Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Delineación del fenotipo metabólico de las células renales derivadas de la biopsia

641 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/65457

⸱

17 de junio de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método único para realizar perfiles metabólicos de células renales derivadas de biopsias. El enfoque presentado se optimizó en cerdos machos adultos sanos y tiene el potencial de mejorar la evaluación en tiempo real de la viabilidad del aloinjerto renal. Este método también puede ayudar a descubrir nuevas formas biológicas de múltiples enfermedades renales basadas en el metabolismo.

Resumen

El trasplante de riñón es el tratamiento óptimo para la enfermedad renal en etapa terminal; Sin embargo, los riñones trasplantados a menudo se pierden prematuramente, con hasta un 50% de pérdida de injerto a los 10 años después del trasplante. Una de las principales causas de pérdida prematura del injerto es la lesión sufrida por el injerto en el momento del trasplante, conocida como lesión por isquemia-reperfusión (IRI). La función tardía del injerto (DGF), definida como la necesidad de diálisis en la primera semana después del trasplante, es una manifestación de IRI grave que muestra características funcionales e histológicas de lesión renal aguda (IRA). Si bien los mecanismos que impulsan la LRA siguen sin estar claros, la evidencia acumulada sugiere que la función metabólica alterada en el aloinjerto media la LRA y puede ser la razón del DGF. Por lo tanto, descifrar y monitorear los fundamentos metabólicos de la IRI mejorará nuestra capacidad para diagnosticar y prevenir la LRA. Este artículo describe un método único para evaluar la respiración mitocondrial (mediante la tasa de consumo de oxígeno), la glucólisis (tasa de acidificación extracelular) y los niveles intracelulares de ATP en suspensiones de células renales derivadas de biopsia con aguja. La metodología ha sido optimizada en cerdos machos adultos sanos y validada en un modelo porcino de autotrasplante. El enfoque presentado tiene el potencial de mejorar la evaluación en tiempo real de la viabilidad del aloinjerto renal en la clínica. El perfil del metabolismo en biopsias derivadas de pacientes también puede descubrir nueva biología en otras enfermedades renales basadas en el metabolismo.

Introducción

El trasplante renal es el tratamiento óptimo para la enfermedad renal terminal 1,2,3,4; Sin embargo, los riñones trasplantados a menudo se pierden prematuramente, con hasta un 50% de pérdida del injerto a los 10 años después del trasplante5. Los pacientes afectados tienen una mayor morbilidad y mortalidad y suponen una importante carga económica para los sistemas sanitarios6. Una de las principales causas de pérdida prematura del injerto es la lesión sufrida por el injerto en el momento del trasplante, conocida como lesión por isquemia-reperfusión (IRI). La IRI es una lesión inevitable causada por la disminución del flujo sanguíneo, seguida de reperfusión7. La isquemia se caracteriza por la acumulación de succinato tisular, que impulsa el flujo inverso de electrones en la cadena respiratoria mitocondrial, lo que conduce a la producción de superóxido y a la posterior lesión precoz después de la reperfusión8. La IRI en órganos trasplantados aumenta el riesgo de no función primaria, retraso de la función del injerto (DGF), rechazo y resultados inferiores del injerto 8,9. La DGF, definida como la necesidad de diálisis en la primera semana post-trasplante9, es una manifestación de IRI10 grave. Histológicamente, el DGF asociado a IRI se manifiesta como necrosis tubular aguda (NTA) y lesión de la microvasculatura. Funcionalmente, hay una disminución en la tasa de filtración glomerular (TFG) y en la diuresis, características de la lesión renal aguda (IRA) en el aloinjerto11. A pesar de su importancia, en la actualidad no existen tratamientos para la LRA postrasplante asociada a la isquemia-reperfusión. La falta de tratamientos se debe a una comprensión incompleta de los mecanismos de la enfermedad y a la falta de marcadores para identificar a los pacientes con mayor riesgo de disfunción del injerto durante los puntos críticos en los que la lesión puede ser reversible12.

