Un approccio di visione artificiale ai flussi di lavoro di microscopia elettronica a trasmissione, all'analisi dei risultati e alla gestione dei dati

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare il software di visione artificiale per stabilizzare i processi dinamici durante l'imaging TEM, indicizzando contemporaneamente più flussi di metadati per ogni immagine in una timeline navigabile. Dimostriamo come questa piattaforma consenta la calibrazione e la mappatura automatizzate della dose di elettroni nel corso di un esperimento.

Abstract

La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) consente agli utenti di studiare i materiali su scala atomica fondamentale. Esperimenti complessi generano regolarmente migliaia di immagini con numerosi parametri che richiedono un'analisi lunga e complicata. AXON synchronicity è una soluzione software di sincronizzazione della visione artificiale (MVS) progettata per affrontare i punti critici inerenti agli studi TEM. Una volta installato sul microscopio, consente la sincronizzazione continua di immagini e metadati generati dal microscopio, dal rilevatore e dai sistemi in situ durante un esperimento. Questa connettività consente l'applicazione di algoritmi di visione artificiale che applicano una combinazione di correzioni spaziali, fasciali e digitali per centrare e tracciare una regione di interesse all'interno del campo visivo e fornire una stabilizzazione immediata dell'immagine. Oltre al sostanziale miglioramento della risoluzione offerto da tale stabilizzazione, la sincronizzazione dei metadati consente l'applicazione di algoritmi computazionali e di analisi delle immagini che calcolano le variabili tra le immagini. Questi metadati calcolati possono essere utilizzati per analizzare le tendenze o identificare le aree chiave di interesse all'interno di un set di dati, portando a nuove informazioni e allo sviluppo di funzionalità di visione artificiale più sofisticate in futuro. Uno di questi moduli che si basa su questi metadati calcolati è la calibrazione e la gestione della dose. Il modulo di dose fornisce calibrazione, tracciamento e gestione all'avanguardia sia della fluenza elettronica (e-/Å 2·^s-1) che della dose cumulativa (e^-/Ų) che viene erogata ad aree specifiche del campione su base pixel per pixel. Ciò consente una panoramica completa dell'interazione tra il fascio di elettroni e il campione. L'analisi degli esperimenti è semplificata attraverso un software di analisi dedicato in cui i set di dati costituiti da immagini e metadati corrispondenti sono facilmente visualizzati, ordinati, filtrati ed esportati. Combinati, questi strumenti facilitano collaborazioni efficienti e analisi sperimentali, incoraggiano il data mining e migliorano l'esperienza di microscopia.

Introduction

I microscopi elettronici a trasmissione (TEM) e le loro capacità hanno beneficiato enormemente dei progressi nelle telecamere, nei rilevatori, nei portacampioni e nelle tecnologie informatiche. Tuttavia, questi progressi sono ostacolati da flussi di dati disconnessi, limitazioni delle operazioni umane e analisi dei dati ingombranti ^1,2. Inoltre, gli esperimenti in situ e operando adattano i TEM in laboratori su scala nanometrica in tempo reale, consentendo di studiare campioni in ambienti gassosi o liquidi applicando contemporaneamente una gamma di stimoli esterni 3,4,5. L'adozione di flussi di lavoro così complessi ha solo amplificato queste limitazioni e il conseguente aumento delle dimensioni e della complessità di questi flussi di dati è un'area di crescente preoccupazione. Pertanto, vi è una crescente enfasi sull'utilizzo dell'azionabilità della macchina per trovare, accedere, interoperare e riutilizzare i dati, una pratica nota come principi FAIR⁶. La pubblicazione dei dati di ricerca in conformità con il concetto dei principi FAIR ha ricevuto un'attenzione favorevole da parte delle agenzie governative di tutto il mondo ^7,8 e l'applicazione dei principi FAIR utilizzando software di visione artificiale è un passo fondamentale nella loro adozione.

Una piattaforma software di sincronizzazione della visione artificiale (MVS) è stata sviluppata in risposta ai punti critici specifici inerenti all'esecuzione e all'analisi di esperimenti TEM complessi e ricchi di metadati (in particolare esperimenti in situ e operando)⁹. Una volta installato sul TEM, il software MVS si collega, integra e comunica con la colonna del microscopio, i rilevatori e i sistemi integrati in situ . Ciò consente di raccogliere continuamente immagini e allineare tali immagini con i loro metadati sperimentali, formando un database completo ricercabile, una sequenza temporale dell'esperimento dall'inizio alla fine (Figura 1). Questa connettività consente al software MVS di applicare algoritmi che tracciano e stabilizzano in modo intelligente una regione di interesse (ROI), anche quando i campioni subiscono cambiamenti morfologici. Il software applica le regolazioni al palco, al fascio e alle correzioni digitali necessarie per stabilizzare il ROI attraverso le sue funzioni Drift Control e Focus Assist . Oltre ad arricchire le immagini con i metadati grezzi prodotti dai diversi sistemi sperimentali, il software può produrre nuovi metadati computazionali utilizzando algoritmi di analisi delle immagini per calcolare le variabili tra le immagini, che consentono di correggere automaticamente la deriva del campione o i cambiamenti di messa a fuoco.

Le immagini TEM e i metadati associati raccolti tramite il software MVS sono organizzati come una linea temporale sperimentale che può essere aperta e visualizzata da chiunque tramite la versione gratuita e offline del software di analisi, Studio (di seguito denominato software di analisi)¹⁰. Durante un esperimento, il software MVS sincronizza e registra tre tipi di immagini dalla fotocamera o dal rilevatore del microscopio, che vengono visualizzate nella parte superiore della timeline sotto il visualizzatore di immagini: acquisizione singola (singole immagini ad acquisizione singola acquisite direttamente dal software TEM), raw (immagini dal flusso live del rilevatore / telecamera a cui non sono state applicate correzioni di deriva digitale; queste immagini potrebbero essere state corrette fisicamente tramite movimento dello stadio o spostamento del fascio) e correzione della deriva (immagini dal flusso live del rilevatore/telecamera che sono state spostate digitalmente). I dati raccolti durante un esperimento o una sessione possono essere ulteriormente perfezionati in sezioni più piccole o frammenti di dati, noti come raccolte, senza perdita di metadati incorporati. Dal software di analisi, immagini, pile di immagini e metadati possono essere esportati direttamente in una varietà di immagini in formato aperto e tipi di fogli di calcolo per l'analisi utilizzando altri strumenti e programmi.

