Summary
Il metodo di manipolazione cervicale presentato può indurre pseudogravidanza nei topi senza la necessità di riproduttori di femmine con maschi vasectomizzati. L'induzione della pseudogravidanza è necessaria per il successo del trasferimento di embrioni non chirurgico e dell'inseminazione artificiale non chirurgica, entrambi presentati.
Abstract
Per mantenere con successo la gravidanza con il trasferimento di embrioni o l'inseminazione artificiale, i topi riceventi di sesso femminile devono essere indotti in uno stato di pseudogravidità. I topi femmina sono tradizionalmente accoppiati durante la notte con maschi vasectomizzati e la mattina seguente viene valutata la presenza di un tappo di copulazione. Per aumentare l'efficienza della produzione di femmine pseudogravide, è stata standardizzata una tecnica di manipolazione cervicale da utilizzare in combinazione con tecniche di trasferimento di embrioni non chirurgici o di inseminazione artificiale nei topi. L'estremità smussata di una piccola asta di plastica viene inserita vaginalmente per contattare la cervice e viene fatta vibrare per 30 secondi dal contatto con un trimmer. La procedura è rapida e non richiede anestesia o analgesia. Questa tecnica aumenta l'affidabilità e la prevedibilità della produzione di femmine pseudogravide ed elimina completamente la necessità di maschi vasectomizzati. Per i topi CD1, l'efficienza dell'induzione della pseudogravidanza mediante manipolazione cervicale era dell'83% per le femmine in estro (N = 76), ma solo il 38% delle femmine in estro era tappato da maschi vasectomizzati (N = 24). L'inseminazione artificiale nei topi CD1 è stata eseguita mediante sincronizzazione dell'estro con gli ormoni, manipolazione cervicale e trasferimento uterino dello sperma. I destinatari di inseminazione artificiale sottoposti a manipolazione cervicale (N = 76) avevano un tasso di gravidanza del 72% e una dimensione media della cucciolata di 8,3 cuccioli. Questo metodo può anche essere utilizzato per produrre femmine pseudogravide per il trasferimento di embrioni non chirurgici. Pertanto, indurre la pseudogravidanza mediante manipolazione cervicale è un'alternativa conveniente ed efficiente all'accoppiamento con un maschio vasectomizzato quando si eseguono tecniche di riproduzione assistita non chirurgica. L'uso della manipolazione cervicale fornisce benefici 3R (sostituzione, riduzione e perfezionamento) per le tecniche di riproduzione assistita, riducendo il numero di animali necessari ed eliminando la necessità di maschi modificati chirurgicamente.
Introduction
Le tecnologie di riproduzione assistita sono utilizzate per la produzione di modelli murini geneticamente modificati, nonché per il recupero di ceppi dalla crioconservazione, la riderivazione di ceppi da uno stato di salute compromesso e la gestione strategica del vivaio, compresa la produzione di coorti di pari età. Tutte le tecniche di riproduzione assistita nei topi richiedono l'uso di riceventi di sesso femminile pseudogravido per lo sviluppo embrionale. Storicamente, le riceventi pseudogravide sono state generate dall'accoppiamento con maschi sterili, che sono chirurgicamente vasectomizzati o geneticamente sterili, e la presenza di un tappo di copulazione viene valutata la mattina seguente1. Recentemente, è stato sviluppato un protocollo per la stimolazione sonica nei topi per il trasferimento chirurgico di embrioni di topo pronucleari o bicellulari2. Abbiamo anche sviluppato un protocollo di manipolazione cervicale (CM) da utilizzare con l'inseminazione artificiale e il trasferimento embrionale non chirurgico di blastocisti. Il razionale per l'uso della procedura è quello di fornire una riduzione di 3R del numero di animali necessari (non richiedono più topi maschi) e un perfezionamento delle tecniche utilizzate (non è più necessaria la procedura di vasectomia chirurgica per i topi maschi). La descrizione di questo protocollo include la tecnica di riproduzione assistita associata per aiutare nell'integrazione della CM nei normali flussi di lavoro. L'obiettivo generale del metodo CM è quello di sostituire l'uso di topi maschi nella generazione di femmine pseudogravide per le tecniche di riproduzione assistita, compresa l'inseminazione artificiale e il trasferimento di embrioni.
Il protocollo CM qui descritto è stato sviluppato per aiutare con l'inseminazione artificiale nei topi. Il protocollo di inseminazione artificiale, come originariamente descritto, ha raggiunto un tasso di gravidanza del 50%, con una dimensione media della cucciolata di 7 cuccioli3. I topi riceventi CD1 erano estrali sincronizzati con una bassa dose di ormoni, tra cui gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG) e gonadotropina corionica umana (hCG), ad un intervallo di 47 ore prima dell'inseminazione. Un vantaggio della sincronizzazione estrale era che permetteva l'uso del protocollo durante il normale orario di lavoro. Le femmine sono state accoppiate con maschi vasectomizzati immediatamente dopo l'inseminazione artificiale e l'accoppiamento è stato confermato dalla presenza di un tappo di copulazione. L'incoerenza nel tasso di accoppiamento con i destinatari è stata segnalata come una difficoltà nella procedura. Pertanto, sono state cercate alternative all'accoppiamento per l'induzione della pseudogravidanza.
