En este estudio, se diseñó una aplicación de mancha de puntos para detectar Leptospira de los tres clados principales en muestras de agua. Este método permite la identificación de cantidades mínimas de ADN específicamente dirigidas por una sonda marcada con digoxigenina, fácilmente detectables por un anticuerpo anti-digoxigenina. Este enfoque es una herramienta valiosa y satisfactoria para fines de detección.
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Artículo de método
Reacción en cadena de la polimerasa e hibridación dot-blot para la detección de leptospira en muestras de agua
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Resumen
Resumen
El dot-blot es una técnica sencilla, rápida, sensible y versátil que permite la identificación de cantidades mínimas de ADN específicamente objetivo de la hibridación de sonda en presencia de ADN portador. Se basa en la transferencia de una cantidad conocida de ADN a un soporte sólido inerte, como una membrana de nailon, utilizando el aparato de mancha y sin separación electroforética. Las membranas de nailon tienen la ventaja de una alta capacidad de unión a ácidos nucleicos (400 μg / cm2), alta resistencia y están cargadas positiva o neutramente. La sonda utilizada es un fragmento de ssDNA altamente específico de 18 a 20 bases de largo marcadas con digoxigenina (DIG). La sonda se conjugará con el ADN de Leptospira . Una vez que la sonda se ha hibridado con el ADN objetivo, es detectada por un anticuerpo anti-digoxigenina, lo que permite su fácil detección a través de sus emisiones reveladas en una película de rayos X. Los puntos con una emisión corresponderán a los fragmentos de ADN de interés. Este método emplea el marcaje no isotópico de la sonda, que puede tener una vida media muy larga. El inconveniente de este marcador inmunológico estándar es una menor sensibilidad que las sondas isotópicas. Sin embargo, se mitiga mediante el acoplamiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los ensayos de dot-blot. Este enfoque permite el enriquecimiento de la secuencia objetivo y su detección. Además, se puede utilizar como una aplicación cuantitativa cuando se compara con una dilución en serie de un patrón conocido. Aquí se presenta una aplicación de mancha de puntos para detectar Leptospira de los tres clados principales en muestras de agua. Esta metodología se puede aplicar a grandes cantidades de agua una vez que se han concentrado por centrifugación para proporcionar evidencia de la presencia de ADN de Leptospiral. Se trata de una herramienta valiosa y satisfactoria para fines generales de cribado, y puede utilizarse para otras bacterias no cultivables que puedan estar presentes en el agua, mejorando la comprensión del ecosistema.
Introducción
La leptospirosis en humanos se origina principalmente en fuentes ambientales 1,2. La presencia de Leptospira en lagos, ríos y arroyos es un indicador de transmisión de leptospirosis entre la fauna silvestre y los animales domésticos y de producción que eventualmente pueden entrar en contacto con estos cuerpos de agua 1,3,4. Además, se ha identificado Leptospira en fuentes no naturales, como aguas residuales, estancadas y del grifo 5,6.
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Protocolo
1. Preparación de la muestra
- Concentrar cada muestra de agua en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por centrifugación a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C. Repita este paso, tantas veces como sea necesario, para concentrar la muestra en un volumen de 250 μL.
- Utilice el kit de extracción de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
- Realizar la PCR específica según la sonda dot-blot que se vaya a utilizar (Tabla 1).
- Realizar las amplificaciones en tubos de PCR con un volumen final de 25 μL que contenga 1 X tampón, 2,5 unidades de Ta....
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Resultados
Para evaluar la efectividad de la técnica, se utilizó ADN genómico de cultivos puros de cada Leptospira serovar, junto con la sonda específica del clado. Las membranas se prepararon con 100 ng de ADN genómico por reacción de PCR para cada serovar, seguido de ocho ADN genómico de bacterias no relacionadas y concentraciones variables de ADN genómico de los serovares ad hoc de Leptospira. Cada ensayo incluyó control positivo, negativo y no especial. Este ADN genómico no relacionado no mostró afinidad por l.......
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Discusión
Los pasos críticos de la técnica de dot-blot incluyen (1) la inmovilización del ADN, (2) el bloqueo de los sitios de unión libres en la membrana con ADN no homólogo, (3) la complementariedad entre la sonda y el fragmento objetivo en condiciones de recocido, (4) la eliminación de la sonda no hibridada y (5) la detección de la molécula reportera41.