Il framework di controllo del microscopio, stabilizzazione e integrazione dei metadati abilitato dal software MVS consente anche l'implementazione di programmi o moduli di visione artificiale aggiuntivi, progettati per alleviare le limitazioni negli attuali flussi di lavoro TEM. Uno dei primi moduli sviluppati per sfruttare questa piattaforma di sincronizzazione è la calibrazione della dose di elettroni e il tracciamento spaziale delle aree esposte al fascio all'interno del campione. Tutte le immagini TEM sono formate dall'interazione tra il campione e il fascio di elettroni. Tuttavia, queste interazioni possono anche provocare impatti negativi e inevitabili sul campione, come la radiolisi e il danno a catena 11,12, e richiedono un attento equilibrio tra l'applicazione di una dose di elettroni sufficientemente elevata per generare l'immagine e la minimizzazione del danno del fascio risultante ^13,14.

Sebbene molti utenti si affidino alle misurazioni della corrente dello schermo per stimare la dose di elettroni, questo metodo ha dimostrato di sottostimare ampiamente la corrente effettiva del fascio¹⁵. I valori di dose qualitativi possono essere ottenuti tramite la corrente dello schermo sullo stesso microscopio con le stesse impostazioni, ma la riproduzione di queste condizioni di dose utilizzando microscopi o impostazioni diversi è altamente soggettiva. Inoltre, qualsiasi regolazione dei parametri di imaging effettuata dall'utente durante l'esperimento, come la dimensione dello spot, l'apertura, l'ingrandimento o l'intensità, richiede una misurazione separata della corrente dello schermo per calcolare la dose risultante. Gli utenti devono limitare rigorosamente le condizioni di imaging utilizzate durante un determinato esperimento o misurare e registrare meticolosamente ogni condizione della lente utilizzata, complicando ed estendendo significativamente l'esperimento oltre ciò che è fattibile per il normale funzionamento del microscopio^16,17.

Dose, indicato come software di dose per questo protocollo, è un modulo software di calibrazione della dose che utilizza un supporto di calibrazione dedicato progettato per consentire misurazioni automatiche della corrente. Una tazza di Faraday, il gold standard per una calibrazione accurata della corrente del fascio¹⁵, è integrata nella punta del supporto di calibrazione. Il software MVS esegue una serie di calibrazioni della corrente del fascio e dell'area del fascio per ogni condizione dell'obiettivo e incorpora tali valori sulle immagini a livello di pixel.

In questo articolo video, i protocolli software MVS progettati per migliorare tutte le aree del flusso di lavoro TEM sono presentati utilizzando campioni di nanomateriali rappresentativi. Un campione di nanoparticelle di zeolite sensibile al fascio¹⁴ viene utilizzato per dimostrare i flussi di lavoro di calibrazione e gestione della dose. Eseguiamo un esperimento rappresentativo di riscaldamento in situ utilizzando un campione di nanocatalizzatore Au/FeO_x ^18,19 che subisce cambiamenti morfologici significativi quando riscaldato. Questo esperimento in situ evidenzia gli algoritmi di stabilizzazione del software e la sua capacità di raccogliere più flussi di metadati, che è una sfida intrinseca per gli studi in situ e operando. Sebbene non descritto nel protocollo, a causa della sua sensibilità unica alla dose di elettroni, discutiamo esempi rappresentativi dell'utilità del software per gli studi liquid-EM (protocolli per i quali sono stati precedentemente riportati in letteratura^20,21,22), e come queste tecniche possono essere applicate per migliorare la comprensione dell'effetto della dose sugli esperimenti liquido-EM. Infine, mostriamo come l'analisi dei dati viene semplificata utilizzando il software di analisi offline per visualizzare, filtrare ed esportare una varietà di file di immagini, video e dati in altri formati accessibili.

Figura 1: Esempi di interfaccia utente per MVS e software di analisi. (A) Il riquadro di visualizzazione delle immagini del software di sincronizzazione e il pannello di controllo. Una connessione tra il TEM e il software di sincronizzazione viene stabilita attivando il pulsante Connetti, che trasmette le immagini e i metadati dal microscopio al software di sincronizzazione. Dal visualizzatore di immagini, l'operatore può eseguire una varietà di operazioni assistite dalla visione artificiale, come Drift Correct e Focus Assist. Offre inoltre la possibilità di applicare le immagini dei tag e la sessione di revisione senza interrompere la raccolta dei dati. (B) Screenshot del software di analisi delle immagini che evidenzia la posizione della porta di visualizzazione dell'immagine, della timeline e del pannello Metadati e analisi. È possibile accedere al software di analisi in qualsiasi momento durante un esperimento per rivedere le immagini acquisite fino a quel momento utilizzando il pulsante Review Session. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocol

1. Metodo 1: Taratura della dose del microscopio elettronico a trasmissione per le modalità di imaging TEM e scansione TEM (STEM)

1. Accendere il picoamperometro e lasciarlo riscaldare per almeno 30 minuti prima di iniziare la calibrazione della dose. Caricare il supporto di calibrazione della dose nel TEM e collegare il supporto di calibrazione al picoamperometro utilizzando il cavo a connessione rapida.
2. Con il microscopio in modalità TEM , aprire le valvole a colonna e individuare il foro fiduciale da 35 μm sul portadose (Figura 2). Avviare l'applicazione software MVS e selezionare Dose (Calibration Automation) dalle opzioni dell'esperimento.
   NOTA: la posizione del foro fiduciale viene salvata dal software dopo la calibrazione iniziale, consentendo al software di individuare automaticamente la propria posizione per le calibrazioni future.
3. Fare clic sull'icona Connect (Figura 1A) e selezionare il microscopio per attivare la connessione tra il TEM e il software MVS. Una volta collegate, le immagini della telecamera/rilevatore saranno visibili nel visualizzatore di immagini del software.
   NOTA: Non è necessario ottimizzare l'altezza eucentrica e il bordo del foro fiduciale può apparire sfocato a causa dello spessore della punta. Ciò non influirà sulle misurazioni correnti.
4. Passare alla scheda Dose e quindi a Calibrazione dose. Selezionare il processo di calibrazione dell'area di dosaggio , seguire le istruzioni del software e immettere i valori configurabili dall'utente richiesti (come le impostazioni di apertura e monocromatore). Al termine della calibrazione dell'area di dosaggio , selezionare il processo di calibrazione della corrente di dose e seguire le istruzioni del software.
5. Ripetere il processo di calibrazione (passaggio 1.4) per ogni dimensione dello spot, apertura o impostazione monocromatica che può essere utilizzata durante l'esperimento.
6. Al termine del processo di calibrazione per la modalità TEM , calibrare la dose di elettroni per la modalità STEM ripetendo il passaggio 1.4.
   NOTA: la modalità STEM non richiede l'esecuzione della calibrazione dell'area di dosaggio .
7. Al termine di tutte le calibrazioni desiderate, fare clic su Chiudi sessione, rimuovere il supporto della calibrazione della dose e tornare alla schermata iniziale del software MVS.