La evidencia acumulada sugiere que el metabolismo energético alterado en el aloinjerto media la LRA y puede ser la base del DGF 13,14,15. Las células renales generan energía a través de dos mecanismos principales: la respiración mitocondrial y la glucólisis16. En la RII, la reperfusión produce disfunción mitocondrial17. En consecuencia, la glucólisis se convierte en la principal fuente de energía 13,18,19,20. El cambio metabólico en la IRI promueve la muerte de las células endoteliales tubulares y microvasculares, lo que conduce a la LRA 21,22,23,24. En un trabajo previo, la NTA se asoció con un aumento de la expresión de enzimas glucolíticas y niveles alterados de proteínas mitocondriales25, de acuerdo con el IRI en el injerto 13,18. Además, en un modelo de autotrasplante de riñón porcino, la isquemia seguida de almacenamiento en frío condujo a una reducción de los niveles de proteínas mitocondriales renales y a un aumento de la excreción de lactato26. En conjunto, estos hallazgos consolidan la importancia clínica de monitorear el fenotipo metabólico de los aloinjertos renales, incluso antes del trasplante, ya que las características metabólicas basales en el aloinjerto pueden ser predictivas de la disfunción del aloinjerto27.

Se han desarrollado modelos de predicción clínica del riesgo a corto plazo de rechazo y pérdida del injerto28,29. Sin embargo, estos modelos carecen de precisión y no consideran las características moleculares del injerto 30,31,32. Estudios recientes tuvieron como objetivo abordar esta necesidad insatisfecha a través de la identificación de patrones moleculares a nivel tisular que se asocian con resultados inferiores del injerto, como la disfunción del injerto y el rechazo 13,14,15,25,33,34. Estos estudios se basan en mediciones moleculares en estado estacionario en el gen 33,34,35, la proteína 25,26 y el nivel de metabolitos13,14, lo que deja una imagen incompleta del fenotipo metabólico del aloinjerto. Esta brecha en el conocimiento se debe en parte a la incapacidad de medir la función metabólica y el estado de energía de las muestras derivadas del riñón en un momento particular en el tiempo. Se justifica el desarrollo de un protocolo estandarizado para determinar el fenotipo metabólico de las células renales derivadas de la biopsia, que potencialmente pueda trasladarse al estudio de muestras de pacientes. Este artículo describe un flujo de trabajo único para evaluar la respiración mitocondrial (mediante la tasa de consumo de oxígeno), la glucólisis (tasa de acidificación extracelular) y los niveles de ATP intracelular en suspensiones de células renales derivadas de biopsias. La metodología se ha optimizado utilizando núcleos de biopsia renal de cerdos machos adultos sanos. Para facilitar la implementación clínica futura, los cilindros de biopsia se obtuvieron utilizando una aguja de 18 G, como en los protocolos clínicos estándar de muestreo de injerto renal36,37. Finalmente, se validó la utilidad de la implementación del protocolo en condiciones experimentales discriminantes en un modelo porcino de autotrasplante.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Este protocolo ha sido aprobado por el Comité de Cuidado Animal del Instituto General de Investigación de Toronto (Protocolo de Uso Animal número: 3652). Los animales fueron atendidos de acuerdo con la Sociedad Nacional de Investigación Médica y Guía para el cuidado de animales de laboratorio, Instituto Nacional de Salud (NIH), Ontario, Canadá. En este estudio se utilizaron cinco cerdos Yorkshire machos de 3 meses de edad, con un peso aproximado de 30 kg cada uno. El protocolo para esta metodología se subdivide en los siguientes pasos: (1) Disociación de núcleos de biopsia de riñón individuales en suspensiones celulares; (2) Perfil metabólico de células renales derivadas de biopsias; y (3) Medición del contenido de ATP en células renales derivadas de biopsias. Todas las muestras de biopsia recolectadas para medir la función metabólica o el contenido de ATP se disociaron dentro de las 3 horas posteriores a la recuperación en una cabina de bioseguridad. El flujo de trabajo de la metodología se muestra en la Figura 1. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Disociación de núcleos de biopsia de riñón individuales en suspensiones celulares

