de materiales) por encima de la cabeza y ajuste el enfoque de la cámara. Visualiza el flujo sanguíneo cerebral.
5. Tinción de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)
- Anestesiar profundamente al ratón con isoflurano al 5% al final del experimento, generalmente el día 1, 3 o 28 después del accidente cerebrovascular. Pellizca la cola para asegurarte de que no haya respuesta al dolor.
- Decapita al ratón con una tijera quirúrgica y extrae el cerebro. Incubar el cerebro en solución salina helada durante 20 min.
- Coloque el cerebro en una matriz de corte de cerebros en hielo y deje caer solución salina fría sobre el cerebro. Corta el cerebro en rodajas de 1 mm con cuchillas de afeitar finas.
- Sumerja las rodajas de cerebro en la misma orientación en un plato de solución de TTC al 2% (consulte la Tabla de materiales). Mantenga el plato en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos.
NOTA: El tejido cerebral normal se enrojece y el tejido isquémico permanece blanco. - Transfiera las rodajas de cerebro a formalina al 10% durante 24 h de fijación. Tome imágenes de los cortes de cerebro y mida el área del infarto.
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Resultados
Con una vista directa bajo un microscopio quirúrgico, se puede confirmar visualmente que el flujo sanguíneo de MCA está bloqueado durante la isquemia. Nuestro estudio previo mostró una reducción del flujo sanguíneo del >80% en el área isquémica utilizando un monitor láser Doppler6. Con el fin de determinar los cambios en el flujo sanguíneo post-MCAO, se puede utilizar la LSCI para confirmar aún más la lesión isquémica y la reperfusión (Figura 1). De hecho, en la
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Discusión
El primer modelo de oclusión transcraneal de ACM se estableció en ratas en 1981 11,12 y fue reemplazado por el modelo de ACM sin craniectomía en1989 4. La oclusión transcraneal inicial de la ACM tuvo un amplio campo quirúrgico, de modo que se extirpó todo el arco cigomático y se tiró lateralmente de los músculos. Los tejidos locales se hincharon después de la cirugía, lo que provocó estrés y una disminución de la ingesta de alimentos para ...
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Divulgaciones
Todos los autores no tienen conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Kathy Gage por su apoyo editorial. Las figuras del esquema se crearon con BioRender.com. Este estudio fue financiado por fondos del Departamento de Anestesiología (Centro Médico de la Universidad de Duke) y subvenciones de los NIH (NS099590, HL157354, NS117973 y NS127163).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| bupivacaína al 0,25% | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| cloruro de sodio al 0,9% | UCI Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) | Sigma o cualquier proveedor | ||
| Catéter intravenoso 20 G | BD 381534 | 20 GA 1.6 IN | |
| Aguja de 30 G | BD | 305106 | |
| 4-0 sutura de seda | Look | SP116 | Seda trenzada negra |
| 8-0 sutura con aguja | Ethilon | 2822G | |
| Hisopos con alcohol | BD | 326895 | |
| Caja de inducción de anestesia | Cualquier proveedor adecuado Pexiglass | make | |
| Amoladora eléctrica | JSDA | JD 700 | |
| Punta de bucle de cauterización de alta temperatura | Bovie | AA03 | |
| Isoflurano | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Monitor de perfusión láser doppler | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Pomada lubricante para los ojos | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Sonda | rectal de ratónPhysitemp | RET-3 | |
| Óxido nitroso | Airgas | UN1070 | |
| Otoscopio | Welchallyn | 728 | 2.5 mm Speculum Otoscopio sirvió como laringoscopio para visualizar las cuerdas vocales en ratones |
| Oxígeno | Airgas | UN1072 | |
| Povidona-yodo | CVS | 955338 | |
| Caja de recuperación | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (carprofeno) | Zoetis | 6100701 | Inyectable 50 mg/mL Ventilador |
| para roedores | Kent Scientific | Roent Jr. | |
| Controlador de temperatura | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Triple antibiológico y analgésico | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Vaporizador | RWD | R583S |
Referencias
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