2. Metodo 2: determinazione della soglia di dose utilizzando l'MVS e il software di dose

1. Caricare una griglia TEM standard con un campione (in questo esempio sono state utilizzate nanoparticelle di zeolite ZSM-5 disponibili in commercio) in un supporto TEM standard. Inserire il supporto nel TEM e individuare una regione di interesse (nanoparticelle di zeolite cristallina).
2. Aprire l'applicazione software MVS e selezionare Altro.
   NOTA: Ulteriori informazioni sul campione (ad esempio identificatore e descrizione del campione, nome dell'operatore e note sull'esperimento) possono essere aggiunte al campo dei parametri sperimentali.
3. Ripetere il passaggio 1.3 per connettersi al software MVS e accedere alla scheda dei metadati dell'immagine nell'interfaccia del software MVS per selezionare i seguenti metadati da sovrapporre al flusso di immagini mostrato sul display dal vivo: Ingrandimento, Dose massima e Velocità di dose. Altri metadati possono essere inclusi se l'utente lo desidera. Uno screenshot dell'interfaccia del software MVS che mostra i controlli di gestione della dose è fornito nel file supplementare 1.
4. Aprire la scheda Dose e selezionare Gestione dose e Abilita monitoraggio dose per attivare il monitoraggio automatico della dose di elettroni. Selezionare Mostra livello dose per visualizzare la sovrapposizione del colore della dose.
5. Impostare i valori per il livello di dose elevato e l'intensità di dose elevata e premere su Save (in questo esempio sono stati utilizzati rispettivamente i valori di 60.000 e-/Å 2 e 500 e^-/Ų·s).
6. Passare alla scheda Impostazioni , selezionare Dose e impostare i valori di Opacità della mappa di navigazione della dose e Opacità dell'immagine della dose (in questo esempio sono stati utilizzati valori rispettivamente di 0,50 e 0,30).
7. Nella finestra Live Image Viewer , attivare la correzione della deriva facendo clic su Drift Correct.
8. Passare alla scheda Visualizzazione dati e tracciare i valori dei metadati Defocus e Quoziente di messa a fuoco sull'asse Y.
   NOTA: tutti i valori dei metadati disponibili possono essere tracciati in tempo reale durante l'esperimento dalla tabella di visualizzazione dati.
9. Attivare Focus Assist, quindi selezionare Calibra messa a fuoco per eseguire la calibrazione automatica della messa a fuoco . Una volta completata la routine Calibra messa a fuoco , chiudere la scheda Visualizzazione dati .
10. Apri la scheda Analisi immagini nel software MVS e attiva le opzioni Live FFT e Quadranti 1 e 2 .
11. Utilizzando i controlli software del microscopio, regolare le condizioni del fascio in modo che il flusso di elettroni sia ~ 500 e^-/Ų·s. e spostarsi in una nuova regione del campione e centrare il ROI del campione nella vista dal vivo del software MVS.
    NOTA: quando si effettuano movimenti di scena di grandi dimensioni, il controllo della deriva e l'assistenza alla messa a fuoco si disattivano automaticamente e devono essere riattivati una volta selezionato il nuovo ROI.
12. Prendere nota delle condizioni di dose nel software utilizzando la funzione Tag . Evidenzia l'icona Tag e inserisci il testo desiderato per indicare una serie specifica di immagini all'interno della timeline. Le immagini verranno contrassegnate con questo testo fino a quando l'icona Tag non sarà deselezionata.
13. Mantenere un'intensità di dose costante mentre si visualizza continuamente lo stesso ROI fino a quando i picchi corrispondenti alla struttura atomica nel grafico FFT non sono scomparsi.
14. Ridurre l'ingrandimento, aprire la scheda Gestione dose e attivare Mostra livello dose per sovrapporre una mappa della dose codificata a colori.
    NOTA: questa funzione fornisce un riferimento visivo delle aree del campione che sono state esposte al fascio di elettroni e della loro relativa esposizione alla dose. Evidenziando queste aree nelle singole immagini con il cursore indicherà i rispettivi valori di dose.
15. Disconnetti e termina la sessione deselezionando Connetti, quindi seleziona Chiudi sessione. Salvare una copia dei dati della sessione in un'origine esterna per evitare che i dati salvati nel software MVS vengano sovrascritti durante gli esperimenti successivi (file supplementare 2).

3. Metodo 3: metadati e analisi delle tendenze ed esportazione dei dati utilizzando il software di analisi

1. Avviare il software di analisi (il software offline per la visualizzazione dei set di dati completamente sincronizzati) e aprire il file della sessione dell'esperimento selezionandolo dalla libreria di file.
   NOTA: gli utenti possono accedere al software di analisi anche tramite l'icona Sessione di revisione nel software MVS durante un esperimento.
2. Visualizzare le immagini corrette per la deriva attivando la scheda DC sotto la porta di visualizzazione dell'immagine e selezionare le sovrapposizioni di dati desiderate selezionando le rispettive caselle Dati di sovrapposizione nella scheda Metadati immagine (in questo esempio sono stati utilizzati Microscopio, Data/Ora, Velocità di dose, Dose massima e Ingrandimento). Altri metadati possono essere tracciati come l'utente desidera.
3. Selezionare la casella Sequenza temporale per Dose massima e Intensità di dose per aggiungere un grafico di questi valori alla sequenza temporale. Evidenziare o scorrere questi grafici per aggiornare l'immagine visualizzata nel riquadro di visualizzazione. Accedi a un'ampia gamma di strumenti tramite le schede Note, Analisi immagini, Casella degli strumenti e Visualizzazione dati.
   1. Accedi alla FFT per ogni immagine tramite la scheda Analisi immagini e fai clic su Live FFT per aggiornare la FFT mentre scorri le immagini.
   2. Utilizzare la dissolvenza dei picchi FFT per determinare il punto temporale in cui la struttura della zeolite perde cristallinità. Registrare il valore della dose massima registrato con quell'immagine.
4. Utilizzare l'opzione Filtro per filtrare facilmente set di dati di grandi dimensioni in set di dati più piccoli e condivisibili senza perdere i metadati associati. Aprire il pannello del filtro e regolare i cursori in modo che siano selezionati solo i dati con un'intensità di dose uguale o superiore a ~500 e^-/Ų·s e salvare la nuova raccolta utilizzando il nome Studio soglia di dose.
   NOTA: i filtri possono essere applicati per qualsiasi tipo di metadati associato.
5. Esporta le immagini e i metadati della sessione in altri tipi di file arricchiti con barre di scala e sovrapposizioni di metadati.
   1. Evidenziare la raccolta nel riquadro della libreria e selezionare Pubblica facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla selezione. Dalla finestra Pubblica , selezionare le opzioni desiderate per l'esportazione del tipo di file.
   2. Selezionare la scheda dati con correzione della deriva e applicare sovrapposizioni di tutti i metadati desiderati e della FFT (posizionare la sovrapposizione FFT come desiderato; esempi di immagini esportate con la FFT sono mostrati nella Figura 3).
6. Esportate la serie di immagini come filmato utilizzando la stessa opzione Pubblica . Selezionare le immagini evidenziandole nella timeline, utilizzando le opzioni di filtro o esportando il file di database completo. Seleziona il formato filmato desiderato, la frequenza dei fotogrammi e la posizione del file. Un filmato dell'esperimento di degradazione della zeolite ottenuto utilizzando un TEM a 200 kV è fornito nel file supplementare 3.
7. Esporta i metadati separatamente dalle immagini acquisite come file CSV selezionando l'opzione Metadati (CSV) durante la pubblicazione.
   NOTA: le immagini raw e corrette per deriva vengono esportate come CSV separati (file supplementare 4 e file supplementare 5).