  1. Recolectar tres núcleos de biopsia de tejido de la corteza renal, utilizando el sistema de pistola de aguja coaxial (es decir, una aguja guía externa y una aguja de biopsia interna)38. Para la traslación clínica, se recomienda el uso de una pistola de agujas de biopsia de 18 G39.
    NOTA: Sea coherente con el ángulo de la pistola de aguja de biopsia (~45 °C) y la profundidad de la punción (~20 mm) cuando realice biopsias de la corteza renal.
  2. Coloque cuidadosamente cada núcleo de biopsia en un tubo de 15 mL que contenga 2 mL de RPMI 1640 en hielo.
    1. Fragmente el tejido de la biopsia en trozos pequeños (≤2 mm de largo) con un bisturí en una placa de Petri de 6 cm colocada sobre hielo. Con pinzas curvas ultrafinas de punta fina, coloque los fragmentos de tejido de cada biopsia en un tubo diferente de 1,5 mL que contenga 1 mL de medio de disociación.
      NOTA: El medio de disociación consiste en medio RPMI 1640 que contiene 0,1 mg/mL de DNasa I, 10 mg/mL de colagenasa y 2990 unidades/mL de proteasa neutra de Bacillus polymyxa. Se ha demostrado que la disociación de biopsias de riñón humano utilizando esta composición de medios maximiza la viabilidad celular y preserva la representación de poblaciones celulares raras y frágiles40.
  3. Permitir que la disociación tenga lugar durante 30 min a 37 °C (bloque calefactor) con agitación intermitente (se recomienda vórtice de los tubos cada 5 min).
  4. Después de la disociación, filtre las suspensiones celulares a través de tubos de tapón a presión de filtro celular de 35 μm.
  5. Enjuague el colador con un volumen 1:1 de suero bovino fetal (FBS) 100%.
  6. Agrupe las tres suspensiones de células renales derivadas de la biopsia en un tubo de 15 ml.
  7. Granular las células por centrifugación (400 x g, 5 min, 4 °C) y resuspenderlas en 1 mL de RPMI 1640 que contiene un 10% de FBS. Esta suspensión celular normalmente produce 0.8-1.2 × 106 celdas.

2. Perfil metabólico de células renales derivadas de biopsias

NOTA: El paso de perfil metabólico integra la medición de la glucólisis (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en un analizador de función metabólica, así como los niveles de ATP intracelular utilizando un kit comercial.