El PCR-Dot-blot tiene ciertas limitaciones, como que la técnica no proporciona información sobre el tamaño del fragmento
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Divulgaciones
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.
Agradecimientos
Estamos en deuda con la colección Leptospira del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. Agradecemos la generosa donación de las cepas de referencia de Leptuspira ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge cepa BUT6 y Leptospira biflexa serovar Patoc cepa Patoc I al Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Agradecemos al Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, Coordinador del CIBAC, y al personal por su apoyo logístico. EDT se enmarcó en el programa Proyecto Terminal para estudiantes de pregrado de la Universidad Autónoma Metropolit....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ADN | Purelink Invitrogen | K182002 | |
| Gotaq Flexi DNA Polimerase (kit de polimerasa PCR Taq de punto final) | Promega | M3001 | |
| filtro Whatman, grado 1, | Membranas de | WHA1001325 | |
| , cargado positivamente Rollo 30cm x 3 m | Roche | ||
| Anti-Digoxigenina-AP, Fragmentos Fab Policlonal de oveja Anticuerpo primario | Roche | 11093274910 | |
| Base media EMJH | Difco S1368JAA | ||
| Enriquecimiento de Leptospira EMJH | Difco | BD 279510 | |
| Reactivo bloqueante | Roche | 11096176001 | |
| CSPD listo para usar 3-(4-metoxispiro {1,2-dioxetano-3,2′-(5′-cloro) triciclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-il) fosfato de fenilo | Merk | 11755633001 | |
| Ácido desoxirribonucleico de esperma de arenque | Sigma Aldrich | D3159 | |
| Desarrollador Carestream | Carestream Health Inc | GBX5158621 | |
| Digoxigenina-11-ddUTP | Roche | 11363905910 | |
| EDTA, Sal disódica (dihidratada) | Promega | H5032 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fixer Carestream | Carestream Health Inc | GBX 5158605 | |
| Lauril sulfato Sal de sodio (Dodecil sulfato de sodio; SDS) C12H2504SNa | Sigma Aldrich | L5750 | |
| N- Lauroilsarcosina sodio sal CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa | Sigma Aldrich | L-9150 | Es un tensioactivo aniónico |
| Polivinilpirrolidona (PVP-40) | Sigma Aldrich | PVP40 | |
| Polietilenglicol Monolaurato de sorbitán (Tween 20) | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| Fosfato de sodio dibásico (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Transferasa terminal, recombinante | Roche | 3289869103 | |
| Clorhidrato de Tris (Tris HCl) | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | Se puede hacer en casa siguiendo el Archivo complementario 6 |
| Imprimaciones | Sigma-Aldrich | A pedido | Seguir la tabla 1 |
| Sondas | Sigma-Aldrich | A pedido | Seguir la tabla 1 |
| Equipment | |||
| Nanodrop™ Un espectrofotómetro | Thermo-Scientific | ND-ONE-W | |
| Microcentrífuga refrigerada Sigma 1-14K, apto para la centrifugación de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 14.000 rpm | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
| Pipetas ajustables desinfectadas, gama 2-20 y micro; l, 20-200 y micro; l | Gilson | SKU:F167360 | |
| Tubos de microcentrífuga desechables de 1,5 ml (esterilizados en autoclave) | Axygen | MCT-150-SP | |
| Desechables 600 y micro; l tubos de microcentrífuga (esterilizados en autoclave) | Axygen | 3208 | |
| Puntas de pipeta desechables 1-10 y micro; l | Axygen | T-300 | |
| Puntas de pipeta desechables 1-200 y micro; l | Axygen | TR-222-Y | |
| Aparato de transferencia de puntos Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
| Hergom portátil Succión | Hergom | 7E-A | |
| Caja de luz científica (luz visible PH90-115V) | Hoefer | PH90-115V | |
| Reticulante UV | Hoefer UV | UVC-500 | |
| Thermo Hybaid PCR Express Termociclador | Hybaid | ||
| Casete radiográfico con placa IP14 x 17 | Fuji |
Referencias
- Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055(2020).
- Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387
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Reimpresiones y permisos