4. Metodo 4: Studio del riscaldamento in situ dell'oro su nanoparticelle di ossido di ferro

1. Dropcast di un nanocatalizzatore (Au/FeO_x) sospeso in etanolo su un E-chip riscaldatore in situ , un supporto per campioni mico-elettrocromi (MEM) e lasciarlo asciugare all'aria. Montare il campione nel supporto di riscaldamento in situ, inserire il supporto con il campione nel TEM e collegare il supporto all'alimentazione utilizzando il cavo in dotazione. Individua un ROI di esempio utilizzando i controlli TEM.
   NOTA: questo esperimento ha utilizzato un supporto riscaldante completamente integrato con il software MVS, consentendo di incorporare i metadati della temperatura con le immagini.
2. Selezionare l'opzione del flusso di lavoro appropriata dal software MVS (in questo esempio, è stato utilizzato il flusso di lavoro Fusion , ma è possibile utilizzare altri supporti di riscaldamento del produttore selezionando Altro).
3. Seguire le istruzioni del flusso di lavoro per confermare il collegamento elettrico tra il supporto e l'E-chip di riscaldamento caricando il file di calibrazione ed eseguendo un controllo del dispositivo.
4. Collegare il microscopio al software MVS, come mostrato in precedenza nei passaggi 2.3-2.10 (in questo esempio, sono stati selezionati i valori dei metadati per l'intensità di dose, la dose massima, la correlazione di corrispondenza, la velocità di deriva e la temperatura del canale A) e centrare il ROI del campione nel campo visivo.
5. Aprire la scheda Fusion AX e impostare e applicare una temperatura.
6. Fare clic sul pulsante Channel A Setup (Impostazione canale A ) per accedere alle impostazioni di controllo della temperatura. Selezionare la funzione Temperatura e la modalità di controllo manuale .
7. Fare clic sul pulsante Esperimento per accedere ai controlli sperimentali. Impostare la velocità di rampa su 10 °C/s e l'obiettivo su 600 °C. Fare clic su Applica per avviare l'esperimento.
   NOTA: l'esperimento può essere messo in pausa o interrotto in qualsiasi momento utilizzando i pulsanti di accesso rapido nell'angolo inferiore destro del software MVS, senza aprire la scheda Fusion AX .
8. Una volta raggiunta la temperatura impostata di 600 °C, aprire la scheda Fusion AX e selezionare Esperimento. Modificare la velocità di rampa a 2 °C e l'obiettivo a 800 °C. Fare clic su Applica per avviare l'esperimento.
   NOTA: la procedura per l'applicazione di una rampa di riscaldamento dipende dal sistema di riscaldamento in situ utilizzato. I passaggi evidenziati sopra per applicare la rampa di temperatura si applicano al sistema utilizzato in questo esempio.
9. Evidenzia eventuali eventi o punti di interesse durante l'esperimento utilizzando la funzione di tagging, come mostrato nel passaggio 2.10. Continuare a visualizzare l'immagine del campione e regolare il profilo di temperatura come desiderato. Al termine, fare clic su Termina sessione e salvare il file di dati utilizzando il software di analisi (una parte del file di database discusso nei risultati rappresentativi viene fornita come file supplementare 6).
10. Aprire il software di analisi per rivedere la sessione. Tracciare la temperatura, il fattore di morphing del modello, l'intensità di dose e la dose cumulativa nella sequenza temporale. Esportare immagini e filmati come desiderato utilizzando i passaggi descritti nei passaggi 3.6 e 3.7. Le immagini e i filmati possono essere esportati con o senza le sovrapposizioni della mappa della dose (Figura 4).

Representative Results

Questo lavoro evidenzia l'utilità dell'acquisizione dei dati utilizzando il software MVS per l'imaging TEM e gli esperimenti in situ. L'allineamento del microscopio e l'impostazione delle condizioni sono stati eseguiti e selezionati attraverso i controlli predefiniti del produttore TEM. Dopo la configurazione iniziale, i protocolli presentati in questo articolo video sono stati condotti tramite il software MVS. Un TEM da 300 kV è stato utilizzato per tutti gli esperimenti presentati nel protocollo video e nei dati rappresentativi, ad eccezione dei dati di zeolite di confronto acquisiti utilizzando un FEG freddo da 200 kV (Figura 3D-F e Tabella 1). Tutti i metadati sono stati raccolti e allineati alle rispettive immagini automaticamente dal software MVS.

Dopo aver avviato il software e selezionato il flusso di lavoro appropriato dal menu, viene stabilita una connessione al microscopio attivando il pulsante Connetti nella barra degli strumenti all'estrema sinistra del visualizzatore di immagini, come mostrato nella Figura 1A. Quando il pulsante Connetti è evidenziato, le immagini e i metadati associati dal microscopio vengono automaticamente trasmessi al software MVS e visualizzati nel riquadro di visualizzazione delle immagini. Queste immagini e i metadati associati vengono salvati cronologicamente in una sequenza temporale che può essere aperta, rivista e analizzata senza interrompere la registrazione di nuovi dati nella sequenza temporale (Figura 1B). Lo streaming può essere interrotto dall'utente in qualsiasi momento disattivando l'icona Connetti .