  1. Hidratación y calibración de placas utilitarias de cartucho
    1. Un día antes de la extracción de la muestra, agregue 200 μL de ddH2O a cada pocillo de la placa de utilidad del cartucho del analizador de función metabólica.
    2. Incubar la placa multiusos del cartucho en una incubadora sin CO2 a 37 °C durante la noche.
    3. El día de la extracción de la muestra, retire el ddH2O por aspiración con una pipeta Pasteur conectada a un sistema de vacío y añada 200 μL de solución calibrante (pH = 7,4) a cada pocillo de la placa utilitaria del cartucho.
    4. Incube la placa multiusos del cartucho en una incubadora sin CO2 a 37 °C durante la noche.
  2. Recubrimiento celular y preparación de medios de ensayo y compuestos estresores para mediciones de la función metabólica
    1. Agregue 100 μL de RPMI con 10% de FBS en cada pocillo de una placa de ensayo de función metabólica de 96 pocillos.
    2. Separe una pequeña alícuota (por ejemplo, 10 μL) de la suspensión celular (obtenida en el paso 1) en un tubo diferente y tiña las células con un tinte de viabilidad de exclusión azul de tripano.
    3. Utilizando una cámara de recuento, determine la concentración de células vivas (azul de tripano negativo)41 en la suspensión original.
    4. Siembre las células en cada uno de los pocillos de estudio de la placa de ensayo de función metabólica, a una densidad de 1,0 x 105 células vivas/pocillo. Este número de celda se determinó después de la optimización (consulte la sección Resultados representativos).
      NOTA: No siembre células en ninguna de las cuatro esquinas de la placa de ensayo de función metabólica, ya que se utilizan como blancos.
    5. Deje que las células se adhieran incubando la placa de ensayo de función metabólica en una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 durante la noche (~16 h).
    6. Al día siguiente, confirme bajo el microscopio que las células están en una confluencia mínima del 70%-80% (una monocapa celular sana es importante para la determinación óptima de los parámetros de la función metabólica).
    7. Descongele una alícuota (40-50 mL) de medio basal libre de rojo fenol a 37 °C, durante al menos 15 min.
    8. Prepare 35 mM de medio de ensayo añadiendo 2 mM de glutamina (350 μL), 1 mM de piruvato (350 μL) y 5,55 mM de glucosa (385 μL) en 33,915 mL de medio basal predescongelado.
    9. Con una pipeta monocanal o multicanal, retire suavemente el medio RPMI de cada pocillo de estudio de la placa de ensayo de función metabólica. A continuación, agregue 100 μL de medio basal para lavar las células.
    10. Retire suavemente el medio basal y añada 150 μL de medio de ensayo a cada pocillo, incluidos los pocillos sin células.
      NOTA: Dejar los pocillos sin medios de ensayo puede afectar las condiciones de humedad en el ambiente de la placa y dar lugar a mediciones inconsistentes de la función metabólica (Figura suplementaria 1).
    11. Coloque la placa de ensayo de función metabólica en una incubadora libre de CO2 a 37 °C durante ~1 h (paso de aclimatación). Lleve la placa multiusos del cartucho (previamente incubada en solución de calibrante) al gabinete de bioseguridad.
    12. Durante la aclimatación, prepare las siguientes cuatro soluciones de compuestos estresantes, en medios de ensayo: 7 μM de oligomicina (7x, para una concentración final de 1 μM de oligomicina); 2,4 μM de cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) (8x, para una concentración final de 0,3 μM de FCCP); 450 mM 2-desoxiglucosa (2-DG) (9x, para una concentración final de 50 mM 2-DG); 10 μM de rotenona y 10 μM de antimicina A (Rot + AA) (10x, para una concentración final de 1 μM de Rot + 1 μM de AA).
      NOTA: La oligomicina inhibe la actividad de la ATP sintasa y, por lo tanto, interrumpe la cadena de transporte de electrones (ETC). Esto reduce el OCR y la afluencia de protones impulsada por la ATP sintasa a las mitocondrias. Como resultado, la glucólisis se convierte en la principal fuente de producción de ATP42. El FCCP es un fármaco cianuro (carga negativa) que actúa como desacoplador de la fosforilación oxidativa, atrayendo protones (carga positiva) e induciendo una afluencia continua de protones a las mitocondrias, lo que permite el consumo de oxígeno por parte del ETC independientemente de la actividad de la ATP sintasa43. El 2-DG es un análogo estructural sintético de la glucosa en el que el grupo 2-hidroxilo es reemplazado por hidrógeno y actúa como un inhibidor competitivo de la glucólisis44. Rot y AA son fármacos inhibidores de los complejos I y III de la cadena de transporte de electrones, respectivamente45. Los efectos de la inyección de cada fármaco en las diferentes etapas del ensayo de función metabólica se describen en la Figura complementaria 2.