Il presente studio presenta una tecnica CM standardizzata per aumentare l'efficienza della produzione di femmine pseudogravide. Per le femmine in estro o proestro, l'estremità smussata di una piccola asta di plastica viene inserita vaginalmente per contattare la cervice e viene vibrata per 30 secondi dal contatto con un trimmer. La procedura viene eseguita su una gabbia con filo metallico. Non è richiesta alcuna anestesia o analgesico. La tecnica CM è conveniente per la produzione di femmine pseudogravide, che possono produrre cucciolate dopo l'inseminazione artificiale non chirurgica senza la necessità di accoppiarsi con maschi vasectomizzati. La CM può anche essere utilizzata per la produzione di femmine pseudogravide come riceventi del trasferimento embrionale. In particolare, la tecnica CM può essere abbinata al trasferimento di embrioni non chirurgico, come descritto qui. I metodi non chirurgici si sono dimostrati efficaci per il trasferimento embrionale di embrioni allo stadio di blastocisti nei topi 4,5 e nei ratti 6,7. Poiché questo metodo non chirurgico è un'alternativa efficace ai metodi chirurgici, è considerato un perfezionamento 3R della tecnica. Sulla base di ricerche precedenti, i livelli di corticosterone fecale, come misura dello stress, indicano che la natura non chirurgica della procedura non aumenta i livelli di stress nei roditori 7,8. Le procedure sono meno impegnative dal punto di vista tecnico rispetto al trasferimento chirurgico di embrioni e sono molto più veloci da eseguire. Quando gli embrioni vengono trasferiti nell'utero, devono essere trasferiti gli embrioni dello stadio corretto per lo sviluppo uterino. Per i topi, le blastocisti vengono trasferite a 2,5 giorni dopo il coito (dpc) pseudogravide riceventi.
Per le due tecniche non chirurgiche qui descritte, i tempi di somministrazione dell'ormone e la tecnica CM differiscono. La tempistica della procedura CM relativa all'estro è importante per il successo, in quanto sostituisce l'accoppiamento naturale per la produzione di riceventi pseudogravide. Eliminando la necessità per i maschi vasectomizzati di indurre pseudogravidanze, questa procedura fornisce benefici 3R riducendo sia il numero di animali necessari che eliminando la necessità di maschi alterati chirurgicamente. La procedura stessa è rapida (30 s) e non richiede anestesia o analgesia. La tecnica aumenta notevolmente l'affidabilità e la prevedibilità della produzione di femmine pseudogravide per la riproduzione assistita.
Protocol
Sono state seguite tutte le linee guida internazionali, nazionali e istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali. Tutte le procedure eseguite negli studi sugli animali erano conformi agli standard etici del ParaTechs Corporation Institutional Animal Care and Use Committee e condotte secondo gli standard dettati dall'Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health, Public Health Service, United States Department of Health and Human Services. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine CD1 (ICR) e femmine di C57Bl/6J di età compresa tra >8 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
1. Procedura di manipolazione cervicale per l'uso con inseminazione artificiale in topi CD1
- Ovulazione sincronizzata di topi femmina il giorno 1 e il giorno 3
- Iniettare topi femmina con 2,5 UI PMSG (vedere Tabella dei materiali) mediante iniezione intraperitoneale (IP) il giorno 1, 0,5 ore prima dell'inizio del ciclo buio del vivaio.
NOTA: Ogni donatore maschio fornirà abbastanza sperma per 10 riceventi femminili. - Iniettare alle femmine 2,5 UI di hCG (vedere Tabella dei materiali) mediante iniezione IP il giorno 3, 1 ora prima dell'inizio del ciclo buio del vivaio.
NOTA: I tempi delle iniezioni, del trasferimento dello sperma e del ciclo di luce l'uno rispetto all'altro sono molto importanti. I tempi specificati per tutte le procedure in questo protocollo si basano su un ciclo luce/buio di 12 ore.
- Iniettare topi femmina con 2,5 UI PMSG (vedere Tabella dei materiali) mediante iniezione intraperitoneale (IP) il giorno 1, 0,5 ore prima dell'inizio del ciclo buio del vivaio.
- Raccolta e capacitazione di spermatozoi freschi il giorno 4
- Preparare una goccia di 500 μL di terreno di pre-incubazione dello sperma (PM, vedere Tabella dei materiali) in una capsula di coltura tissutale da 60 mm sotto olio di paraffina. Preparare un piatto per donatore maschio. Equilibrare per almeno 30 minuti a 37 °C e al 5% di CO2 prima del prelievo dello sperma.