Una volta attivata la connessione, è possibile accedere ad altri flussi di lavoro che dipendono dal framework software MVS. Negli esempi mostrati in questo protocollo video, è necessario eseguire una calibrazione della dose prima di utilizzare le altre funzioni del software MVS. La calibrazione della dose è un processo automatizzato controllato dal software MVS; utilizza un supporto dedicato per la calibrazione della dose della tazza di Faraday per misurare la corrente e l'area del fascio per la combinazione dei parametri. Il supporto di calibrazione della tazza di Faraday, mostrato in Figura 2, si collega a un picoamperometro esterno, che misura con precisione la corrente del fascio. Una volta inserito nel microscopio, il foro di allineamento fiduciale viene centrato e le condizioni del fascio desiderate da calibrare (dimensioni dello spot, aperture e ingrandimenti) vengono inserite nel software. Il software esegue una serie di fasi di calibrazione per ogni combinazione delle condizioni selezionate. Durante la calibrazione della dose, il supporto si sposta automaticamente tra la tazza del collettore di corrente di Faraday integrata e il foro passante. La misurazione corrente per ogni combinazione di condizioni dell'obiettivo viene misurata sulla tazza di Faraday dal picoamperometro. Quindi, il software traduce lo stadio per centrare il raggio nel foro passante e l'area del fascio viene determinata attraverso algoritmi di visione artificiale. Questa serie di misurazioni costruisce un profilo della relazione tra l'intensità / luminosità e l'area del fascio. Ciò consente al software di estrapolare l'area del fascio mentre l'impostazione di intensità/luminosità viene regolata durante un esperimento indipendentemente dal campo visivo. I valori per la dose cumulativa e l'intensità di dose vengono calcolati utilizzando queste misurazioni della corrente del fascio e dell'area del fascio e viene generato un file di calibrazione della dose. Questo processo definisce essenzialmente una dose "impronta digitale" per il TEM e le sue condizioni individuali della lente. Una volta calibrata la dose per il TEM, l'utente è in grado di operare normalmente e regolare liberamente l'ingrandimento e l'intensità senza perdita di informazioni sulla dose o prendere appunti manuali¹⁷. Al termine della calibrazione, il supporto per la taratura della dose viene rimosso, consentendo l'inserimento del campione normalmente. Il processo di calibrazione per entrambe le modalità TEM e STEM richiede normalmente meno di 10 minuti.

Dopo aver calibrato le condizioni di dose, un campione di nanoparticelle di zeolite acquistato commercialmente (ZSM-5) è stato ripreso in condizioni di intensità di dose elevata per determinare la dose soglia (cumulativa) alla quale il campione è troppo danneggiato per fornire informazioni strutturali. Le nanoparticelle ZSM-5 sono state sospese in etanolo e dropcast su una griglia TEM di rame convenzionale. Sono state riprese in modo continuo a 300 kV in modalità TEM utilizzando una dimensione dello spot di 3 e un'apertura del condensatore di 100 μm. L'intensità di dose letta dal software MVS in condizioni di intensità di dose elevata era di 519 e^-/Ų·s. Le nanoparticelle nel campo visivo sono state riprodotte continuamente fino a quando i picchi nella FFT sono scomparsi, indicando la degradazione della struttura cristallina, come mostrato nella Figura 3A-C e nel File Supplementare 3. Le sovrapposizioni (che possono essere aggiunte durante un esperimento dal vivo o successivamente nel software di analisi) sono state applicate alle immagini TEM per mostrare la data e l'ora, l'intensità di dose, la dose massima (cumulativa) e l'ingrandimento. L'intensità di dose è stata mantenuta costante durante gli esperimenti, con la dose cumulativa (dose massima) crescente in funzione del tempo. I picchi FFT hanno cominciato a scomparire dopo 42 s di imaging continuo (Figura 3B). A 1 min e 20 s e una dose cumulativa di ~60.000 e^-/Ų, i picchi FFT erano completamente scomparsi (Figura 3C).

Per dimostrare che questo metodo di calibrazione genera misurazioni quantitative della dose che possono essere applicate ad altri microscopi che operano in contesti diversi, lo stesso processo di calibrazione e l'esperimento di degradazione della zeolite sono stati condotti utilizzando una pistola a emissione a campo freddo (FEG) TEM da 200 kV e una dimensione dello spot di 1. Questo microscopio è stato calibrato utilizzando la stessa procedura descritta nel Metodo 1 e lo stesso esperimento descritto nel Metodo 2 è stato eseguito utilizzando le nuove impostazioni di dimensione dello spot e apertura. Le impostazioni del fascio sono state regolate in modo che la differenza nell'intensità di dose applicata tra i due esperimenti fosse trascurabile (499 e-/Å 2·s vs. 519 e^-/Å ²·s). Come mostrato nella Figura 3D-F e riassunto nella Tabella 1, i punti FFT scompaiono completamente dopo 1 minuto e 50 s di imaging continuo e una dose cumulativa di 58.230 e-/Ų, che si allinea con i valori ottenuti nel primo esperimento.

Un esempio di come il software MVS può beneficiare degli esperimenti in situ è stato mostrato eseguendo un esperimento di riscaldamento. Un campione rappresentativo di nanocatalizzatore, Au/FeO_x (sintetizzato seguendo una procedura pubblicata¹⁹), è stato selezionato come sistema di esempio perché subisce cambiamenti morfologici e strutturali dinamici ad alte temperature. Questa mobilità indotta dalla temperatura rende difficile mantenere il ROI centrato all'interno del campo visivo a causa del movimento del campione stesso e dell'espansione termica del campione stesso durante le variazioni di temperatura¹⁸. Con le funzioni Drift Correct e Focus Assist abilitate, il campione è stato ripreso per un periodo di ~30 s a 800 °C. A temperature elevate, le nanoparticelle d'oro all'interno dell'Au/FeO_x migravano lungo la superficie del supporto dell'ossido di ferro e si sinterizzavano per formare particelle più grandi, come mostrato nella Figura 4 e come filmato nel file supplementare 7. La Figura 5 mostra una serie di istantanee TEM (Figura 5A-F) di una regione porosa all'interno di un nanocatalizzatore Au/FeO_x, registrate in vari punti temporali (Figura 5G) durante un esperimento di riscaldamento in situ. Il valore di deriva coordinato del ROI è stato calcolato automaticamente dal software. I valori coordinati di deriva e temperatura delle immagini nel corso della serie sono mostrati graficamente nella Figura 5G. Come previsto, la deriva coordinata del campione aumenta all'aumentare del profilo di temperatura, da una velocità di ~ 9 nm / min a ~ 62 nm / min, e inizia a diminuire verso il livellamento man mano che la temperatura viene mantenuta costante. Nonostante questo alto tasso di deriva e le modifiche alla morfologia del campione, le immagini ad alta risoluzione sono facilmente ottenibili durante l'aumento della temperatura, rivelando il movimento all'interno della regione porosa, come mostrato nel file supplementare 8. Fare riferimento al file supplementare 9 per le istruzioni per il download e le specifiche del computer.