    13. Cargue 25 μL de cada medicamento en el puerto correspondiente en la parte superior de cada pocillo de la placa de utilidad del cartucho, incluidos los pocillos sin celdas. Cargue los medicamentos de acuerdo con la siguiente secuencia: 7x oligomicina (puerto A), 8x FCCP (puerto B), 9x 2-DG (puerto C), 10x Rot + AA (puerto D).
    14. Incube la placa utilitaria del cartucho en la incubadora libre de CO2 hasta que sea necesario para configurar el ensayo de función metabólica.
  3. Determinación del consumo de oxígeno y las tasas glucolíticas en células renales derivadas de biopsias
    1. Verifique que el analizador de función metabólica esté encendido y conectado al software del controlador en una computadora accesoria.
    2. Inicie el software.
    3. Haga clic en el botón Plantilla > en blanco.
    4. En la primera pestaña, haga clic en el botón Estrategia de inyección. Haga clic en cada botón con las letras A, B, C o D que corresponden a los cuatro puertos de inyección. Anote el nombre del medicamento que se inyectará a través de cada puerto: oligomicina (puerto A), FCCP (puerto B), 2-DG (puerto C), Rot + AA (puerto D).
    5. En la segunda pestaña, defina todas las condiciones experimentales. Haga clic en el botón Agregar condición para introducir una nueva condición. El software asignará automáticamente un color a cada condición. Haga clic en el botón Mapa de placas y asigne la condición experimental correspondiente a cada pozo, que se coloreará en consecuencia.
      NOTA: Los cuatro pozos de las esquinas deben permanecer asignados como en blanco (color negro), ya que se utilizan para restar la señal de fondo.
    6. En la tercera pestaña, haga clic en el botón Inyección cuatro veces, de modo que las cuatro inyecciones (puertos A, B, C y D) se agregarán a la secuencia. El ensayo se puede ejecutar utilizando la secuencia de inyección predeterminada (A, B, C, D), el número de mediciones (3 mediciones basales + 3 mediciones después de cada inyección) y el tiempo entre mediciones (3 min).
    7. En la cuarta pestaña, rellene las casillas con la información esencial del estudio y haga clic en Ejecutar. La bandeja se abrirá y el software le pedirá al usuario que monte la placa utilitaria del cartucho. Asegúrese de quitar la tapa verde antes de colocar el plato en la bandeja.
    8. Después de la calibración (~15 min), la bandeja se abrirá de nuevo y el software le pedirá al usuario que retire la placa utilitaria del cartucho y coloque la placa de ensayo de función metabólica en la bandeja. Nuevamente, retire la tapa de la placa antes de montar la placa en la bandeja. La placa multiusos del cartucho se puede desechar.
    9. El ensayo finalizará en aproximadamente 2 h. Después de ese tiempo, guarde el archivo '.asyr' correspondiente. Analice los archivos .asyr computacionalmente para examinar las curvas ECAR y OCR. Exporte los datos al formato preferido.
  4. Medición del contenido de ADN para la normalización de los datos de la función metabólica
    1. Determine la cantidad de ADN en las células de cada pocillo después del ensayo de función metabólica utilizando el kit de ensayo de proliferación celular especificado (consulte la tabla de materiales).
    2. Prepare el volumen requerido de 1x tampón de lisis celular diluyendo 20x tampón de lisis celular en agua desionizada.
    3. Para preparar una curva estándar, prepare muestras de 100 μL de patrón de ADN bacteriófago λ (incluido en el kit de ensayo de proliferación celular) diluidas en serie en tampón de lisis celular a concentraciones en el rango de 0 ng/mL, 12,5 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 400 ng/mL, 800 ng/mL. Cargue cada dilución en un pocillo diferente de una microplaca negra de 96 pocillos.
    4. Prepare 1x solución de unión de colorante diluyendo 400x reactivo de colorante en 1x tampón de lisis celular. Para cada pocillo de curva estándar y pocillo de estudio de ensayo de función metabólica, se requerirán 100 μL.
    5. Distribuya 100 μL de solución de tinte 1x en la primera columna, que ya contiene los estándares. NOTA: El proceso hasta este punto puede iniciarse 30 minutos antes del final de la ejecución del ensayo de función metabólica.
    6. Retire el medio de ensayo de la placa de ensayo de función metabólica con una pipeta monocanal o multicanal.
    7. Con una pipeta multicanal, añada 100 μL de 1x solución de unión al colorante a cada pocillo de estudio de la placa de ensayo de función metabólica. Pipetea hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para lisar las células y transfiere el contenido a la placa negra.
    8. Proteja la microplaca de la luz e incube a 37 °C durante 2-5 min.
    9. Mida la intensidad de fluorescencia de cada muestra utilizando un lector de microplacas de fluorescencia con excitación a 480 nm y detección de emisiones a 520 nm.