- A 1 h dopo l'inizio del ciclo di luce del vivaio, eutanasia del/i maschio/i secondo le linee guida istituzionali. Ogni maschio fornirà abbastanza sperma per 10 inseminazioni artificiali.
- Sezionare rapidamente gli epididimi della cauda dal topo. Eseguire un'incisione addominale trasversale sopra la vescica usando forbici da dissezione e pinze dentate.
- I cuscinetti di grasso testicolare si trovano su entrambi i lati della vescica. Afferrare uno dei cuscinetti di grasso testicolare con una pinza curva e rimuovere il testicolo e l'epididimo dalla cavità del corpo. Identificare l'epididimo della cauda come una struttura tubolare ovale piatta appena sotto il testicolo.
- Tenere l'epididimo della cauda con una pinza curva e resecare usando piccole forbici angolate. Rimuovere entrambi gli epididimi della cauda e trasferirli in un tessuto assorbente per rimuovere grasso e sangue al microscopio da dissezione.
- Introdurre due epididimi di cauda in ogni goccia di 500 μL di PM equilibrato sotto olio di paraffina a 37 °C. Tagliare il tessuto facendo sei incisioni usando piccole forbici. Se viene utilizzato più di un donatore di sesso maschile, utilizzare un epididimo da ciascun donatore per ogni campione di sperma per ridurre la variazione tra i campioni.
- Ruotare delicatamente il piatto e lasciare che lo sperma esca dal tessuto per 3 minuti, ruotando una volta al minuto. Rimuovere tutti i tessuti.
- Incubare il campione di sperma per 45 minuti a 1 ora a 37 °C e 5% CO2 per capacitare.
- Facoltativo: misurare il numero di spermatozoi e valutare la motilità al microscopio utilizzando un emocitometro. Per il conteggio, diluire lo sperma in PM secondo necessità.
- Conferma della sincronizzazione del ciclo estrale mediante valutazione citologica
- Utilizzando un piccolo tampone pre-inumidito (vedi Tabella dei materiali), raccogliere delicatamente le cellule vaginali dalla parete vaginale facendo rotolare il tampone contro il tessuto, spalmarle in una goccia da 20 μL di acqua sterile su un vetrino da microscopio e asciugare all'aria.
- Al microscopio utilizzando un ingrandimento 100x con illuminazione a campo luminoso, valutare la presenza di cellule epiteliali cornificate. Le femmine in estro o proestro tardivo avranno cellule epiteliali cornificate presenti e dovrebbero essere selezionate per la manipolazione cervicale.
- Facoltativo: registrare il peso delle donne riceventi prima dell'inseminazione.
- Esecuzione della manipolazione cervicale (CM)
- Circa 0,5 ore prima dell'inseminazione, posizionare una femmina ricevente sulla parte superiore di una gabbia con una gratella, consentendo al topo di "afferrare" la superficie della barra della gabbia. Afferrare vicino alla base della coda usando il pollice e l'indice e inclinare la coda verso l'alto mentre si stabilizza l'animale (Figura 1).
NOTA: il mouse rimarrà fermo per tutta la durata della procedura quando la tecnica di manipolazione viene eseguita correttamente. Se il mouse si sposta fuori posizione, riposizionarlo delicatamente e continuare. Se un animale aggressivo viene scelto come destinatario, consentire all'animale di entrare in un tunnel di arricchimento durante la procedura può essere calmante. L'uso del tunnel è facoltativo, ma può aiutare i ricercatori a gestire gli animali fornendo una distrazione durante questa procedura. - Inserire l'estremità smussata di una piccola asta di plastica (vedi Tabella dei materiali) vaginale a contatto con la cervice e vibrare per 30 secondi per contatto con un trimmer (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: posizionare l'asta in posizione prima di avviare il trimmer. Entrambi sono tenuti in una mano durante la procedura. Non è richiesta alcuna anestesia o analgesico.
- Circa 0,5 ore prima dell'inseminazione, posizionare una femmina ricevente sulla parte superiore di una gabbia con una gratella, consentendo al topo di "afferrare" la superficie della barra della gabbia. Afferrare vicino alla base della coda usando il pollice e l'indice e inclinare la coda verso l'alto mentre si stabilizza l'animale (Figura 1).
- Trasferimento non chirurgico di spermatozoi per inseminazione artificiale
- Posizionare il dispositivo di inseminazione (vedere Tabella dei materiali) su una pipetta P200 impostata a 40 μL e rimuovere il coperchio protettivo.
- Prelevare un'aliquota del campione di sperma capacitato dal piatto a 37 °C e al 5% di CO2 e trasferirlo in un piatto di coltura tissutale da 35 mm senza olio a 37 °C. Il campione di sperma verrà utilizzato immediatamente per il trasferimento.