Figura 2: Taratura e tracciamento della dose di elettroni. (A) La dose viene calibrata utilizzando un portacampioni dedicato che contiene un collettore di corrente posizionato sul piano del campione per le misurazioni della corrente del fascio. (B) Illustrazione delle caratteristiche del disegno della punta: A sinistra: tazza di Faraday; Centrale: foro fiduciale; A destra: foro passante (C). La dose di elettroni applicata può essere visualizzata nel software utilizzando mappe codificate a colori per indicare diverse esposizioni di dose all'interno di un'immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Degradazione indotta dalla dose elettronica delle nanoparticelle di zeolite (ZSM-5). (A-C) Istantanee scattate in un periodo di 1 minuto e 20 s che mostrano i dati di degradazione ottenuti con un FEG di 300 kV e un'intensità di dose misurata di 519 e-/Ų·s; la zeolite si degrada entro 1 min e 20 s. (D-E) Istantanee scattate in un periodo di tempo di 1 min e 50 s che mostrano i dati di degradazione ottenuti con un FEG TEM freddo di 200 kV e un tasso di dose di elettroni di 499 e-/Ų·s; gli inserti mostrano lo spot FFT che svanisce nel tempo. La barra della scala è di 60 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: La sincronicità AXON applica algoritmi di visione artificiale per tracciare e stabilizzare campioni in evoluzione dinamica. I metadati generati durante l'esperimento possono essere tracciati lungo la sequenza temporale, consentendo all'utente di associare rapidamente un'immagine ai metadati associati mentre scorre la serie di immagini generate durante l'esperimento. (A-H) Immagini di un campione di nanocatalizzatore (Au/FeO_x) a 800 °C registrate in un periodo di 28 s sia con (A-D) che senza (E-H) la sovrapposizione della mappa di dose. Le aree rosse nella sovrapposizione indicano regioni di elevata esposizione cumulativa alla dose e le aree gialle indicano regioni di esposizione inferiore. L'evidenziazione di un singolo pixel indica la dose cumulativa per quel pixel. Le frecce bianche nei pannelli E-H indicano due particelle che si fondono durante l'esperimento e la freccia arancione indica la traiettoria di una particella d'oro in movimento. (I) La cronologia dell'esperimento generata dal software di analisi per le serie di immagini mostrate in A-H. I punti arancioni nella parte superiore della timeline indicano immagini non elaborate (non corrette digitalmente) e i punti blu indicano immagini con correzione deriva. Le barre verticali arancioni indicano i punti sulla timeline corrispondenti alle immagini mostrate nei pannelli A-H. La barra della scala è 40 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: istantanee TEM di una regione porosa all'interno di un nanocatalizzatore Au/FeOx in vari punti temporali. Il software MVS stabilizza e centra il campione anche durante alte velocità di deriva, come quelle che si verificano durante una rampa di temperatura attraverso l'applicazione di correzioni di stage, beam shift e digitali, come indicato dagli algoritmi di visione artificiale. (A-F) Istantanee TEM di una regione porosa all'interno di un nanocatalizzatore Au/FeOx, registrate in vari punti temporali (G) durante un esperimento di riscaldamento in situ. Il tasso di deriva del ROI viene calcolato e registrato automaticamente durante un esperimento dal software MVS. Come illustrato in (G), al variare del profilo della temperatura (linea blu), la velocità di deriva (linea arancione) aumenta all'aumentare della temperatura e diminuisce man mano che la temperatura viene mantenuta costante. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tipo di microscopio	300 kV FEG TEM	200 kV A FREDDO FEG TEM
Dimensione spot/Condensatore 2 Apertura	3/100 μm	1/100 μm
Intensità di dose	519 e-/A2•s1	499 e-/A2•s1
Perdita di struttura misurata dalla FFT (dose accumulata)	60.270 e-/A2	58.230 e-/A2

Tabella 1: Confronto sommario dei risultati di degradazione della zeolite ottenuti da diversi microscopi.

File supplementare 1: Screenshot dell'interfaccia del software MVS con la scheda di gestione della dose aperta. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: file di database del software MVS dell'esperimento di degradazione della zeolite indotta dal fascio. Questo software di visualizzazione/analisi è disponibile per il download gratuito. Si prega di consultare il file supplementare 9 per le istruzioni per il download e le specifiche del computer. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Filmato della degradazione della zeolite indotta dal fascio. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: file CSV 1 (degradazione della zeolite: dati grezzi [solo correzione meccanica]) Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 5: File CSV (degradazione della zeolite: correzione della deriva [correzione meccanica + digitale]) Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 6: File di database del software MVS nanocatalizzatore esperimento di riscaldamento in situ. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 7: Filmato del nanocatalizzatore a 800 °C con sovrapposizioni di dose. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 8: Filmato del nanocatalizzatore durante una rampa di temperatura con valori di deriva coordinati. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 9: Istruzioni per scaricare il software di analisi gratuito. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

L'interpretazione dei risultati sperimentali TEM è spesso subordinata a molti parametri sperimentali interconnessi, come le impostazioni del microscopio, le condizioni di imaging e, nel caso di esperimenti operando o in situ, cambiamenti nell'ambiente o stimoli ^1,23. L'analisi accurata di grandi set di dati TEM, su cui questi parametri possono essere continuamente modificati, richiede un'attenzione significativa da parte dell'operatore per registrare accuratamente ogni condizione e impostazione per ogni immagine in un giornale di laboratorio o in un'altra fonte di documentazione esterna. Man mano che i set di dati TEM crescono in dimensioni e complessità, la tenuta manuale dei record diventa ingestibile e le informazioni chiave possono essere perse o registrate in modo impreciso. Il software MVS qui descritto consolida i metadati generati durante un esperimento dal microscopio, dal rilevatore/telecamera e da altri sistemi (come i portacampioni in situ) e li allinea con le rispettive immagini.

Oltre al consolidamento dei metadati, il software applica algoritmi di visione artificiale per tracciare e stabilizzare il campo visivo attraverso una combinazione di correzioni spaziali, del fascio e digitali utilizzando le funzioni Drift Correct e Focus Assist . Quando la funzione Drift Correct è attivata, viene generata un'immagine "modello" di correlazione incrociata utilizzando la prima immagine inserita nel software MVS. Il modello viene quindi confrontato con le immagini in arrivo per calcolare la direzione e l'entità della deriva o del movimento del campione. Con queste informazioni, il software MVS applica automaticamente le correzioni necessarie per mantenere le caratteristiche dell'immagine nello stesso posto regolando almeno uno dei tre parametri: posizione del palcoscenico, spostamento del fascio o dell'immagine e correzione dell'immagine digitale. La funzione Focus Assist utilizza una combinazione di algoritmi per assegnare un valore di messa a fuoco, chiamato punteggio di messa a fuoco a ciascuna immagine, e tali punteggi vengono confrontati per determinare l'entità e la direzione della regolazione della sfocatura da applicare per mantenere il campione a fuoco. In modalità di imaging STEM, il software MVS tenta di massimizzare il contrasto attraverso una versione proprietaria della varianza normalizzata per assegnare il punteggio di messa a fuoco. In modalità TEM, una somma radiale di intensità viene calcolata nella FFT e utilizzata per calcolare il punteggio di messa a fuoco. Le limitazioni alla capacità del software MVS di ottimizzare la messa a fuoco si verificano quando non è in grado di calcolare con precisione il punteggio di messa a fuoco corretto per un'immagine. Ciò si verifica in genere quando il microscopio è disallineato o il campione è significativamente fuori fuoco durante la calibrazione, impedendo al software di calcolare correttamente il corretto valore del punteggio di messa a fuoco iniziale. Il software MVS può avere difficoltà a calcolare il punteggio di messa a fuoco per campioni con frange reticolari ben definite, poiché le frange reticolari nella FFT possono "sopraffare" l'algoritmo di punteggio della messa a fuoco; Pertanto, se un campione si sposta fuori fuoco, il punteggio di messa a fuoco potrebbe non riflettere accuratamente il cambiamento di messa a fuoco. Al contrario, lavorare a bassi ingrandimenti o con un campione che ha un segnale FFT basso può anche rendere difficile calcolare un buon punteggio di messa a fuoco. Per mitigare queste difficoltà, il software MVS contiene una serie di algoritmi aggiuntivi che possono essere selezionati dall'utente per calcolare il punteggio di messa a fuoco se le impostazioni predefinite non sono adatte per il campione. Questi devono essere testati e applicati caso per caso per determinare i migliori algoritmi per un determinato esperimento.