3. Medición del contenido de ATP en células renales derivadas de biopsias

NOTA: Mida la cantidad de ATP en las células renales derivadas de la biopsia utilizando el reactivo de detección de ATP especificado y el estándar de ATP recombinante (rATP) (consulte la Tabla de materiales).

  1. Si está congelado, descongele el reactivo de detección de ATP a 4 °C durante la noche.
  2. Después de la adquisición de suspensiones celulares derivadas de la biopsia y el recuento de células, coloque una placa de 1,0 x 104 células vivas/pocillo en cada pocillo de una microplaca blanca de 96 pocillos que contenga 100 μL de medios RPMI 1640 con 10% de FBS. Deje vacía la primera columna de la microplaca, ya que se utilizará para cargar una curva estándar rATP al día siguiente.
  3. Incubar la microplaca a 37 °C en una incubadora con 5% deCO2 durante toda la noche.
  4. Al día siguiente, precaliente el reactivo de detección de ATP a temperatura ambiente.
  5. Genere la curva estándar rATP. Prepare muestras de 100 μL de patrón de rATP diluido en serie en PBS a las siguientes concentraciones: 0 nM, 0,001 nM, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM.
  6. Cargue 50 μL de cada muestra estándar de rATP en la primera columna de la microplaca.
  7. Retire el medio RPMI 1640 que contiene un 10 % de FBS de cada pocillo de estudio de microplaca, utilizando una pipeta monocanal o multicanal.
  8. Lave bien cada estudio con 100 μL de PBS (precalentado en un baño de agua a 37 °C).
  9. Retire el PBS y agregue 50 μL de PBS nuevo en cada pocillo del estudio.
  10. Añada 50 μL de reactivo de detección de ATP tanto en el pocillo estándar como en el pocillo de estudio.
  11. Mezclar, incubar a 37 °C durante 2 min y, posteriormente, a RT durante 10 min.
  12. Lea y registre la luminiscencia en un lector de microplacas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