NOTA: Gli spermatozoi perderanno rapidamente motilità al di fuori dell'incubatore di CO2 . Mantenere il campione di sperma capacitato a 37 °C e al 5% di CO2 il più possibile. - Premere lo stantuffo della pipetta fino al primo arresto, abbassare la punta del catetere nel campione di sperma a 37 °C e caricare lentamente lo sperma nel dispositivo di trasferimento. Evitare eventuali grumi. Rimuovere l'olio residuo dall'esterno del dispositivo di inseminazione utilizzando un tessuto assorbente. Mettere da parte la pipetta.
NOTA: Il trasferimento di olio di paraffina al corno uterino deve essere evitato. Rimuovere l'olio residuo dall'esterno del dispositivo di inseminazione utilizzando un tessuto assorbente. - Posizionare la femmina ricevente sulla parte superiore della gabbia della griglia. Tenere il mouse in posizione utilizzando la stessa tecnica di manipolazione utilizzata per il CM; Afferrare vicino alla base della coda usando il pollice e l'indice e inclinare la coda verso l'alto mentre si stabilizza l'animale.
- Posizionare il piccolo speculum (vedi Tabella dei materiali) nella vagina.
- Inserire il catetere del dispositivo di inseminazione nello speculum, attraverso la cervice e nell'utero. Una volta che l'hub del dispositivo entra in contatto con lo speculum, erogare lo sperma premendo lo stantuffo della pipetta fino al primo arresto. Evitare il trasferimento di aria extra nel corno uterino.
NOTA: Se il catetere non è posizionato correttamente, colpirà il tessuto che circonda la cervice, facendolo flettere e infine piegandosi. Se il catetere non scivola attraverso la cervice al primo tentativo, riportare delicatamente il catetere fuori e riprovare fino a quando non ha successo. Può essere necessario riposizionare lo speculum. - Rimuovere il dispositivo e lo speculum. Non è richiesto alcun monitoraggio post-procedura.
- Facoltativo: controllo della gravidanza nei giorni 10-12
- Utilizzare l'aumento di peso per determinare lo stato di gravidanza. L'aumento di peso dipenderà dallo sforzo, ma un aumento di almeno 1-2 g è correlato alla gravidanza.
Figura 1: La tecnica di presa del mouse per la manipolazione cervicale. Il topo poggia su una gabbia metallica ed è stabilizzato alla coda e su entrambi i lati nella parte anteriore delle zampe posteriori. L'estremità smussata di una piccola asta di plastica viene inserita vaginalmente per contattare la cervice e viene vibrata dal contatto con un trimmer. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Procedura di trasferimento embrionale non chirurgica da utilizzare con manipolazione cervicale in topi CD1
- Ovulazione sincronizzata dei topi femmina il giorno 1 e il giorno 3
- Iniettare topi femmina con 2,5 UI PMSG mediante iniezione IP il giorno 1, circa 6 ore dopo l'inizio del ciclo di luce del vivaio.
- Iniettare alle femmine 2,5 UI di hCG mediante iniezione IP il giorno 3, ad un intervallo di 47 ore dopo l'iniezione di PMSG o circa 5 ore dopo l'inizio del ciclo di luce del vivaio.
- Conferma della sincronizzazione del ciclo estrale mediante valutazione citologica
- Il giorno 3, circa 1 h prima della CM, eseguire la citologia sui potenziali riceventi. Utilizzando un piccolo tampone pre-inumidito, raccogliere delicatamente le cellule vaginali dalla parete vaginale facendo rotolare il tampone contro il tessuto, spalmarle in una goccia da 20 μL di acqua sterile su un vetrino da microscopio e asciugare all'aria.
- Al microscopio utilizzando un ingrandimento 100x con illuminazione a campo luminoso, valutare la presenza di cellule epiteliali cornificate. Le femmine in estro o proestro tardivo avranno cellule epiteliali cornificate presenti e dovrebbero essere selezionate per la manipolazione cervicale.
- Facoltativo: registrare il peso delle potenziali riceventi di embrioni femminili.
- Esecuzione del CM
- Il giorno 3, 1 ora prima dell'inizio del ciclo buio del vivaio, posizionare una femmina ricevente sulla parte superiore di una gabbia con una gratella, consentendo all'animale di "afferrare" la superficie della barra della gabbia. Afferrare vicino alla base della coda usando l'indice e il pollice, quindi inclinare la coda verso l'alto mentre si stabilizza l'animale (Figura 1).
NOTA: il mouse rimarrà fermo per tutta la durata della procedura quando la tecnica di manipolazione viene eseguita correttamente. Se il mouse si sposta fuori posizione, riposizionarlo delicatamente e continuare. Se un animale aggressivo viene scelto come destinatario, consentire all'animale di entrare in un tunnel di arricchimento durante la procedura può essere calmante. - Inserire l'estremità smussata di una piccola asta di plastica vaginale per contattare la cervice e farla vibrare per 30 secondi per contatto con un trimmer.
NOTA: posizionare l'asta in posizione prima di avviare il trimmer. Entrambi sono tenuti in una mano durante la procedura. Non è richiesta alcuna anestesia o analgesico.