I cambiamenti morfologici nella struttura del campione nel tempo vengono contabilizzati utilizzando un fattore di morphing del modello. Questo filtro è sintonizzabile dall'operatore, in modo che gli algoritmi di registrazione tengano conto dei cambiamenti morfologici nel tempo. Inoltre, il software monitora l'immagine continua, le impostazioni del microscopio e le impostazioni della telecamera o del rilevatore per aggiornare automaticamente il modello quando attivato da cambiamenti nella struttura del campione e dopo eventuali modifiche indotte dall'operatore ai parametri del microscopio, della fotocamera o del rilevatore. Come illustrato nella Figura 4, nella Figura 5, nel File supplementare 7 e nel File supplementare 8, il software MVS fornisce una stabilizzazione efficace e immediata, consentendo l'imaging ad alta risoluzione di campioni che si muovono o cambiano dinamicamente. Sebbene il software sia in grado di controllare velocità molto elevate di deriva o movimento del campione, come quelle che si verificano quando si applica una rampa di riscaldamento durante un esperimento in situ , ci sono limitazioni alle correzioni massime dello stadio o agli spostamenti del fascio che il software può controllare se il campione si muove o si sposta molto rapidamente. Questo limite è una funzione della velocità di aggiornamento dell'immagine, delle dimensioni del campo visivo e della velocità di deriva. Per un determinato campo visivo e velocità di aggiornamento dell'immagine, esiste una velocità massima di deriva che può essere corretta e, se i movimenti fisici non riescono a tenere il passo, il processo potrebbe terminare o diventare instabile. Dai modelli di registrazione generati quando vengono applicate funzionalità come Drift Correct , è possibile generare ulteriori metadati calcolati. Ad esempio, la correlazione delle corrispondenze è un record numerico dell'entità del cambiamento tra i modelli in una serie e viene utilizzato per identificare i punti in una linea temporale sperimentale in cui il campione è cambiato. Un alto valore di correlazione corrisponde a un campione che ha subito modifiche alla sua morfologia e un basso valore di correlazione corrisponde a un campione la cui struttura rimane relativamente statica. La correlazione di corrispondenza è particolarmente preziosa per gli studi in situ in quanto può essere tracciata graficamente, consentendo all'utente di individuare rapidamente le immagini nella serie corrispondenti a un cambiamento significativo del campione. È importante, tuttavia, comprendere che valori di correlazione di corrispondenza elevati possono anche corrispondere a cambiamenti nelle condizioni di imaging, come spostare lo stage o modificare l'ingrandimento, se queste azioni vengono eseguite mentre la funzione di correzione della deriva rimane attiva.

Il flusso di lavoro di calibrazione qui presentato utilizza un supporto di calibrazione unico e una routine di calibrazione semi-automatica per calibrare accuratamente il fascio in una varietà di condizioni dell'obiettivo con un intervento minimo dell'operatore. La routine di calibrazione della dose è accessibile tramite il software MVS installato sul TEM. Il software MVS legge automaticamente le impostazioni del microscopio rilevanti per salvare tutte le misurazioni di riferimento per esperimenti successivi. Su alcuni TEM non è possibile leggere le impostazioni di apertura o monocromatore, che devono essere inserite nelle impostazioni del software MVS dall'operatore durante le calibrazioni e durante l'uso. Ci sono promemoria integrati nel software per aiutare a mantenere aggiornate queste impostazioni di input dell'operatore seguendo le istruzioni del programma. Lo sviluppo di un supporto con un collettore di corrente incorporato, piuttosto che affidarsi a uno integrato altrove nella colonna del microscopio, è una scelta progettuale deliberata. Ciò consente al collettore di corrente di essere posizionato sullo stesso piano di un campione, eliminando gli errori nella misurazione della corrente causati dalla deflessione del fascio o le differenze nell'assorbimento degli elettroni da parte delle aperture in diverse posizioni del fascio. Il software MVS segue una routine automatizzata per misurare la corrente del fascio e l'area per qualsiasi combinazione di condizioni dell'obiettivo. Il software può quindi correlare queste calibrazioni misurate con la corrente della telecamera o dello schermo ed estrapolare eventuali cambiamenti di ingrandimento, ecc. all'area del fascio durante l'esperimento. Una volta generati, questi file di calibrazione possono essere utilizzati immediatamente e vengono automaticamente salvati per un uso successivo se il software rileva le stesse impostazioni utilizzate durante una sessione futura. Sebbene la longevità del file di calibrazione vari da microscopio a microscopio, gli autori hanno scoperto che sono in grado di utilizzare gli stessi file di calibrazione per diversi mesi senza osservare modifiche sostanziali ai valori attuali. Esistono routine integrate che monitorano il profilo di emissione delle pistole per aiutare a mantenere queste calibrazioni pertinenti, specialmente sulle pistole a emissione FEG fredda.