El flujo de trabajo se probó en células renales derivadas de biopsias de cerdos Yorkshire machos sanos de 3 meses de edad. Se siguió el protocolo para la disociación de tejidos y la siembra celular como se describió anteriormente. Después de dejar que las células se adhirieran durante 16 h, se midieron en tiempo real el OCR y el ECAR en las células de riñón porcino derivadas de la biopsia utilizando un analizador de función metabólica, como marcadores de respiración mitocondrial y glucólisis, respectivamente.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Este artículo describe un método único para evaluar la función metabólica de las células renales obtenidas de biopsias. Se asoció un protocolo para la obtención de suspensiones unicelulares a partir de biopsias renales con aguja gruesa fresca con un análisis de la función metabólica y los niveles intracelulares de ATP. La glucólisis se evalúa midiendo el ECAR y la respiración mitocondrial midiendo el OCR. Se utilizaron biopsias renales porinas para optimizar la metodología.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Ninguno de los coautores tiene intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses que revelar .

Agradecimientos

AK contó con el apoyo de la Fundación de la Red Universitaria de Salud (premios 579067450776, 579072310776 y 579068260776). SC-F contó con el apoyo del programa Kidney Research Scientist Core Education and National Training (KRESCENT) (2019KPPDF637713 y 24KNIA-1291062).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-Desoxi-D-glucosaSigmaD6134Inhibidor competitivo de la glucólisis
5 mL Tubo de ensayo de poliestireno
de fondo redondo, con filtro de células Snap Cap		Falcon352235Tubos de disociación
Antimicina A de  Streptomyces  SP.SigmaA8674Inhibidor del complejo III de la cadena respiratoria
AOF BP ProteasaVitaCyte003-1000Enzima de disociación
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)
fenilhidrazona (FCCP)		SigmaC2920Desacoplador de fosforilación oxidativa
Ensayo CellTiter-Glo 2.0, 100 mlPromegaG9242Medición de ATP
Colagenasa MAVitaCyte001-2030Enzima de disociación
CyQUANT Cell Proliferation Assay, para células en cultivoInvitrogenC7026Medición de ADN intracelular
D-glucosa, anhidro, grado reactivoBioshopGLU501Sustrato metabólico
DNasa IStemcell07469Enzima
de disociaciónSuero Fetal Bovino, Premium,
Origen en EE. UU., Inactivado por calor, 500 mL		Wisent080-450 Suplemento demedios de disociación
L-Glutamina-200 mM (100x) líquido (100 mL)Gibco25030081Sustrato metabólico
Oligomicina ASigma75351Inhibidor de la ATP sintasa
PBS, -/-, 500 mLWisent311-010-CLLavado celular
rATP,  10 mM,  0,5 mLPromegaP1132Medición de ATP intracelular
RotenonaSigmaR8875Inhibidor del complejo I de la cadena respiratoria
RPMI 1640Gibco11875119Medios de disociación
Seahorse Wave Controller Software 2.6AgilentN/AConfiguración de mediciones de la función metabólica
Seahorse Wave Software de escritorio 2.6AgilentN/AAnálisis de datos de función metabólica
Seahorse XF medio base,  sin rojo fenol, 500 mLAgilent103335-100Medición de la función metabólica
Seahorse XFe96 FluxPak  (20 placas, 18 cartuchos
y 500 ml de solución calibrante)		Agilent102416-100Medición de la función metabólica
Analizador de función metabólica Seahorse XFe96Agilent101991-100Medición de la función metabólica
Solución de piruvato de sodio 100 mM (100X), líquido 100 mLGibco11360070Sustrato metabólico
intracelular