- Il giorno 3, 1 ora prima dell'inizio del ciclo buio del vivaio, posizionare una femmina ricevente sulla parte superiore di una gabbia con una gratella, consentendo all'animale di "afferrare" la superficie della barra della gabbia. Afferrare vicino alla base della coda usando l'indice e il pollice, quindi inclinare la coda verso l'alto mentre si stabilizza l'animale (Figura 1).
- Trasferimento embrionale non chirurgico il giorno 6
- Introdurre una goccia da 20 μL di terreno M2 (vedere Tabella dei materiali) sul coperchio di una capsula di coltura tissutale.
NOTA: Il coperchio è scelto in quanto ha un bordo più corto e, quindi, è conveniente per accedere agli embrioni nella goccia. Non sovrapporre mai olio di paraffina sulla goccia di M2, poiché l'introduzione di olio nel corno uterino sembra influire negativamente sul trasferimento embrionale. - Al microscopio e utilizzando un'illuminazione riflettente, caricare 10-20 blastocisti nella goccia di mezzo usando una pipetta standard per la manipolazione degli embrioni (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Il numero ottimale di embrioni da trasferire dipende dal ceppo murino e da eventuali manipolazioni subite dagli embrioni. Per embrioni sani non manipolati, il trasferimento di 10-15 embrioni dovrebbe essere sufficiente. Per la riderivazione o gli embrioni geneticamente modificati, il trasferimento di più embrioni è appropriato. - Fissare il dispositivo di trasferimento embrionale non chirurgico (vedere Tabella dei materiali) su una pipetta P2 impostata su 1,8 μL. Rimuovere il coperchio protettivo del catetere.
- Premere lo stantuffo della pipetta fino al primo arresto, abbassare la punta del catetere nel mezzo e tirare lentamente gli embrioni nella punta del catetere del dispositivo. Rimuovere la punta dal mezzo.
NOTA: La visualizzazione degli embrioni a basso ingrandimento consentirà un più facile caricamento degli embrioni nel dispositivo. Se gli embrioni sono sparsi nella goccia, agitare delicatamente il piatto da un lato all'altro per concentrare gli embrioni al centro della goccia o riposizionarli usando una pipetta per la manipolazione degli embrioni. - Impostare il volume della pipetta su 2,0 μL per generare una piccola bolla d'aria sulla punta del catetere. Posare delicatamente la pipetta con gli embrioni caricati vicino alla gabbia del topo.
- Posizionare la femmina ricevente sulla parte superiore della gabbia della griglia. Tenere il mouse in posizione utilizzando la stessa tecnica di manipolazione utilizzata per CM; Afferrare vicino alla base della coda usando l'indice e il pollice, quindi inclinare la coda verso l'alto mentre si stabilizza l'animale.
- Posizionare un piccolo speculum (vedi Tabella dei materiali) nella vagina.
- Inserire il catetere del dispositivo di trasferimento nello speculum, attraverso la cervice e nell'utero. Una volta che l'hub del dispositivo entra in contatto con lo speculum, erogare gli embrioni premendo lo stantuffo della pipetta fino al primo stop. Evitare il trasferimento di aria extra nel corno uterino.
- Senza rilasciare lo stantuffo della pipetta, rimuovere il dispositivo e lo speculum. Non è richiesto alcun monitoraggio post-procedura.
- Introdurre una goccia da 20 μL di terreno M2 (vedere Tabella dei materiali) sul coperchio di una capsula di coltura tissutale.
Representative Results
Poiché la stimolazione cervicale elettrica9 e sonica10 sono state utilizzate per indurre pseudogravidanza nei ratti, questo lavoro presenta una procedura meccanica standardizzata che può essere utilizzata nei topi. La citologia vaginale può aiutare nell'identificazione delle femmine in varie fasi dell'estrale. Per confermare la pseudogravidanza nelle femmine, è stato impiegato questo stesso metodo. In primo luogo, i profili citologici per le femmine sono stati confrontati per topi CD1 e C57Bl/6 durante i cicli estrali, durante la gravidanza e durante la pseudogravidanza indotta dall'accoppiamento o dalla CM. I tamponi vaginali sono stati prelevati dalle femmine e colorati utilizzando un sistema di colorazione Papanicolaou (vedi Tabella dei materiali). Le celle sono state osservate con un ingrandimento di 100x con illuminazione a campo luminoso. Le cellule osservate includevano leucociti, cellule epiteliali nucleate e cellule epiteliali cornificate anucleate. La determinazione dello stadio del ciclo estrale si è basata sulla percentuale relativa di ciascun tipo di cellula11,12. L'estro è caratterizzato dalla predominanza di cellule epiteliali cornificate. Alla fine dell'estro, inizia il metestro e iniziano a comparire i leucociti, mentre le cellule epiteliali cornificate diventano meno evidenti. Il diestro ha una cellularità da moderata a bassa, con leucociti predominanti e cellule epiteliali nucleate che iniziano a comparire. Il proestro si distingue per la perdita di leucociti, un aumento delle cellule epiteliali nucleate e la comparsa di cellule epiteliali cornificate. Dopo il proestro, inizia l'estro e il ciclo continua.