La normalizzazione delle misurazioni della dose tra microscopi e il tracciamento automatico dell'esposizione del fascio di un campione sono funzioni critiche del software MVS, in quanto consentono confronti quantitativi delle condizioni di dose tra esperimenti da eseguire su diversi sistemi di microscopi. La degradazione indotta dalla dose di un campione di zeolite (ZSM-5), ottenuta durante esperimenti identici utilizzando microscopi diversi, provoca la completa scomparsa delle macchie FFT dopo una dose massima cumulativa o soglia di elettroni (~60.000 e-/Å 2 quando si applica un'intensità di dose di ~500 e^-/Ų·s) per entrambe le configurazioni. Questi risultati comparativi dimostrano che il software di dose facilita misurazioni quantitative della dose riproducibili. La piccola differenza nella dose cumulativa alla quale si osserva la scomparsa completa del punto FFT per ciascun esperimento è probabilmente il risultato delle diverse tensioni di accelerazione impiegate dai due microscopi, con tensioni di accelerazione più basse che si traducono in più percorsi di danno da radiazioni e tensioni di accelerazione più elevate che tipicamente si traducono in più danni a catena²⁴. I risultati della letteratura per la dose critica di nanoparticelle ZSM-5 vanno da 9.000-14.000 e^-/Ų utilizzando le prime sparizioni spot FFT, piuttosto che la completa scomparsa di tutti i punti FFT^25,26. Nei nostri risultati, la prima scomparsa spot FFT corrisponde a una dose cumulativa di circa 25.000 e^-/Ų. Studi precedenti si basavano su misurazioni di corrente ottenute utilizzando uno schermo al fosforo, che è ben documentato per sottostimare le misurazioni della corrente del fascio rispetto a una tazza di Faraday¹⁵. La dose critica determinata può variare di un fattore due o più, a seconda del picco FFT utilizzato per tracciare la dose. Ciò indica che le frequenze spaziali più elevate degradano per prime e possono determinare valori diversi a seconda dell'accesso alla zona utilizzata durante le misurazioni (i nostri risultati si sono concentrati su punti FFT dell'intero cristallo di zeolite, piuttosto che su specifiche caratteristiche strutturali)^25,26. Queste differenze nelle tecniche e nella calibrazione attuale spiegano la differenza di valori tra i due esperimenti riportati nei nostri risultati e nei precedenti studi di letteratura.

Sebbene le interazioni della dose di elettroni siano un fattore significativo in molti esperimenti TEM, gli studi in situ e specificamente liquid-EM sono particolarmente sensibili ai suoi effetti. La radiolisi dei liquidi da parte del fascio di elettroni si traduce in una cascata di specie chimicamente reattive che possono interagire con il campione, complicando l'analisi. Sia l'intensità di dose o la fluenza utilizzata durante un esperimento liquido-EM che la dose cumulativa possono avere un'influenza sulla concentrazione di specie radicali generate a causa della radiolisi liquida^27,28. Pertanto, la raccolta e la registrazione dei metadati della dose cumulativa e dell'intensità di dose durante un esperimento consente una correlazione diretta tra le immagini e la storia della dose di un campione ed è un modo più accurato per chiarire e controllare l'impatto del fascio di elettroni in questi esperimenti. Sebbene non coperto da questo protocollo, un esempio dell'utilità delle funzionalità di gestione della dose per liquid-EM è mostrato nella Figura 6.

Figura 6: Crescita indotta dal fascio di nanoparticelle d'oro durante un esperimento liquido-EM in situ. (A) Panoramica STEM a basso ingrandimento della crescita delle particelle risultante con una sovrapposizione di colori della mappa della dose cumulativa in tutta la regione. Le aree rosse nella sovrapposizione indicano regioni di esposizione a dose cumulativa elevata e le aree gialle indicano regioni di esposizione inferiore. L'evidenziazione di un singolo pixel con il cursore o il disegno di una casella su un'area utilizzando gli strumenti di disegno inclusi indica la dose cumulativa per quel pixel o area. La barra della scala è di 2 μm. (B,C) Immagini STEM ad ingrandimento più elevato delle aree indicate dalle caselle arancioni (b,c) in A. L'area b, esposta a una dose cumulativa più elevata (10,811 e-/Å 2) contiene particelle più grandi di quelle trovate nell'area c, che è stata esposta a una dose cumulativa inferiore (0,032 e^-/Ų). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'intensità di dose arricchita e i metadati della dose cumulativa semplificano l'analisi dei percorsi di crescita e degradazione dei nanomateriali dose-dipendenti. La figura 6 mostra la riduzione indotta dal fascio di una soluzione di ioni cloruro aurico d'oro (HAuCl₃) in acqua durante esperimenti liquidi-EM. Dalla sovrapposizione della mappa della dose a colori nella Figura 6A, è facile visualizzare che la dose cumulativa di elettroni influenza la dimensione e la forma risultanti delle nanoparticelle 29,30,31,32. La panoramica STEM a basso ingrandimento mostra le regioni esposte a una dose cumulativa alta (rossa) e bassa (gialla). Le particelle nella regione esposta a dosi più elevate sono più grandi di quelle nelle regioni esposte a dosi cumulative più basse. Poiché i metadati della dose sono direttamente incorporati in ogni immagine a livello di pixel, i complessi effetti della dose di elettroni negli esperimenti liquid-EM possono ora essere analizzati sistematicamente in un modo che non era mai stato possibile prima.

In questo protocollo, abbiamo dimostrato che il software MVS fornisce una soluzione completa per calibrare, monitorare e tracciare sia la dose elettronica che la dose totale consegnata a un campione su base pixel per pixel. Questa capacità sblocca un nuovo paradigma per l'imaging di campioni sensibili alla dose e la comprensione delle interazioni del fascio di elettroni. È particolarmente interessante per gli esperimenti liquido-EM, in quanto consentirà un'interrogazione più efficace sul ruolo svolto dalla dose di elettroni e migliorerà la riproducibilità sperimentale. La nostra speranza è che questo nuovo quadro consenta la raccolta accurata delle informazioni sull'intensità di dose e sulla dose accumulata, faciliti la condivisione di questi dati con la comunità per un'interpretazione più accurata dei risultati TEM e promuova la collaborazione scientifica e la condivisione dei dati consentendo la segnalazione e l'analisi dei principali FAIR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARM200F CFEG	JEOL		Transmission Electron Microscope (200 kV)
AXON DOSE Calibration Holder	Protochips, Inc.	AXA-FC-TFS	Dose calibration and management hardware package for ThermoFisher ScientificTEM
AXON DOSE Software:  Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-DOSE-01-1YR	Dose calibration and management software
AXON Studio Software: Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	No Part Number. Available to download at  success.protochips.com	Offline analysis software for AXON datasets.  A free copy of the AXON Studio software is available for down load at:  success.protochips.com
AXON Synchronicity Core	Protochips, Inc.	AXON-CORE	Hardware component of the synchronization software.
AXON Synchronicity Software:  Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR	Synchronization software
Fusion In-Situ Heating E-chip	Protochips, Inc.	E-FHDC-VO-10	Sample Support E-chip with carbon film.  Used with in situ heating system
Fusion Select In Situ Heating System	Protochips, Inc.	FFAD-6200-EXP	In-situ MEMs heating system for ThermoFisher Scientific TEM.
Gold(III) chloride (50% gold basis) hydrate 50790	Sigma Aldrich	27988-77-8	Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.  Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998)
Iron (III) Oxide 310050 (Fe2O3)	Sigma Aldrich	1309-37-1	Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.  Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998)
Titan ChemiSTEM	ThermoFisher Scientific		Transmission Electron Microscope (300 kV)
Zeolite ZSM-5	Zeolyst	CBV 8014	Nanocatalyst sample:  80 SiO2/Al2O3 Mole Ratio