Referencias

  1. Tonelli, M., Wiebe, N., Knoll, G. Systematic review: Kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 11 (10), 2093-2109 (2011).
  2. Rana, A., Gruessner, A., Agopian, V. G. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surg. 150 (3), 252-259 (2015).
  3. Wolfe, R. A., Ashby, V. B., Milford, E. L. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N Engl J Med. 341 (23), 1725-1730 (1999).
  4. Chadban, S. J., Ahn, C., Axelrod, D. A. Summary of the Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) clinical practice guideline on the evaluation and management of candidates for kidney transplantation. Transplantation. 104 (4), 708-714 (2020).
  5. Hariharan, S., Israni, A. K., Danovitch, G. Long-term survival after kidney transplantation. N Engl J Med. 385 (8), 729-743 (2021).
  6. Loupy, A., Hill, G. S., Jordan, S. C. The impact of donor-specific anti-HLA antibodies on late kidney allograft failure. Nat Rev Nephrol. 8 (6), 348-357 (2012).
  7. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  8. Chouchani, E. T., Pell, V. R., Gaude, E. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431(2014).
  9. Mallon, D. H., Summers, D. M., Bradley, J. A. Defining delayed graft function after renal transplantation: Simplest is best. Transplantation. 96 (10), 885-889 (2013).
  10. Schröppel, B., Legendre, C. Delayed kidney graft function: From mechanism to translation. Kidney Int. 86 (2), 251-258 (2014).
  11. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr Physiol. 2 (2), 1303(2012).
  12. Siew, E. D., Ware, L. B., Ikizler, T. A. Biological markers of acute kidney injury. J Am Soc Nephrol. 22 (5), 810-820 (2011).
  13. Legouis, D., Ricksten, S. E., Faivre, A. Altered proximal tubular cell glucose metabolism during acute kidney injury is associated with mortality. Nat Metab. 2 (8), 732-743 (2020).
  14. Lerink, L. J. S., de Kok, M. J. C., Mulvey, J. F. Preclinical models versus clinical renal ischemia reperfusion injury: A systematic review based on metabolic signatures. Am J Transplant. 22 (2), 344-370 (2021).
  15. Lindeman, J. H., et al. Results of an explorative clinical evaluation suggest immediate and persistent post-reperfusion metabolic paralysis drives kidney ischemia reperfusion injury. Kidney Int. 98 (6), 1476-1488 (2020).
  16. Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nat Rev Nephrol. 13 (10), 629(2017).
  17. Ma, H., Guo, X., Cui, S. Dephosphorylation of AMP-activated protein kinase exacerbates ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury via mitochondrial dysfunction. Kidney Int. 101 (2), 315-330 (2022).
  18. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Sci Rep. 8, 8539(2018).
  19. Lan, R., Geng, H., Singha, P. K. Mitochondrial pathology and glycolytic shift during proximal tubule atrophy after ischemic AKI. J Am Soc Nephrol. 27 (11), 3356-3367 (2016).
  20. Li, X., Sun, X., Carmeliet, P. Hallmarks of endothelial cell metabolism in health and disease. Cell Metab. 30 (3), 414-433 (2019).
  21. Kim, J., Devalaraja-Narashimha, K., Padanilam, B. J. TIGAR regulates glycolysis in ischemic kidney proximal tubules. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (4), F298-F308 (2015).
  22. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  23. Leung, S. W. S., Shi, Y. The glycolytic process in endothelial cells and its implications. Acta Pharmacol Sin. 43, 251-259 (2021).
  24. Wong, B. W., Marsch, E., Treps, L. Endothelial cell metabolism in health and disease: Impact of hypoxia. EMBO J. 36 (15), 2187-2203 (2017).
  25. Clotet-Freixas, S., McEvoy, C. M., Batruch, I. Extracellular matrix injury of kidney allografts in antibody-mediated rejection: A proteomics study. J Am Soc Nephrol. 31 (11), 2705-2724 (2020).
  26. McEvoy, C. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion in a porcine auto-transplantation model preserves the expression of key mitochondrial proteins: An unbiased proteomics analysis. Mol Cell Proteomics. 20 (1), 100101(2021).
  27. Faitot, F., Besch, C., Battini, S. Impact of real-time metabolomics in liver transplantation: Graft evaluation and donor-recipient matching. J Hepatol. 68 (4), 699-706 (2018).
  28. Rehse, G., Halleck, F., Khadzhynov, D. Validation of the living kidney donor profile index in a European cohort and comparison of long-term outcomes with US results. Nephrol Dial Transplant. 34 (6), 1063-1070 (2019).
  29. Zens, T. J., Danobeitia, J. S., Leverson, G. The impact of kidney donor profile index on delayed graft function and transplant outcome: Gordons-a single-center analysis. Clin Transplant. 32 (3), e13190(2018).
  30. Parker, W. F., Thistlethwaite, J. R., Ross, L. F. Kidney donor profile index does not accurately predict the graft survival of pediatric deceased donor kidneys. Transplantation. 100 (11), 2471-2478 (2016).
  31. Schold, J. D., Kaplan, B. Living kidney donor profile index: Utility and limitations. Am J Transplant. 16 (7), 1951-1952 (2016).
  32. Shantier, M., Li, Y., Ashwin, M. Use of the living kidney donor profile index in the Canadian kidney transplant recipient population: A validation study. Can J Kidney Health Dis. 7, e906976(2020).
  33. Venner, J. M., Hidalgo, L. G., Famulski, K. S. The molecular landscape of antibody-mediated kidney transplant rejection: Evidence for NK involvement through CD16a Fc receptors. Am J Transplant. 15 (5), 1336-1348 (2015).
  34. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: An international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  35. Urbanellis, P., McEvoy, C. M., Škrtić, M. Transcriptome analysis of kidney grafts subjected to normothermic ex vivo perfusion demonstrates an enrichment of mitochondrial metabolism genes. Transplant Direct. 7 (8), e1157(2021).
  36. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Semin Intervent Radiol. 21 (4), 275-281 (2004).
  37. Schwarz, A., Gwinner, W., Hiss, M. Safety and adequacy of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant. 5 (8), 1992-1996 (2005).
  38. Patra, A., Keshava, S. N. Biopsy with side-cutting coaxial needle-knowing the "cutting length" and "throw length.". Indian J Radiol Imaging. 31 (4), 933(2022).
  39. Macginley, R., See, E. J. Renal biopsy. Evidence-Based Nephrology. 1, 2nd ed, 205-213 (2025).
  40. McEvoy, C. M., Murphy, J. M., Zhang, L. Single-cell profiling of healthy human kidney reveals features of sex-based transcriptional programs and tissue-specific immunity. Nat Commun. 13 (1), 35297(2022).
  41. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  42. Devenish, R. J., Prescott, M., Boyle, G. M. The oligomycin axis of mitochondrial ATP synthase: OSCP and the proton channel. J Bioenerg Biomembr. 32 (5), 507-515 (2000).
  43. To, M. S., Aromataris, E. C., Castro, J. Mitochondrial uncoupler FCCP activates proton conductance but does not block store-operated Ca(2+) current in liver cells. Arch Biochem Biophys. 495 (2), 152-158 (2010).
  44. Pajak, B., Siwiak, E., Sołtyka, M. 2-deoxy-d-glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. Int J Mol Sci. 21 (1), 234(2019).
  45. Forkink, M., Basit, F., Teixeira, J. Complex I and complex III inhibition specifically increase cytosolic hydrogen peroxide levels without inducing oxidative stress in HEK293 cells. Redox Biol. 6, 607-618 (2015).
  46. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. J Vis Exp. (8), e2850(2018).
  47. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1493 (2012).
  48. Kaushik, N., Lee, S. J., Choi, T. G. Non-thermal plasma with 2-deoxy-D-glucose synergistically induces cell death by targeting glycolysis in blood cancer cells. Sci Rep. 5 (1), 8726(2015).
  49. Ruas, J. S., Siqueira-Santos, E. S., Amigo, I. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), e150967(2016).
  50. Hao, W., Chang, C. P. B., Tsao, C. C. Oligomycin-induced bioenergetic adaptation in cancer cells with heterogeneous bioenergetic organization. J Biol Chem. 285 (17), 12647-12654 (2010).
  51. Kawamura, M., Parmentier, C., Ray, S. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15 (1), 52140-52154 (2024).
  52. Galichon, P., Lannoy, M., Li, L. Energy depletion by cell proliferation sensitizes the kidney epithelial cells to injury. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (3), F326-F337 (2024).
  53. Hamed, M., Logan, A., Gruszczyk, A. V. Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation models. Br J Surg. 108 (9), 1072-1081 (2021).
  54. Dubin, R. F., Rhee, E. P. Proteomics and metabolomics in kidney disease, including insights into etiology, treatment, and prevention. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (3), 404-411 (2020).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Trasplante renalLesión por isquemia-reperfusiónFunción retardada del injertoLesión renal agudaRespiración mitocondrialTasa de consumo de oxígenoEvaluación de la glucólisisNiveles de ATP intracelular

Este artículo ha sido publicado

Video próximamente

Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.