Per sviluppare un profilo basale, la citologia vaginale è stata registrata per almeno due cicli estrali completi per ogni femmina (N = 20 per CD1, N = 20 per C57Bl / 6) prima dell'accoppiamento. Le lunghezze del ciclo e i profili individuali variavano tra i topi; Tuttavia, sono state osservate le tendenze generali attese. La durata media di un ciclo estrale per i topi CD1 e C57Bl/6 è stata di 3,8 giorni, con un intervallo di 3-5 giorni. Il giorno prima dell'accoppiamento naturale, tutte le femmine di topo erano in proestro. Dopo l'accoppiamento, la citologia è stata eseguita di nuovo 1,5 giorni dopo il coito (dpc) fino alla ripresa del ciclo estrale. La Figura 2 mostra il profilo citologico per le femmine CD1 e C57Bl/6 pseudogravide accoppiate con maschi vasectomizzati.
Figura 2: Profilo citologico per topi femmina pseudogravidi. Le percentuali medie di ciascun tipo di cellula per i leucociti, le cellule epiteliali nucleate e le cellule epiteliali cornificate sono mostrate in funzione dei giorni dopo il coito (DPC) per (A) CD1 (N = 20) e (B) C57Bl / 6 (N = 20) topi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
In questo lavoro, una tecnica CM è stata standardizzata per aumentare l'efficienza della produzione di femmine pseudogravide. Per le femmine in estro o proestro, l'estremità smussata di una piccola asta di plastica viene inserita vaginalmente per contattare la cervice e viene vibrata per 30 secondi dal contatto con un trimmer. La procedura viene eseguita su una gabbia con filo metallico. Non è richiesta alcuna anestesia o analgesico. Per determinare l'efficacia della procedura CM, la citologia vaginale è stata confrontata per topi femmina CD1 (N = 20) e C57Bl / 6 (N = 20) dopo l'accoppiamento con maschi vasectomizzati e dopo CM (totale N = 40). Il profilo citologico della pseudogravidanza indotta dalla CM era simile al profilo della pseudogravidanza indotta dall'accoppiamento, come mostrato nella Figura 3.
Figura 3: Profilo citologico per topi femmina pseudogravidi dopo manipolazione cervicale (CM). La percentuale di ciascun tipo di cellula per i leucociti, le cellule epiteliali nucleate e le cellule epiteliali cornificate è mostrata in funzione dei giorni dopo il coito (DPC) o dei giorni dopo la manipolazione cervicale (DPCM). Le percentuali medie del tipo di cellula sono mostrate per i topi CD1 e C57Bl/6 (N = 40) (A) accoppiati con maschi vasectomizzati o (B) dopo CM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per determinare se la tecnica CM è sufficiente per stabilire la gravidanza per la riproduzione assistita, la CM è stata eseguita come parte di un protocollo di inseminazione artificiale non chirurgica (NSAI) nelle femmine CD1. Il protocollo di inseminazione artificiale includeva la sincronizzazione dell'estro delle femmine con una bassa dose degli ormoni PMSG e hCG prima del trasferimento degli spermatozoi. La CM è stata eseguita appena prima del trasferimento dello sperma. Per i topi CD1, l'efficienza dell'induzione della pseudogravidanza utilizzando CM per le femmine in estro (N = 76) con questa tecnica è stata dell'83%. In un esperimento di controllo, solo il 38% delle femmine in estro sono state tappate da maschi vasectomizzati (N = 24). I destinatari dell'inseminazione artificiale che hanno ricevuto la manipolazione cervicale (N = 76) avevano un tasso di gravidanza del 72% e una dimensione media della cucciolata di 8,3 cuccioli. Pertanto, l'induzione della pseudogravidanza da parte della CM è un sostituto conveniente ed efficiente dell'accoppiamento con un maschio vasectomizzato durante l'esecuzione di NSAI. L'uso di CM per preparare i riceventi di CD1 (N = 4) in estro per il trasferimento embrionale non chirurgico di blastocisti CD1 freschi ha portato a un tasso di gravidanza del 100%. Il trasferimento di 9-15 embrioni ha prodotto tre cucciolate sane con un tasso di natalità del 45% e una dimensione media della cucciolata di 6 cuccioli. In confronto, i riceventi CD1 (N = 20) che sono stati accoppiati con maschi vasectomizzati per indurre una pseudogravidanza avevano un tasso di gravidanza dell'80% e un tasso di natalità del 46% dopo il trasferimento di 20 blastocisti B6C3F2 fresche.
I risultati per le tecniche di riproduzione assistita saranno probabilmente specifici per ceppo, poiché variabili come la dose e i tempi di somministrazione dell'ormone per la superovulazione sono risultati essere dipendenti dal ceppo13. Inoltre, fattori come l'età e il peso del ricevente possono influenzare la reazione agli ormoni14. In questo lavoro, quando si esegue la procedura CM per l'inseminazione artificiale, solo le femmine in proestro tardivo o estro sono risultate reattive. In generale, per aumentare il numero di riceventi disponibili in una popolazione, le femmine sono prima sincronizzate con l'estro con una bassa dose di ormoni3. La sincronizzazione dell'estro con 2,5 UI di PMSG e hCG è stata efficace al 78% per le femmine CD1 di 11-14 settimane (N = 27) e al 60% per le femmine C57Bl/6 di 18-32 settimane (N = 22) in questo lavoro. L'efficienza dell'induzione della pseudogravidanza utilizzando la manipolazione cervicale sulle femmine CD1 è stata dell'83% per le femmine in estro (N = 76) e dell'82% (N = 100) per le femmine C57Bl/6 in estro con questa tecnica.
Discussion
Le 3R sono un quadro etico per l'uso animale nella ricerca, come descritto nel 1959 da Russel e Burch in "The Principles of Humane Experimental Technique"15. Le 3R rappresentano la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento nell'uso animale. I protocolli qui evidenziati sono in linea con le 3R. La tecnica di manipolazione cervicale riduce il numero di animali necessari non richiedendo più l'uso di maschi per produrre femmine pseudogravide. La tecnica elimina anche la necessità di eseguire vasectomie sui maschi, fornendo così raffinatezza riducendo il dolore e l'angoscia. Le tecniche di riproduzione assistita qui descritte (inseminazione artificiale e trasferimento di embrioni) non sono chirurgiche e, quindi, entrambe forniscono un perfezionamento delle 3R riducendo il dolore e l'angoscia8causati dalle loro alternative chirurgiche.
L'uso di femmine pseudogravide è necessario per il recupero dei cuccioli durante l'esecuzione della riproduzione assistita nei topi1. La procedura CM è un metodo efficace per produrre femmine pseudogravide, ma la sincronizzazione della fase del ciclo estrale delle femmine riceventi è un primo passo critico nel processo. La sincronizzazione estrale può ridurre drasticamente il numero di femmine necessarie nella colonia per preparare potenziali riceventi e aiuta a produrre femmine pseudogravide a tempo su richiesta. L'uso di una bassa dose di ormoni non sembra causare effetti deleteri sul recupero delle cucciolate vive nei topi CD1. Bisogna fare attenzione con altri ceppi per trovare la combinazione ormonale e concentrazione che produce le femmine riceventi della migliore qualità per gli embrioni o lo sperma trasferito. La sincronizzazione può essere ottenuta utilizzando PMSG e hCG16, ma le dosi che producono femmine superovulate potrebbero non essere appropriate per una gravidanza prolungata17.
Per determinare se una femmina è in estro, è stata eseguita una valutazione citologica in questo lavoro. La fase estrale può essere valutata anche dall'osservazione dell'apertura vaginale11,18. Mentre questo metodo è estremamente utile e può essere utilizzato da solo o come conferma, è più soggettivo dell'uso della citologia. La citologia vaginale senza colorazione è rapida ed efficace per la scelta delle femmine in estro perché le cellule epiteliali cornificate possono essere facilmente identificate. In questo protocollo, la valutazione citologica viene eseguita prima della CM per determinare i potenziali destinatari. È importante eseguire la citologia prima della CM, poiché la procedura tende a frammentare le cellule demosse dalla zona vaginale, rendendo così difficile l'identificazione. La valutazione citologica per pseudogravidanza o gravidanza può essere eseguita a 3,5-11,5 giorni dopo la CM (dpcm) per 3 giorni consecutivi. Il profilo di una femmina ciclica estrale dovrebbe avere almeno 1 giorno con una notevole infiltrazione di cellule epiteliali cornificate. Le donne in gravidanza o gravidanza dovrebbero mostrare un profilo di diestro (per lo più leucociti con numero di cellule potenzialmente basso) per 3 giorni consecutivi.
Attraverso lo sviluppo della tecnica CM, alcuni topi sono risultati più ricettivi alla procedura rispetto ad altri. I topi femmina CD1 sono candidati eccellenti per la loro natura calma e l'eccellente istinto di nutrimento. Questo ceppo è facile da maneggiare e funziona bene durante la CM e le tecniche di riproduzione assistita non chirurgica. I topi C57Bl/6 tendono ad essere più aggressivi e meno nutrienti. Mentre questo protocollo ha effettivamente prodotto femmine C57Bl / 6 pseudogravide usando CM, avevano meno probabilità di essere costantemente permissive della procedura. Questo sembrava correlato in qualche modo con la fase estrale durante la CM. Le femmine in estro o proestro erano più ricettive. L'uso di un tubo di arricchimento per l'animale ha permesso l'accesso alla vagina per la procedura e ha contribuito a calmare la femmina. La procedura stessa non trattiene completamente la femmina, quindi l'animale può allontanarsi in qualsiasi momento. Se ciò accade, l'animale può essere riposizionato e la procedura può quindi essere continuata. I tempi della procedura si fermano se la femmina si allontana e riprende quando la procedura viene ripresa. Fondamentali per il successo della procedura sono la fase del ciclo estrale (proestro tardivo ed estro) e il contatto dell'asta con la cervice. La vibrazione del trimmer fornisce CM standardizzato. Per garantire il contatto con la cervice, viene applicata una leggera pressione all'asta e il posizionamento dell'asta contro la cervice è assicurato con piccoli movimenti avanti e indietro dell'asta.
L'uso della CM ha migliorato il protocollo NSAI, poiché le femmine nella fase corretta del ciclo estrale possono essere scelte prima del trasferimento degli spermatozoi e il protocollo non è più subordinato all'accoppiamento con maschi vasectomizzati. La sincronizzazione del ciclo estrale dell'inseminazione artificiale è temporizzata in modo tale che la maturazione degli ovociti corrisponda al trasferimento degli spermatozoi la mattina del giorno 4. Fondamentale per il successo del protocollo è l'adattamento dei tempi di ovulazione in modo tale che la fecondazione possa avvenire. Bisogna fare attenzione a somministrare hCG 15-17 h prima del previsto trasferimento degli spermatozoi, come suggerito per i tempi utilizzati per la fecondazione in vitro 1. La qualità del campione di sperma influenzerà direttamente l'esito dell'inseminazione artificiale. Lo sperma fresco che è stato capacitato funzionerà meglio. Lo sperma crioconservato di buona qualità può produrre embrioni fecondati in vivo. Tuttavia, occorre prestare attenzione al trasferimento diretto dello sperma scongelato, poiché i crioprotettori residui trasferiti al corno uterino possono inibire l'impianto (osservazioni non pubblicate).
L'uso della CM in combinazione con il trasferimento di embrioni è concettualmente un facile adattamento. La sincronizzazione del ciclo estrale riduce il numero di femmine necessarie per produrre il pool di destinatari. Determinare la fase estrale prima della CM aumenta la probabilità di ottenere riceventi pseudogravidi. Uno svantaggio del metodo è che la citologia dei riceventi al momento del trasferimento dell'embrione è in una fase di flusso. Tutti i tipi di cellule sono presenti se la femmina sta passando dall'estro al profilo di pseudogravidanza e la pseudogravidanza diventa evidente solo se la citologia viene monitorata per diversi giorni. Sulla base del successo (>80%) della transizione dall'estro alla pseudogravidanza per i topi CD1 e C57Bl/6, questo metodo dovrebbe essere adatto per i riceventi di trasferimento embrionale. I risultati preliminari mostrano un buon successo con un limitato trasferimento di embrioni non chirurgico. In generale, l'efficienza del trasferimento embrionale non chirurgico è paragonabile a quella della tecnica chirurgica 4,5 e il trasferimento non chirurgico può sostituire i trasferimenti chirurgici di embrioni allo stadio di blastocisti. Per gli embrioni in fase iniziale, è necessaria la coltura embrionale allo stadio di blastocisti. Tuttavia, se si preferisce un trasferimento chirurgico, è possibile adattare la tecnica CM ai tempi corretti necessari per le riceventi pseudogravide appropriate2. In generale, i riceventi di embrioni sono 1 giorno meno avanzati dell'embrione. Ad esempio, le blastocisti vengono raccolte a 3,5 dpc da donatori e trasferite a riceventi da 2,5 dpc. Pertanto, la CM dovrà essere eseguita in modo tale che la ricevente sia in uno stato di pseudogravidità meno sviluppato rispetto agli embrioni.
In conclusione, la tecnica CM qui descritta mostra un'eccellente promessa per l'integrazione con altre tecniche di riproduzione assistita per topi. Abbiamo fornito protocolli di successo per l'inseminazione artificiale e il trasferimento di embrioni utilizzando tecniche non chirurgiche. In combinazione, la tecnica CM offre vantaggi 3R, tra cui (1) una riduzione del numero di animali eliminando la necessità di maschi vasectomizzati e (2) un perfezionamento delle tecniche sostituendo le tecniche chirurgiche con alternative non chirurgiche.
Disclosures
Barbara Stone e Sarah Srodulski sono entrambe impiegate presso ParaTechs Corporation, Lexington, KY, USA. ParaTechs detiene i diritti esclusivi di licenza per la produzione del dispositivo mNSET per i mouse. ParaTechs Corp ha sviluppato e vende i dispositivi mNSET e mC&I, che possono essere utilizzati rispettivamente per il trasferimento di embrioni non chirurgico e l'inseminazione artificiale non chirurgica.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Ufficio del Direttore, Ufficio dei Programmi di Infrastruttura di Ricerca, del National Institutes of Health con il Premio Numero R43OD020304 e dal National Institute of Mental Health del National Institutes of Health con il Premio Numero R44MH122117. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
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